Preparazione e allevamento di insetti axenici con piantine coltivate su tessuto per studi di interazione microbiota ospite-intestino dello scarabeo fogliare

Summary

Per ottenere un insetto ascianico, la sua superficie dell’uovo viene sterilizzata e la larva tratteggiata viene successivamente allevata usando foglie astronche. Questo metodo fornisce un modo efficiente per la preparazione degli insetti axenici senza somministrare antibiotici o sviluppare una dieta artificiale, che può essere applicata anche ad altri insetti mangiatori di foglie.

Abstract

Le viscere degli insetti sono colonizzate da diversi batteri che possono avere un impatto profondo sui tratti fisiologici dell’ospite. L’introduzione di un particolare ceppo batterico in un insetto astronico è un metodo potente per verificare la funzione microbica intestinale e chiarire i meccanismi alla base delle interazioni tra microbi intestinali e ospiti. La somministrazione di antibiotici o la sterilizzazione delle superfici delle uova sono due metodi comunemente usati per rimuovere i batteri intestinali dagli insetti. Tuttavia, oltre ai potenziali effetti avversi degli antibiotici sugli insetti, studi precedenti hanno indicato che l’alimentazione di antibiotici non poteva eliminare i batteri intestinali. Pertanto, le diete artificiali prive di germi sono generalmente impiegate per mantenere gli insetti ascinici, che è un processo noioso e laborioso che non può assomigliare completamente ai componenti nutrizionali nel cibo naturale. Qui è descritto un protocollo efficiente e semplice per preparare e mantenere le larve axeniche di uno scarabeo fogliare (Plagiodera versicolora). In particolare, le superfici delle uova di coleottero sono state sterilizzate, in seguito alle quali sono state utilizzate foglie di pioppo prive di germi per allevare larve astronche. Lo stato astronico degli insetti è stato ulteriormente confermato attraverso saggi dipendenti dalla cultura e indipendenti dalla coltura. Collettivamente, combinando la disinfezione delle uova e la coltivazione priva di germi, è stato sviluppato un metodo efficiente e conveniente per ottenere L. versicolora axenico, fornendo uno strumento facilmente trasferibile per altri insetti mangiatori di foglie.

Introduction

Simile ai mammiferi, il tratto digestivo degli insetti è una cavità per la digestione e l’assorbimento del cibo. La maggior parte degli insetti ospita diversi batteri commensali che prosperano nelle loro viscere e vivono di nutrizione fornita dagli ospiti¹. La comunità commensale intestinale ha un profondo impatto su molteplici processi fisiologici negli insetti, tra cui digestione e disintossicazione degli alimenti ^2,3,4, nutrizione e sviluppo ^5,6,7, difesa contro agenti patogeni e parassiti 8,9,10,11, comunicazione chimica^12,13 e comportamenti ^{14 ,15}. Curiosamente, alcuni microbiota intestinali possono essere facoltativamente patogeni o essere manipolati da agenti patogeni invasori per aggravare l’infezione, indicando che i batteri intestinali possono essere dannosi in alcuni casi 16,17,18. I batteri intestinali possono anche servire come risorsa microbica per applicazioni biotecniche e gestione dei parassiti. Ad esempio, i batteri che digeriscono la lignocellulosa da insetti fitofagi e xilofagi sono stati utilizzati per digerire le cellule vegetali per lo sviluppo di biocarburanti¹⁹. La dispersione di simbionti intestinali ingegnerizzati che esprimono molecole bioattive è una tattica nuova e promettente per gestire l’agricoltura e i parassiti forestali e le zanzare che trasmettono malattie infettive 19,20,21, che può anche essere utilizzata per migliorare la forma fisica degli insetti benefici ²². Illustrare come si comporta un batterio intestinale in vivo è quindi considerato una priorità per sfruttarne appieno la funzione e sfruttarlo ulteriormente per varie applicazioni.

