葉甲虫の宿主 - 腸内微生物叢相互作用研究のための組織培養苗木を用いた軸状昆虫の調製および飼育
Summary
軸状昆虫を得るために、その卵表面を滅菌し、孵化した幼虫を引き続き軸葉を用いて飼育する。この方法は、抗生物質を投与したり、人工飼料を開発したりすることなく、他の葉を食べる昆虫にも適用することができる軸索昆虫調製のための効率的な方法を提供する。
Abstract
昆虫の腸は、宿主の生理学的特徴に深く影響を与える可能性のある多様な細菌によってコロニー形成されています。特定の細菌株を軸索昆虫に導入することは、腸内微生物の機能を検証し、腸内微生物と宿主の相互作用の根底にあるメカニズムを解明する強力な方法です。抗生物質を投与するか、卵の表面を殺菌することは、昆虫から腸内細菌を除去するために一般的に使用される2つの方法である。しかし、昆虫に対する抗生物質の潜在的な悪影響に加えて、以前の研究では、抗生物質を摂食することは腸内細菌を排除することができないことが示されていた。したがって、無菌の人工食は、一般的に、自然食品の栄養成分に完全には似ていない退屈で労働集約的なプロセスである軸状昆虫を維持するために使用されています。ここで説明されているのは、葉の甲虫(Plagiodera versicolora)の軸索幼虫を調製および維持するための効率的で簡単なプロトコルである。具体的には、カブトムシの卵の表面を殺菌し、続いて無菌ポプラ葉を用いて軸索幼虫を飼育した。昆虫の軸索状態は、培養依存性および培養非依存性アッセイによってさらに確認された。集合的に、卵の消毒と無菌栽培を組み合わせることによって、効率的で便利な方法が開発され、axenic P. versicoloraが得られ、他の葉を食べる昆虫にとって容易に移動可能なツールが提供された。
Introduction
哺乳類と同様に、昆虫消化管は食物の消化吸収のための空洞である。ほとんどの昆虫は、腸内で繁栄し、宿主1によって供給される栄養で生活する多様な共生細菌を保有しています。腸内共生コミュニティは、食物消化および解毒2,3,4、栄養および発達5,6,7、病原体および寄生虫に対する防御8,9,10,11、化学コミュニケーション12,13および行動14を含む、昆虫の複数の生理学的プロセスに深刻な影響を及ぼしている。,15.興味深いことに、いくつかの腸内微生物叢は通性に病原性であるか、または感染を悪化させるために侵入する病原体によって操作される可能性があり、腸内細菌が場合によっては有害であり得ることを示している16,17,18。腸内細菌は、バイオテクノロジーの応用や害虫管理のための微生物資源としても機能し得る。例えば、植物性貪食性および木狼性昆虫からのリグノセルロース消化細菌は、バイオ燃料を開発するための植物細胞を消化するために使用された19。生理活性分子を発現する操作された腸内共生生物の分散は、感染症19、20、21を媒介する農林業害虫および蚊を管理するための新規かつ有望な戦術であり、有益な昆虫22の適応度を改善するためにも使用することができる。したがって、腸内細菌がインビボでどのように振る舞うかを示すことは、その機能を十分に活用し、さまざまな用途にさらに活用するための優先事項と考えられています。
動物は腸内に1〜>1000種の共生微生物種を保有することができる1。その結果、個々の細菌分類群またはその集合体が動物内でどのように機能するか、および宿主またはその微生物パートナーが特定の機能を駆動するかどうかを正確に検証することは困難である。したがって、単種または多種のコロニー形成によってノットバイオティック昆虫を得るために軸索幼虫を調製することは、細菌機能および昆虫との相互作用を調べるために必要である23。現在、抗生物質カクテルを投与し、昆虫の卵の表面を殺菌することは、腸内細菌を除去するための一般的な方法である14、24、25、26。しかし、抗生物質の食事療法は腸内細菌を完全に排除することができず、宿主の昆虫生理機能に悪影響を及ぼす27,28。その結果、抗生物質処理された昆虫の使用は、いくつかの腸内細菌の真の能力を曖昧にする可能性がある。幸いなことに、卵の表面滅菌はこの問題23,29を否定することができ、実験昆虫にはまったくまたは無視できる影響しか及ぼさない。さらに、人工食は天然の昆虫食に完全には似ておらず、人工食を開発することは費用がかかり、労力のかかるプロセスです30,31。
ヤナギの葉の甲虫、Plagiodera versicolora(ライチャーティング)(鞘翅目:Chrysomelidae)は、主にヤナギ(Salix)やポプラ(Populus L.)などのサリカ科の木を食べる広範な葉を食べる害虫です。32,33。ここで、ヤナギの葉の甲虫は、無菌の昆虫を調製し、飼育するためのプロトコルを開発するための代表的な葉を食べる昆虫として使用された。我々は、植物組織培養を利用して、滅菌卵からP. versicolora axenic幼虫を後方に無菌ポプラの葉を得た。P. versicolora幼虫の軸索状態を、培養依存性および培養非依存性アッセイによって検証した。このプロトコルは、人工食で飼育する昆虫よりも野生の状態をよりよく模倣する軸索昆虫を維持することができます。さらに重要なことに、この方法は非常に低コストで便利であり、将来の昆虫 – 腸内微生物叢相互作用研究、特によく発達した人工飼料のない非モデル昆虫のために軸状昆虫を得る実現可能性を高める。
Protocol
1. 昆虫飼育 P. versicolora集団を成長チャンバー内で27°C、相対湿度70±5%の条件で維持し、明暗16時間/暗8時間の光周期にする。タイル張りの濡れた吸収紙で穴あいたプラスチック製の箱に入れ、新鮮なポプラの枝に餌をやる。吸湿紙にきれいな水をスプレーして水分を維持し、2日ごとに枝を変えます。 蛹化後の産卵のために成虫を隔離する。より多くの卵を得?…
Representative Results
