Forberede og oppdrette akseniske insekter med vevskulturerte frøplanter for host-gut mikrobiota interaksjonsstudier av bladbille
Summary
For å oppnå et aksenisk insekt steriliseres eggoverflaten, og den klekkede larven blir deretter oppdrettet ved hjelp av akseniske blader. Denne metoden gir en effektiv måte for aksenisk insektforberedelse uten å administrere antibiotika eller utvikle et kunstig kosthold, som også kan brukes på andre bladspisende insekter.
Abstract
Insekt guts er kolonisert av ulike bakterier som kan dypt påvirke vertens fysiologiske egenskaper. Å introdusere en bestemt bakteriestamme i et aksenisk insekt er en kraftig metode for å verifisere tarmmikrobiell funksjon og belyse mekanismene som ligger til grunn for tarmmikrobevertinteraksjoner. Administrering av antibiotika eller sterilisering av eggoverflater er to ofte brukte metoder for å fjerne tarmbakterier fra insekter. Men i tillegg til de potensielle bivirkningene av antibiotika på insekter, indikerte tidligere studier at fôring av antibiotika ikke kunne eliminere tarmbakterier. Dermed brukes bakteriefrie kunstige dietter generelt for å opprettholde akseniske insekter, som er en kjedelig og arbeidsintensiv prosess som ikke fullt ut kan ligne ernæringsmessige komponenter i naturlig mat. Beskrevet her er en effektiv og enkel protokoll for å forberede og vedlikeholde akseniske larver av en bladbille (Plagiodera versicolora). Spesielt ble overflater av billeeggene sterilisert, hvorpå bakteriefrie poppelblader ble brukt til å bake akseniske larver. Insektenes axeniske status ble ytterligere bekreftet via kulturavhengige og kulturuavhengige analyser. Samlet, ved å kombinere eggdesinfeksjon og bakteriefri dyrking, ble det utviklet en effektiv og praktisk metode for å oppnå aksenisk P. versicolora, noe som gir et lett overførbart verktøy for andre bladspisende insekter.
Introduction
I likhet med pattedyr er insekt fordøyelseskanalen et hulrom for mat fordøyelse og absorpsjon. De fleste insekter har forskjellige kommensale bakterier som trives i tarmene og lever på ernæring levert av vertene1. Tarmkommunikasjonssamfunnet har en dyp innvirkning på flere fysiologiske prosesser i insekter, inkludert mat fordøyelse og avgiftning 2,3,4, ernæring og utvikling 5,6,7, forsvar mot patogener og parasitter 8,9,10,11, kjemisk kommunikasjon 12,13 og atferd14 ,15. Interessant nok kan noe tarmmikrobiota være fakultetsmessig patogen eller manipuleres ved å invadere patogener for å forverre infeksjon, noe som indikerer at tarmbakterier i noen tilfeller kan være skadelige 16,17,18. Tarmbakterier kan også fungere som en mikrobiell ressurs for biotekniske anvendelser og skadedyrshåndtering. For eksempel ble lignocellulose-fordøyende bakterier fra fytofagøse og xylophagous insekter brukt til å fordøye planteceller for å utvikle biodrivstoff19. Spredningen av konstruerte tarmsympymnter som uttrykker bioaktive molekyler er en ny og lovende taktikk for å håndtere landbruks- og skogbruk og mygg som overfører smittsomme sykdommer 19,20,21, som også kan brukes til å forbedre kondisjonen til gunstige insekter22. Å illustrere hvordan en tarmbakterie oppfører seg in vivo anses dermed som en prioritet for å utnytte funksjonen fullt ut og utnytte den ytterligere for ulike applikasjoner.
Dyr kan huse 1 til >1000 symbiotiske mikrobielle arter i tarmen1. Som et resultat er det vanskelig å nøyaktig verifisere hvordan individuell bakteriell taxa eller deres montering presterer inne i et dyr, og om verten eller dets mikrobielle partnere driver en bestemt funksjon. Derfor er det nødvendig å forberede akseniske larver for å oppnå gnotobiotiske insekter ved mono- eller flerarts kolonisering for å undersøke bakteriell funksjon og interaksjon med insekter23. For tiden er administrering av antibiotikacocktailer og sterilisering av overflaten av insektegg vanlige metoder for å fjerne tarmbakterier 14,24,25,26. Imidlertid kan antibiotika dietter ikke eliminere tarmbakterier helt og ha en negativ effekt på vertsinsektfysiologi27,28. Følgelig kan bruken av antibiotikabehandlede insekter skjule de sanne evnene til noen tarmbakterier. Heldigvis kan overflatesterilisering av egg dette problemet23,29, som ikke har noen eller ubetydelige effekter på eksperimentelle insekter. Videre kan kunstige dietter ikke fullt ut ligne naturlig insektmat, og å utvikle et kunstig kosthold er en kostbar og arbeidskrevende prosess30,31.