Gli animali possono ospitare da 1 a >1000 specie microbiche simbiotiche nell’intestino¹. Di conseguenza, è difficile verificare con precisione come i singoli taxa batterici o il loro assemblaggio si comportano all’interno di un animale e se l’ospite o i suoi partner microbici guidano una funzione specifica. Pertanto, preparare le larve astrone per ottenere insetti gnotobiotici mediante colonizzazione mono- o multi-specie è necessario per studiare la funzione batterica e l’interazione con gli insetti²³. Allo stato attuale, la somministrazione di cocktail antibiotici e la sterilizzazione della superficie delle uova di insetti sono metodi comuni per rimuovere i batteri intestinali 14,24,25,26. Tuttavia, le diete antibiotiche non possono eliminare completamente i batteri intestinali e hanno un effetto negativo sulla fisiologia degli insetti ospiti^27,28. Di conseguenza, l’uso di insetti trattati con antibiotici può oscurare le vere capacità di alcuni batteri intestinali. Fortunatamente, la sterilizzazione superficiale delle uova può negare questo problema ^23,29, che non ha effetti o trascurabili sugli insetti sperimentali. Inoltre, le diete artificiali non possono assomigliare completamente al cibo naturale degli insetti e lo sviluppo di una dieta artificiale è un processo costoso e laborioso^30,31.

Il coleottero delle foglie di salice, Plagiodera versicolora (Laicharting) (Coleoptera: Chrysomelidae), è un diffuso parassita che si nutre principalmente di alberi salicacei, come salici (Salix) e pioppo (Populus L.) ^32,33. Qui, lo scarabeo delle foglie di salice è stato usato come insetto rappresentativo mangiatore di foglie per sviluppare un protocollo per preparare e allevare un insetto privo di germi. Abbiamo sfruttato la coltura di tessuti vegetali per ottenere foglie di pioppo prive di germi per allevare larve axeniche di P. versicolora da uova sterilizzate. Lo stato astronico delle larve di P. versicolora è stato verificato tramite saggi dipendenti dalla cultura e indipendenti dalla cultura. Questo protocollo può mantenere gli insetti ascinici che imitano meglio la condizione selvaggia rispetto all’allevamento di insetti con una dieta artificiale. Ancora più importante, questo metodo è conveniente a un costo molto basso, il che aumenta la fattibilità di ottenere insetti axenici per futuri studi di interazione microbiota insetto-intestino, specialmente per insetti non modello senza diete artificiali ben sviluppate.

Protocol

1. Allevamento di insetti Mantenere la popolazione di P. versicolora in una camera di crescita a 27 °C e 70 ± 5% di umidità relativa con un fotoperiodo di 16 ore di luce/8 ore di buio. Mettili in scatole di plastica perforate con carta assorbente bagnata piastrellata e dai loro da mangiare rami di pioppo freschi. Spruzzare acqua pulita sulla carta assorbente per mantenere l’umidità e cambiare i rami ogni due giorni. Isolare gli adulti per l’ovodeposizione dopo la pupa. Da…

Representative Results

Le fasi di vita di P. versicolora sono mostrate nella Figura 1. Il maschio adulto è più piccolo della femmina adulta (Figura 1A). Nel campo, lo scarafaggio raggruppa le sue uova su una foglia; qui, quattro uova sono state staccate da una foglia (Figura 1B). I segmenti e le piantine di stelo di pioppo utilizzati per l’allevamento di insetti axenici sono mostrati nella Figura 2. L’intestino di …

Discussion

La preparazione di larve prive di germi e l’ottenimento di larve gnotobiotiche reintroducendo specifici ceppi batterici sono metodi potenti per chiarire i meccanismi alla base delle interazioni ospite-microbo. Le larve appena nate ottengono il microbiota intestinale in due modi principali: trasmissione verticale dalla madre alla prole o acquisizione orizzontale dai fratelli e dall’ambiente³⁴. Il primo può essere soddisfatto dal trasferimento dei genitori alla prole attraverso la contaminazione de…

