Summary
昆虫致病真菌作为农业害虫的生物防治剂越来越重要。本研究利用农粮产品成功大规模生产了足够数量的南非 梅塔根菌 和 山 茱萸分离株的弹性感染性繁殖体，用于商业应用。
Abstract
茴香属复合物的昆虫致病真菌作为农业害虫的生物防治剂而变得越来越重要。害虫对化学杀虫剂的抗药性增加，对杀虫剂对人类健康的负面影响的日益关注，以及农药对环境的污染，导致全球努力寻找新的可持续作物保护和害虫控制战略。以前，已经尝试过大规模培养诸如Beauveria bassiana之类的昆虫致病真菌（EPF）物种。然而，只有有限的尝试进行了大规模的培养Metarhizium robertsii和M. pinghaense用于对抗害虫。本研究旨在大规模生产足够数量的南非罗拔沙分枝杆菌和平海氏菌的弹性感染性繁殖体，用于商业应用。三种农产品，片状燕麦，片状大麦和大米，被用作EPF固体发酵基质。采用两种接种方法，分生孢子悬浮液和胚芽孢子的液体真菌培养来接种固体底物。观察到使用分生孢子悬浮液的接种相对不那么有效，因为相对于使用囊孢子接种方法，在固体底物上观察到污染水平增加。发现片状燕麦不是M. robertsii和M. pinghaense的合适生长基质，因为没有从基质中收获干燥的分生孢子。发现片状大麦有利于分生孢子菌的产生，而不是平海分生孢子菌的生产，平均1.83克±1.47克干分生孢子菌，从基质中收获零克分生孢子分生孢子。 发现水稻籽粒有利于分生孢子大规模生产M. pinghaense和M. robertsii分离株，平均从基质中收获平均8.2g±4.38 g和6 g±2 g。
Introduction
昆虫致病真菌（EPF）作为作物保护剂，在重要农业害虫的生物防治中具有重要意义1，2。在土壤中自然发生的昆虫病原体在各种害虫物种的种群中引起动物流行病3。EPF的物种是宿主特异性的，在攻击非靶向物种方面构成的风险相对较小，并且对环境无毒4。EPF具有入侵宿主的独特机制，以及在其直接环境中繁殖和持续存在1。它们主要通过无性孢子攻击宿主，这些孢子附着并穿透宿主角质层，以侵入宿主血细胞并增殖。宿主最终由于血淋巴营养物质的消耗或真菌释放的有毒代谢物引起的毒血症而死亡。死亡后，在理想的环境条件下，真菌出现在宿主尸体5，6的外表面（明显的真菌病）。
人们越来越关注化学残留物对人类健康、环境污染和虫害抗药性的发展的负面影响，导致全球努力减少化学杀虫剂的投入，并寻找替代、新颖和可持续的作物保护和虫害防治战略6，7，8.这为开发用于病虫害综合治理（IPM）计划的微生物杀虫剂提供了机会，这些计划比传统的化学控制更具生态优势3，8。
为了开发成功的农业害虫微生物控制剂，必须首先分离，表征，鉴定合适的生物体并确认其对目标害虫的致病性。然而，需要一种简单、具有成本效益的大规模生产微生物剂的方法，以生产用于生物控制方案的可行产品9、10、11、12、13。大量高质量昆虫病原体的大规模生产取决于微生物菌株，环境，目标害虫，配方，市场，应用策略和所需的最终产品14，15，16。EPF可以大规模生产，使用液体底物发酵产生囊孢子或固体底物发酵过程产生地上分生孢子6，17，18。然而，昆虫病原体的大规模生产和配制过程直接影响最终产品的毒力，成本，保质期和现场功效。为了在IPM中成功使用，昆虫病原体的生产过程必须易于运行，需要最少的劳动力，产生高产浓度的毒力，活体和持久性繁殖体，并且成本低4，13，14，16。
了解昆虫病原体的营养需求对于所有培养方法的大规模培养非常重要4，12.生产培养基的营养成分对所得繁殖体的属性有显著影响，包括生物防治功效、产量、干燥耐受性和持久性8、19、20、21。生产程序的优化旨在解决这些因素22.对于EPF，真菌分生孢子的良好生长，孢子形成和大规模生产的主要要求是充足的水分，最佳生长温度，pH值，CO 2和O2 的气体交换以及 营养，包括良好的磷，碳水化合物，碳和氮源18。
Jaronski和Jackson18 将固体底物发酵方法描述为相对于液体底物发酵方法而言，与EPF生产自然过程最有效和最接近的方法，因为在自然条件下，真菌分生孢子存在于固体直立结构上，就像昆虫尸体的表面一样。含有淀粉的农产品和副产品主要用于下胰腺真菌的大规模生产，因为真菌很容易通过从其菌丝尖端分泌高度浓缩的水解酶来分解淀粉，以渗透固体物质，并获得物质11，17，18，23中存在的营养物质.谷物产品也为健康的生物质生产提供了要求，因为当它们被水合和灭菌时，基质可以从任何液体培养基16，18，24中吸收更多的营养物质。