Pilebladbille, Plagiodera versicolora (Laicharting) (Coleoptera: Chrysomelidae), er et utbredt bladspisende som hovedsakelig spiser på salisiasetrær, som piler (Salix) og poppel (Populus L.) 32,33. Her ble pilebladbaglen brukt som et representativt bladspisende insekt for å utvikle en protokoll for å forberede og bake et bakteriefritt insekt. Vi utnyttet plantevevskultur for å skaffe bakteriefrie poppelblader til bakre P. versicolora akseniske larver fra steriliserte egg. Den akseniske statusen til P. versicolora larver ble verifisert via kulturavhengige og kulturuavhengige analyser. Denne protokollen kan opprettholde akseniske insekter som bedre etterligner den ville tilstanden enn insektoppdrett med et kunstig kosthold. Enda viktigere er at denne metoden er praktisk til en svært lav pris, noe som øker muligheten for å skaffe akseniske insekter for fremtidige mikrobiotainteraksjonsstudier av insekt, spesielt for ikke-modellinsekter uten velutviklede kunstige dietter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Forberedelse av bakteriefrie larver og oppnå gnotobiotiske larver ved å gjeninnføre spesifikke bakteriestammer er kraftige metoder for å belyse mekanismene som ligger til grunn for vertsmikrobeinteraksjoner. Nyutviklede larver oppnår tarmmikrobiota på to hovedmåter: vertikal overføring fra moren til avkom eller horisontalt oppkjøp fra søsken og miljø34. Førstnevnte kan oppfylles ved foreldreoverføring til avkom gjennom forurensning av eggoverflaten35. Dermed er…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av National Natural Science Foundation of China (31971663) og Young Elite Scientists Sponsorship Program av CAST (2020QNRC001).
Materials
| 0.22 µm syringe filters | Millipore | SLGP033RB | |
| 1 mg/mL NAA stock solution | a. Prepare 0.1 M NaOH solution (dissolve 0.8 g NaOH in 200 mL of distilled water). b. Add 0.2 g NAA in a 250 mL beaker, add little 0.1 M NaOH solution until NAA dissolved, and adjust the final volume to 200 mL with distilled water. c. Filter the solution to remove bacteria with a 0.22 µm syringe filter and a 50 mL sterile syringe, subpackage the solution in 1.5 mL centrifuge tubes and restore at -20 °C. |
||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sangon Biotech | F600620 | |
| 10x PBS stock solution | Biosharp Life Sciences | BL302A | |
| 2 M KOH solution | Dissolve 22.44 g KOH (molecular weight: 56.1) in 200 mL of distilled water and autoclave it for 20 min at 121 °C. | ||
| 250 mL and 2,000 mL beakers | Shubo | sb16455 | |
| 50 mL sterile syringes | Jinta | JT0125789 | |
| 500 mL measuring cylinder | Shubo | sb1601 | |
| 50x TAE stock solution | a. Dissolve 242 g Tris and 18.612 g EDTA in 700 mL of distilled water. b. Adjust pH to 7.8 with about 57.1 mL of acetic acid. c. Adjust the final volume to 1,000 mL. d. The stock solution was diluted to 1x TAE buffer when used. |
||
| 75% ethanol | Xingheda trade | ||
| α-naphthalene acetic acid (NAA) | Solarbio Life Sciences | 86-87-3 | |
| Absorbing paper | 22.3 cm x 15.3 cm x 9 cm | ||
| Acetic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Agar | Coolaber | 9002-18-0 | |
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Autoclave | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
| Bead-beating homogenizer | Jing Xin | XM-GTL64 | |
| DNA extraction kit | MP Biomedicals | 116560200 | |
| EDTA | Saiguo Biotech | 1340 | |
| Filter paper | Jiaojie | 70 mm diameter | |
| Gel electrophoresis unit | Bio-rad | 164-5052 | |
| Gel Signal Green nucleic acid dye | TsingKe | TSJ003 | |
| Germ-free poplar seedlings | Shan Xin poplar from Ludong University in Shandong Province | ||
| Golden Star Super PCR Master Mix (1.1×) | TsingKe | TSE101 | |
| Growth chamber | Ruihua | HP400GS-C | |
| LB agar medium | a. Dissolve 5 g tryptone, 5 g NaCl, 2.5 g yeast extract in 300 mL of distilled water. b. Adjust the final volume to 500 mL, transfer the solution to a 1,000 mL conical flask, and add 7.5 g agar. c. Autoclave the medium for 20 min at 121 °C. |
||
| Mini centrifuge | DRAGONLAB | D1008 | |
| MS basic medium | Coolaber | PM1121-50L | M0245 |
