הכנה וגידול של חרקים אקסניים עם שתילים מתרבית רקמה למחקרי אינטראקציה של מיקרוביוטה של המעי המארח של חיפושית העלים

Summary

כדי להשיג חרק אקסני, משטח הביצה שלו מעוקר, והזחל הבוקע גדל לאחר מכן באמצעות עלים אקסניים. שיטה זו מספקת דרך יעילה להכנת חרקים אקסניים מבלי לתת אנטיביוטיקה או לפתח תזונה מלאכותית, אשר ניתן ליישם גם על חרקים אוכלי עלים אחרים.

Abstract

מעיים של חרקים מיושבים על ידי חיידקים מגוונים שיכולים להשפיע באופן עמוק על התכונות הפיזיולוגיות של הפונדקאי. החדרת זן חיידקי מסוים לחרק אקסני היא שיטה רבת עוצמה לאימות תפקוד המיקרוביאלי של המעיים ולהבהרת המנגנונים העומדים בבסיס האינטראקציות בין חיידקי המעיים לפונדקאי. מתן אנטיביוטיקה או עיקור משטחי ביצים הן שתי שיטות נפוצות להסרת חיידקי מעיים מחרקים. עם זאת, בנוסף להשפעות השליליות הפוטנציאליות של אנטיביוטיקה על חרקים, מחקרים קודמים הצביעו על כך שהאכלת אנטיביוטיקה לא יכולה לחסל את חיידקי המעיים. לפיכך, דיאטות מלאכותיות ללא חיידקים משמשות בדרך כלל לשמירה על חרקים אקסניים, שהוא תהליך מייגע ועתיר עבודה שאינו יכול להידמות באופן מלא למרכיבים תזונתיים במזון טבעי. מתואר כאן פרוטוקול יעיל ופשוט להכנה ותחזוקה של זחלים אקסניים של חיפושית עלים (Plagiodera versicolora). באופן ספציפי, משטחים של ביצי החיפושית עוקרו, ולאחר מכן עלי צפצפה נטולי חיידקים שימשו לגידול זחלים אקסניים. מעמדם האקסני של החרקים אושש עוד יותר באמצעות מבחנים תלויי תרבות ובלתי תלויי תרבות. באופן קולקטיבי, על ידי שילוב של חיטוי ביצים וטיפוח ללא חיידקים, פותחה שיטה יעילה ונוחה להשגת P. versicolora אקסני, המספקת כלי הניתן להעברה בקלות לחרקים אוכלי עלים אחרים.

Introduction

בדומה ליונקים, מערכת העיכול של החרקים היא חלל לעיכול המזון ולספיגתו. רוב החרקים מכילים חיידקים קומנסליים מגוונים שמשגשגים במעיים שלהם וחיים על תזונה המסופקת על ידי פונדקאים¹. לקהילת המעיים יש השפעה עמוקה על תהליכים פיזיולוגיים מרובים בחרקים, כולל עיכול מזון וניקוי רעלים ^2,3,4, תזונה והתפתחות ^5,6,7, הגנה מפני פתוגנים וטפילים 8,9,10,11, תקשורת כימית ^12,13 והתנהגויות^{14 ,15}. באופן מסקרן, מיקרוביוטה מסוימת של המעיים יכולה להיות פתוגנית מבחינה פקולטטיבית או להיות מתומרנת על ידי פלישה לפתוגנים כדי להחמיר את הזיהום, מה שמצביע על כך שחיידקי המעיים עלולים להזיק במקרים מסוימים^ל-16,17,18. חיידקי המעיים יכולים גם לשמש משאב מיקרוביאלי ליישומים ביוטכניים ולהדברת מזיקים. לדוגמה, חיידקים מעכלי ליגנוצלולוז מחרקים פיטופגוסים וקסילופגוסים שימשו לעיכול תאים צמחיים לפיתוח דלקים ביולוגיים¹⁹. פיזורם של סימביונטים מהונדסים במעיים המבטאים מולקולות ביו-אקטיביות הוא טקטיקה חדשנית ומבטיחה לניהול מזיקים חקלאיים וייעוריים ויתושים המשדרים מחלות זיהומיות 19,20,21, שניתן להשתמש בהן גם כדי לשפר את כושרם של חרקים מועילים ²². המחשת האופן שבו חיידק מעיים מתנהג ב-in vivo נחשבת אפוא לעדיפות למנף את תפקודו באופן מלא ולנצל אותו עוד יותר ליישומים שונים.