P. versicoloraのライフステージを図1に示す。成人男性は成人女性よりも小さい(図1A)。畑では、カブトムシは卵を葉に集めます。ここでは、4つの卵が葉から剥離した(図1B)。疥瘡昆虫飼育に用いたポプラ茎セグメントと苗木を図2に示す。3齢幼虫の腸を図3に示し、腸の?…
Discussion
無菌幼虫の作製や、特定の細菌株の再導入によるノットバイオティクス幼虫の取得は、宿主-微生物相互作用の根底にあるメカニズムを解明する強力な方法である。新たに孵化した幼虫は、2つの主要な方法で腸内微生物叢を得る:母親から子孫への垂直伝達または兄弟姉妹および環境34からの水平取得。前者は、卵表面35の汚染を介して子孫への親の移送によ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家自然科学財団(31971663)とCASTによる若手エリート科学者スポンサーシッププログラム(2020QNRC001)から資金提供を受けました。
Materials
| 0.22 µm syringe filters | Millipore | SLGP033RB | |
| 1 mg/mL NAA stock solution | a. Prepare 0.1 M NaOH solution (dissolve 0.8 g NaOH in 200 mL of distilled water). b. Add 0.2 g NAA in a 250 mL beaker, add little 0.1 M NaOH solution until NAA dissolved, and adjust the final volume to 200 mL with distilled water. c. Filter the solution to remove bacteria with a 0.22 µm syringe filter and a 50 mL sterile syringe, subpackage the solution in 1.5 mL centrifuge tubes and restore at -20 °C. |
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| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sangon Biotech | F600620 | |
| 10x PBS stock solution | Biosharp Life Sciences | BL302A | |
| 2 M KOH solution | Dissolve 22.44 g KOH (molecular weight: 56.1) in 200 mL of distilled water and autoclave it for 20 min at 121 °C. | ||
| 250 mL and 2,000 mL beakers | Shubo | sb16455 | |
| 50 mL sterile syringes | Jinta | JT0125789 | |
| 500 mL measuring cylinder | Shubo | sb1601 | |
| 50x TAE stock solution | a. Dissolve 242 g Tris and 18.612 g EDTA in 700 mL of distilled water. b. Adjust pH to 7.8 with about 57.1 mL of acetic acid. c. Adjust the final volume to 1,000 mL. d. The stock solution was diluted to 1x TAE buffer when used. |
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| 75% ethanol | Xingheda trade | ||
| α-naphthalene acetic acid (NAA) | Solarbio Life Sciences | 86-87-3 | |
| Absorbing paper | 22.3 cm x 15.3 cm x 9 cm | ||
| Acetic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Agar | Coolaber | 9002-18-0 | |
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Autoclave | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
| Bead-beating homogenizer | Jing Xin | XM-GTL64 | |
| DNA extraction kit | MP Biomedicals | 116560200 | |
| EDTA | Saiguo Biotech | 1340 | |
| Filter paper | Jiaojie | 70 mm diameter | |
| Gel electrophoresis unit | Bio-rad | 164-5052 | |
| Gel Signal Green nucleic acid dye | TsingKe | TSJ003 | |
| Germ-free poplar seedlings | Shan Xin poplar from Ludong University in Shandong Province | ||
| Golden Star Super PCR Master Mix (1.1×) | TsingKe | TSE101 | |
| Growth chamber | Ruihua | HP400GS-C | |