| MS solid medium for germ-free poplar seedling culture | a. Dissolve 4.43 g MS basic medium powder and 30 g sucrose in 800 mL of distilled water. b. Adjust the pH to about 5.8 with 2 M KOH by a pH meter. c. Adjust the final volume to 1,000 mL, separate into two parts, transfer into two 1,000 mL conical flasks, and add 2.6 g agar per 500 mL. d. Autoclave for 20 min at 121 °C. |
||
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Paintbrush | 1 cm width, used to collect the eggs | ||
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PCR Thermal Cyclers | Eppendorf | 6331000076 | |
| Petri dishes | Supin | 90 mm diameter | |
| pH meter | METTLER TOLEDO | FE20 | |
| Pipettes 0.2-2 µL | Gilson | ECS000699 | |
| Pipettes 100-1,000 µL | Eppendorf | 3120000267 | |
| Pipettes 20-200 µL | Eppendorf | 3120000259 | |
| Pipettes 2-20 µL | Eppendorf | 3120000232 | |
| Plant tissue culture container | Chembase | ZP21 | 240 mL |
| Plastic box | 2.35 L | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Primers for amplifying the bacterial 16S rRNA gene | Sangon Biotech | 27-F: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’, 1492R: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’ | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Steel balls | 0.25 mm | used to grind tissues | |
| Stereomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Trans2K plus II DNA marker | Transgene Biotech | BM121-01 | |
| Tris base | Biosharp Life Sciences | 1115 | |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | LP0037 | |
| UV transilluminator | Monad Biotech | QuickGel 6100 | |
| Vortexer | Scilogex | MX-S | |
| Willow branches | Sha Lake Park, Wuhan, China | ||
| Willow leaf beetle | Huazhong Agricultural University, Wuhan, China | ||
| Yeast extract | Thermo Fisher Scientific | LP0021 |
References
- Moran, N. A., Ochman, H., Hammer, T. J. Evolutionary and ecological consequences of gut microbial communities. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 50 (1), 451-475 (2019).
- Warnecke, F., et al. Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite. Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).
- Tokuda, G., et al. Fiber-associated spirochetes are major agents of hemicellulose degradation in the hindgut of wood-feeding higher termites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 11996-12004 (2018).
- Wang, G. H., et al. Changes in microbiome confer multigenerational host resistance after sub-toxic pesticide exposure. Cell Host & Microbe. 27 (2), 213-224 (2020).
- Shin, S. C., et al. Drosophila microbiome modulates host developmental and metabolic homeostasis via insulin signaling. Science. 334 (6056), 670-674 (2011).
- Storelli, G., et al. Lactobacillus plantarum promotes Drosophila systemic growth by modulating hormonal signals through TOR-dependent nutrient sensing. Cell Metabolism. 14 (3), 403-414 (2011).
- Salem, H., et al. Vitamin supplementation by gut symbionts ensures metabolic homeostasis in an insect host. Proceedings. Biological Sciences. 281 (1796), 20141838 (2014).
- Koch, H., Schmid-Hempel, P. Socially transmitted gut microbiota protect bumble bees against an intestinal parasite. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19288-19292 (2011).
- Cirimotich, C. M., et al. Natural microbe-mediated refractoriness to Plasmodium infection in Anopheles gambiae. Science. 332 (6031), 855-858 (2011).
- Kaltenpoth, M., Gottler, W., Herzner, G., Strohm, E. Symbiotic bacteria protect wasp larvae from fungal infestation. Current Biology. 15 (5), 475-479 (2005).
- Yuan, C., Xing, L., Wang, M., Hu, Z., Zou, Z. Microbiota modulates gut immunity and promotes baculovirus infection in Helicoverpa armigera. Insect Science. , (2021).
- Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. Pheromones – Exploitation of gut bacteria in the locust. Nature. 403 (6772), 851 (2000).
- Xu, L. T., Lou, Q. Z., Cheng, C. H., Lu, M., Sun, J. H. Gut-associated bacteria of Dendroctonus valens and their involvement in verbenone production. Microbial Ecology. 70 (4), 1012-1023 (2015).
- Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402-406 (2018).
- Jia, Y., et al. Gut microbiome modulates Drosophila aggression through octopamine signaling. Nature Communications. 12 (1), 2698 (2021).