בעלי חיים יכולים להכיל 1 עד >1000 מינים מיקרוביאליים סימביוטיים במעיים¹. כתוצאה מכך, קשה לאמת במדויק כיצד טקסונים חיידקיים בודדים או הרכבתם מתפקדים בתוך בעל חיים, והאם הפונדקאי או שותפיו המיקרוביאליים מניעים פונקציה מסוימת. לכן, הכנת זחלים אקסניים להשגת חרקים גנוטוביוטים על ידי התיישבות חד-מינית או מרובת מינים נחוצה כדי לחקור את תפקוד החיידקים ואת האינטראקציה עם חרקים²³. כיום, מתן קוקטיילים אנטיביוטיים ועיקור פני השטח של ביצי חרקים הן שיטות נפוצות להסרת חיידקי המעיים 14,24,25,26. עם זאת, דיאטות אנטיביוטיות אינן יכולות לחסל לחלוטין את חיידקי המעיים ולהשפיע לרעה על הפיזיולוגיה של החרקים המארחים^27,28. כתוצאה מכך, השימוש בחרקים שטופלו באנטיביוטיקה עלול לטשטש את היכולות האמיתיות של חלק מחיידקי המעיים. למרבה המזל, עיקור פני השטח של ביצים יכול לשלול את הבעיה הזו^23,29, שאין לה השפעות או זניחות על חרקים ניסיוניים. יתר על כן, תזונה מלאכותית אינה יכולה להידמות באופן מלא למזון חרקים טבעי, ופיתוח תזונה מלאכותית הוא תהליך יקר וצורך עבודה^30,31.

חיפושית עלי הערבה, Plagiodera versicolora (Laicharting) (Coleoptera: Chrysomelidae), היא מזיקה אוכלת עלים נפוצה הניזונה בעיקר מעצים סלעיים, כגון ערבות (Salix) וצפצפה (Populus L.) ^32,33. כאן, חיפושית עלי הערבה שימשה כחרק אוכל עלים מייצג כדי לפתח פרוטוקול להכנה וגידול של חרק ללא חיידקים. ניצלנו את תרבית הרקמה הצמחית כדי להשיג עלי צפצפה נטולי חיידקים כדי לגדל זחלים אקסניים מסוג P. versicolora מביצים מעוקרות. הסטטוס האקסני של זחלי P. versicolora אומת באמצעות מבחנים תלויי תרבות ובלתי תלויי תרבות. פרוטוקול זה יכול לשמור על חרקים אקסניים המחקים טוב יותר את המצב הפראי מאשר גידול חרקים עם תזונה מלאכותית. חשוב מכך, שיטה זו נוחה בעלות נמוכה מאוד, מה שמגדיל את ההיתכנות של השגת חרקים אקסניים למחקרי אינטראקציה עתידיים בין חרקים למעי מיקרוביוטה, במיוחד עבור חרקים שאינם מודלים ללא תזונה מלאכותית מפותחת היטב.

Protocol

1. גידול חרקים שמור על אוכלוסיית P. versicolora בתא גידול במצב של 27 ° C ו 70 ± 5% לחות יחסית עם photoperiod של 16 שעות בהיר / 8 שעות כהה. מניחים אותם בקופסאות פלסטיק מחוררות עם נייר סופג רטוב מרוצף אריחים ומזינים אותם בענפי צפצפה טריים. מרססים מים נקיים על נייר סופג כדי לשמור על הלחות ולהחלי…

Representative Results

שלבי החיים של P. versicolora מוצגים באיור 1. הזכר הבוגר קטן יותר מהנקבה הבוגרת (איור 1A). בשדה, החיפושית מקבצת את ביציה על עלה; כאן, ארבע ביצים נותקו מעלה (איור 1B). מקטעי גזע הצפצפה והשתילים המשמשים לגידול חרקים אקסניים מוצגים באיור 2</str…

Discussion

הכנת זחלים נטולי חיידקים והשגת זחלים גנוטוביוטים על ידי הכנסה מחדש של זני חיידקים ספציפיים הן שיטות רבות עוצמה להבהרת המנגנונים העומדים בבסיס האינטראקציות בין פונדקאי למיקרובים. זחלים שזה עתה בקעו משיגים מיקרוביוטה של המעיים בשתי דרכים עיקריות: העברה אנכית מהאם לצאצאים או רכישה אופקית ?…