Materials

0.22 µm syringe filters	Millipore	SLGP033RB
1 mg/mL NAA stock solution			a. Prepare 0.1 M NaOH solution (dissolve 0.8 g NaOH in 200 mL of distilled water). b. Add 0.2 g NAA in a 250 mL beaker, add little 0.1 M NaOH solution until NAA dissolved, and adjust the final volume to 200 mL with distilled water. c. Filter the solution to remove bacteria with a 0.22 µm syringe filter and a 50 mL sterile syringe, subpackage the solution in 1.5 mL centrifuge tubes and restore at -20 °C.
1.5 mL microcentrifuge tubes	Sangon Biotech	F600620
10x PBS stock solution	Biosharp Life Sciences	BL302A
2 M KOH solution			Dissolve 22.44 g KOH (molecular weight: 56.1) in 200 mL of distilled water and autoclave it for 20 min at 121 °C.
250 mL and 2,000 mL beakers	Shubo	sb16455
50 mL sterile syringes	Jinta	JT0125789
500 mL measuring cylinder	Shubo	sb1601
50x TAE stock solution			a. Dissolve 242 g Tris and 18.612 g EDTA in 700 mL of distilled water. b. Adjust pH to 7.8 with about 57.1 mL of acetic acid. c. Adjust the final volume to 1,000 mL. d. The stock solution was diluted to 1x TAE buffer when used.
75% ethanol	Xingheda trade
α-naphthalene acetic acid (NAA)	Solarbio Life Sciences	86-87-3
Absorbing paper			22.3 cm x 15.3 cm x 9 cm
Acetic acid	Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Agar	Coolaber	9002-18-0
Agarose	Biowest	111860
Autoclave	Panasonic	MLS-3781L-PC
Bead-beating homogenizer	Jing Xin	XM-GTL64
DNA extraction kit	MP Biomedicals	116560200
EDTA	Saiguo Biotech	1340
Filter paper	Jiaojie		70 mm diameter
Gel electrophoresis unit	Bio-rad	164-5052
Gel Signal Green nucleic acid dye	TsingKe	TSJ003
Germ-free poplar seedlings			Shan Xin poplar from Ludong University in Shandong Province
Golden Star Super PCR Master Mix (1.1×)	TsingKe	TSE101
Growth chamber	Ruihua	HP400GS-C
LB agar medium			a. Dissolve 5 g tryptone, 5 g NaCl, 2.5 g yeast extract in 300 mL of distilled water. b. Adjust the final volume to 500 mL, transfer the solution to a 1,000 mL conical flask, and add 7.5 g agar. c. Autoclave the medium for 20 min at 121 °C.
Mini centrifuge	DRAGONLAB	D1008
MS basic medium	Coolaber	PM1121-50L	M0245
MS solid medium for germ-free poplar seedling culture			a. Dissolve 4.43 g MS basic medium powder and 30 g sucrose in 800 mL of distilled water. b. Adjust the pH to about 5.8 with 2 M KOH by a pH meter. c. Adjust the final volume to 1,000 mL, separate into two parts, transfer into two 1,000 mL conical flasks, and add 2.6 g agar per 500 mL. d. Autoclave for 20 min at 121 °C.
NanoDrop 1000 spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific
Paintbrush			1 cm width, used to collect the eggs
Parafilm	Bemis	PM-996
PCR Thermal Cyclers	Eppendorf	6331000076
Petri dishes	Supin		90 mm diameter
pH meter	METTLER TOLEDO	FE20
Pipettes 0.2-2 µL	Gilson	ECS000699
Pipettes 100-1,000 µL	Eppendorf	3120000267
Pipettes 20-200 µL	Eppendorf	3120000259
Pipettes 2-20 µL	Eppendorf	3120000232
Plant tissue culture container	Chembase	ZP21	240 mL
Plastic box			2.35 L
Potassium hydroxide (KOH)	Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Primers for amplifying the bacterial 16S rRNA gene	Sangon Biotech		27-F: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’, 1492R: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’
Sodium chloride (NaCl)	Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Sodium hydroxide (NaOH)	Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Steel balls		0.25 mm	used to grind tissues
Stereomicroscope	OLYMPUS	SZ61
Sucrose	Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Trans2K plus II DNA marker	Transgene Biotech	BM121-01
Tris base	Biosharp Life Sciences	1115
Tryptone	Thermo Fisher Scientific	LP0037
UV transilluminator	Monad Biotech	QuickGel 6100
Vortexer	Scilogex	MX-S
Willow branches			Sha Lake Park, Wuhan, China
Willow leaf beetle			Huazhong Agricultural University, Wuhan, China
Yeast extract	Thermo Fisher Scientific	LP0021