- Ma, M., et al. Metabolic and immunological effects of gut microbiota in leaf beetles at the local and systemic levels. Integrative Zoology. 16 (3), 313-323 (2021).
- Xu, L., et al. Synergistic action of the gut microbiota in environmental RNA interference in a leaf beetle. Microbiome. 9 (1), 98 (2021).
- Xu, L., et al. Gut microbiota in an invasive bark beetle infected by a pathogenic fungus accelerates beetle mortality. Journal of Pest Science. 92, 343-351 (2019).
- Berasategui, A., Shukla, S., Salem, H., Kaltenpoth, M. Potential applications of insect symbionts in biotechnology. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (4), 1567-1577 (2016).
- Tikhe, C. V., Martin, T. M., Howells, A., Delatte, J., Husseneder, C. Assessment of genetically engineered Trabulsiella odontotermitis as a ‘Trojan Horse’ for paratransgenesis in termites. BMC Microbiology. 16 (1), 202 (2016).
- Wang, S., et al. Fighting malaria with engineered symbiotic bacteria from vector mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12734-12739 (2012).
- Leonard, S. P., et al. Engineered symbionts activate honey bee immunity and limit pathogens. Science. 367 (6477), 573-576 (2020).
- Kietz, C., Pollari, V., Meinander, A. Generating germ-free Drosophila to study gut-microbe interactions: protocol to rear Drosophila under axenic conditions. Current Protocols in Toxicology. 77 (1), 52 (2018).
- Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12974-12979 (2004).
- Correa, M. A., Matusovsky, B., Brackney, D. E., Steven, B. Generation of axenic Aedes aegypti demonstrate live bacteria are not required for mosquito development. Nature Communications. 9 (1), 4464 (2018).
- Romoli, O., Schonbeck, J. C., Hapfelmeier, S., Gendrin, M. Production of germ-free mosquitoes via transient colonisation allows stage-specific investigation of host-microbiota interactions. Nature Communications. 12 (1), 942 (2021).
- Berasategui, A., et al. Gut microbiota of the pine weevil degrades conifer diterpenes and increases insect fitness. Molecular Ecology. 26 (15), 4099-4110 (2017).
- Lin, X. L., Kang, Z. W., Pan, Q. J., Liu, T. X. Evaluation of five antibiotics on larval gut bacterial diversity of Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae). Insect Science. 22 (5), 619-628 (2015).
- Muhammad, A., Habineza, P., Hou, Y., Shi, Z. Preparation of red palm weevil Rhynchophorus Ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) germ-free larvae for host-gut microbes interaction studies. Bio-protocol. 9 (24), 3456 (2019).
- Gelman, D. B., Bell, R. A., Liska, L. J., Hu, J. S. Artificial diets for rearing the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata. Journal of Insect Science. 1, 7 (2001).
- Bengtson, D. A. A comprehensive program for the evaluation of artificial diets. Journal of the World Aquaculture Society. 24 (2), 285-293 (2007).
- Utsumi, S., Ando, Y., Ohgushi, T. Evolution of feeding preference in a leaf beetle: the importance of phenotypic plasticity of a host plant. Ecology Letters. 12 (9), 920-929 (2009).
- Ishihara, M., Ohgushi, T. Reproductive inactivity and prolonged developmental time induced by seasonal decline in host plant quality in the willow leaf beetle Plagiodera versicolora (Coleoptera: Chrysomelidae). Environmental Entomology. 35 (2), 524-530 (2006).
- Bright, M., Bulgheresi, S. A complex journey: transmission of microbial symbionts. Nature Reviews: Microbiology. 8 (3), 218-230 (2010).
- Hassan, B., Siddiqui, J. A., Xu, Y. Vertically transmitted gut bacteria and nutrition influence the immunity and fitness of Bactrocera dorsalis larvae. Frontiers in Microbiology. 11, 596352 (2020).
- Hosokawa, T., et al. Obligate bacterial mutualists evolving from environmental bacteria in natural insect populations. Nature Microbiology. 1, 15011 (2016).
- Habineza, P., et al. The promoting effect of gut microbiota on growth and development of red palm weevil, Rhynchophorus ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) by modulating its nutritional metabolism. Frontiers in Microbiology. 10, 1212 (2019).
- Meilan, R., Ma, C. Poplar (Populus spp.). Methods in Molecular Biology. 344, 143-151 (2006).
- Wani, Z. A., Ashraf, N., Mohiuddin, T., Riyaz-Ul-Hassan, S. Plant-endophyte symbiosis, an ecological perspective. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (7), 2955-2965 (2015).
- Grout, B. W. Meristem-tip culture. Methods in Molecular Biology. 6, 81-91 (1990).