Materials

0.22 µm syringe filters	Millipore	SLGP033RB
1 mg/mL NAA stock solution			a. Prepare 0.1 M NaOH solution (dissolve 0.8 g NaOH in 200 mL of distilled water). b. Add 0.2 g NAA in a 250 mL beaker, add little 0.1 M NaOH solution until NAA dissolved, and adjust the final volume to 200 mL with distilled water. c. Filter the solution to remove bacteria with a 0.22 µm syringe filter and a 50 mL sterile syringe, subpackage the solution in 1.5 mL centrifuge tubes and restore at -20 °C.
1.5 mL microcentrifuge tubes	Sangon Biotech	F600620
10x PBS stock solution	Biosharp Life Sciences	BL302A
2 M KOH solution			Dissolve 22.44 g KOH (molecular weight: 56.1) in 200 mL of distilled water and autoclave it for 20 min at 121 °C.
250 mL and 2,000 mL beakers	Shubo	sb16455
50 mL sterile syringes	Jinta	JT0125789
500 mL measuring cylinder	Shubo	sb1601
50x TAE stock solution			a. Dissolve 242 g Tris and 18.612 g EDTA in 700 mL of distilled water. b. Adjust pH to 7.8 with about 57.1 mL of acetic acid. c. Adjust the final volume to 1,000 mL. d. The stock solution was diluted to 1x TAE buffer when used.
75% ethanol	Xingheda trade
α-naphthalene acetic acid (NAA)	Solarbio Life Sciences	86-87-3
Absorbing paper			22.3 cm x 15.3 cm x 9 cm
Acetic acid	Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Agar	Coolaber	9002-18-0
Agarose	Biowest	111860
Autoclave	Panasonic	MLS-3781L-PC
Bead-beating homogenizer	Jing Xin	XM-GTL64
DNA extraction kit	MP Biomedicals	116560200
EDTA	Saiguo Biotech	1340
Filter paper	Jiaojie		70 mm diameter
Gel electrophoresis unit	Bio-rad	164-5052
Gel Signal Green nucleic acid dye	TsingKe	TSJ003
Germ-free poplar seedlings			Shan Xin poplar from Ludong University in Shandong Province
Golden Star Super PCR Master Mix (1.1×)	TsingKe	TSE101
Growth chamber	Ruihua	HP400GS-C
LB agar medium			a. Dissolve 5 g tryptone, 5 g NaCl, 2.5 g yeast extract in 300 mL of distilled water. b. Adjust the final volume to 500 mL, transfer the solution to a 1,000 mL conical flask, and add 7.5 g agar. c. Autoclave the medium for 20 min at 121 °C.
Mini centrifuge	DRAGONLAB	D1008
MS basic medium	Coolaber	PM1121-50L	M0245
MS solid medium for germ-free poplar seedling culture			a. Dissolve 4.43 g MS basic medium powder and 30 g sucrose in 800 mL of distilled water. b. Adjust the pH to about 5.8 with 2 M KOH by a pH meter. c. Adjust the final volume to 1,000 mL, separate into two parts, transfer into two 1,000 mL conical flasks, and add 2.6 g agar per 500 mL. d. Autoclave for 20 min at 121 °C.
NanoDrop 1000 spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific
Paintbrush			1 cm width, used to collect the eggs
Parafilm	Bemis	PM-996
PCR Thermal Cyclers	Eppendorf	6331000076
Petri dishes	Supin		90 mm diameter
pH meter	METTLER TOLEDO	FE20
Pipettes 0.2-2 µL	Gilson	ECS000699
Pipettes 100-1,000 µL	Eppendorf	3120000267
Pipettes 20-200 µL	Eppendorf	3120000259
Pipettes 2-20 µL	Eppendorf	3120000232
Plant tissue culture container	Chembase	ZP21	240 mL
Plastic box			2.35 L
Potassium hydroxide (KOH)	Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Primers for amplifying the bacterial 16S rRNA gene	Sangon Biotech		27-F: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’, 1492R: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’
Sodium chloride (NaCl)	Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Sodium hydroxide (NaOH)	Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Steel balls		0.25 mm	used to grind tissues
Stereomicroscope	OLYMPUS	SZ61
Sucrose	Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Trans2K plus II DNA marker	Transgene Biotech	BM121-01
Tris base	Biosharp Life Sciences	1115
Tryptone	Thermo Fisher Scientific	LP0037
UV transilluminator	Monad Biotech	QuickGel 6100
Vortexer	Scilogex	MX-S
Willow branches			Sha Lake Park, Wuhan, China
Willow leaf beetle			Huazhong Agricultural University, Wuhan, China
Yeast extract	Thermo Fisher Scientific	LP0021