| LB agar medium | a. Dissolve 5 g tryptone, 5 g NaCl, 2.5 g yeast extract in 300 mL of distilled water. b. Adjust the final volume to 500 mL, transfer the solution to a 1,000 mL conical flask, and add 7.5 g agar. c. Autoclave the medium for 20 min at 121 °C. |
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| Mini centrifuge | DRAGONLAB | D1008 | |
| MS basic medium | Coolaber | PM1121-50L | M0245 |
| MS solid medium for germ-free poplar seedling culture | a. Dissolve 4.43 g MS basic medium powder and 30 g sucrose in 800 mL of distilled water. b. Adjust the pH to about 5.8 with 2 M KOH by a pH meter. c. Adjust the final volume to 1,000 mL, separate into two parts, transfer into two 1,000 mL conical flasks, and add 2.6 g agar per 500 mL. d. Autoclave for 20 min at 121 °C. |
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| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Paintbrush | 1 cm width, used to collect the eggs | ||
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PCR Thermal Cyclers | Eppendorf | 6331000076 | |
| Petri dishes | Supin | 90 mm diameter | |
| pH meter | METTLER TOLEDO | FE20 | |
| Pipettes 0.2-2 µL | Gilson | ECS000699 | |
| Pipettes 100-1,000 µL | Eppendorf | 3120000267 | |
| Pipettes 20-200 µL | Eppendorf | 3120000259 | |
| Pipettes 2-20 µL | Eppendorf | 3120000232 | |
| Plant tissue culture container | Chembase | ZP21 | 240 mL |
| Plastic box | 2.35 L | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Primers for amplifying the bacterial 16S rRNA gene | Sangon Biotech | 27-F: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’, 1492R: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’ | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Steel balls | 0.25 mm | used to grind tissues | |
| Stereomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Trans2K plus II DNA marker | Transgene Biotech | BM121-01 | |
| Tris base | Biosharp Life Sciences | 1115 | |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | LP0037 | |
| UV transilluminator | Monad Biotech | QuickGel 6100 | |
| Vortexer | Scilogex | MX-S | |
| Willow branches | Sha Lake Park, Wuhan, China | ||
| Willow leaf beetle | Huazhong Agricultural University, Wuhan, China | ||
| Yeast extract | Thermo Fisher Scientific | LP0021 |
References
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Cite This Article
Ma, M., Liu, P., Yu, J., Han, R., Xu, L. Preparing and Rearing Axenic Insects with Tissue Cultured Seedlings for Host-Gut Microbiota Interaction Studies of the Leaf Beetle. J. Vis. Exp. (176), e63195, doi:10.3791/63195 (2021).