此前，有几项研究试图大规模培养EPF物种，如 Beauveria bassiana （Bals）。Vuil.， 冬虫夏草 （Wize） Kelper B. Shrestha & Spatafora， Verticillium lecanii （Zimm.）维加斯和一些 Metarhizium anisopliae （Metschn.）Sorokin物种复合物在各种基质上分离16，23，24。这种大规模生产和商业化开发的分离物包括Green Muscle® （菌株IMI 330189），由 M. anisopliae var Metarhizium acridum （Driver&Milner）J.F. Bisch，Rehner&Humber，Metarhizium 69（Meta 69菌株ICIPE69）和Real Metarhizium 69（L9281），由 M. anisopliae开发，宽带® （菌株PPRI 5339）和Eco-Bb®，由 B. bassiana25，26开发。.然而，对大众文化 Metarhizium robertsii J.F. Bisch.，S.A. Rehner&Humber和 Metarhizium pinghaense Chen&Guo的尝试有限。这两种分离株在之前的一项研究中被选为对控制粉虱最有效的， Pseudococcus viburni Signoret（半翅目：Pseudococcidae）27。因此，目前的研究旨在配制和大规模生产足够数量的当地 田上梅和平 海氏菌的弹性感染性繁殖体 ， 用于商业应用以对抗害虫。采用固体底物发酵法对两种EPF分离株进行菌源分生孢子的大规模生产。使用两种EPF接种方法，使用分生孢子悬浮液和芽孢子的液体真菌培养来接种固体底物。
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Protocol
1. 真菌菌株的来源
- 使用南非分离的来自南非西开普省苹果园的 M. pinghaense 5 HEID（GenBank加入编号：MT367414 / MT895630）和 M. robertsii 6EIKEN（MT378171 / MT380849）的 南非分离真菌菌株。
- 在60g Sabouraud葡萄糖琼脂培养基上生长每种EPF分离物的培养物，并补充1g酵母提取物（SDAY）和10μL链霉素。
注意：在黑暗中将EPF培养物在±25°C的受控温度下孵育。
2. 平海 梅塔根和 罗伯氏分 生孢子悬吊接种
- 固体基材的制备
- 使用两种农产品，即片状燕麦和片状大麦，作为两种EPF分离物的生长培养基，高压灭菌袋（305毫米×660毫米）作为发酵袋。
- 使用小的聚氯乙烯废液管（1000毫米×50毫米）在高压灭菌器袋的开口端为发酵袋创建一个颈部，并使用高压灭菌胶带将管道固定到袋子上。
- 用无菌棉絮塞关闭管道，以便在发酵过程中进行足够的气体交换。
- 称取片燕麦和片状大麦的干谷物（200克），并将其放入发酵袋中，并在每个袋子中加入100毫升蒸馏水并彻底混合袋子的内容物。
- 将湿谷物静置15-30分钟以吸收水分，然后再进行高压灭菌和灭菌。每种谷物类型准备六个袋子，并防止污染，将袋子放在其他高压灭菌袋中，并在121°C下高压灭菌基材55分钟。
- 分生孢子悬浮液接种物的制备
- 使用无菌手术刀片，通过刮擦从 M. pinghaense 和 M. robertsii 的真菌培养物中收获2-3周龄的真菌分生孢子。
- 将收集的真菌分生孢子悬浮在20mL无菌蒸馏水中，补充0.05%吐温20，并涡旋混合分生孢子悬浮液2分钟。
- 制备20 mL分生孢子悬浮液，浓度为1×107 分生孢子/ mL，并分别接种片状燕麦和片状大麦固体底物。
注意：使用血细胞计数器测定分生孢子浓度。
- 固体基材的接种
- 通过取下棉絮颈塞打开每个袋子，并将制备的20mL分生孢子悬浮液加入冷却的高压灭菌基材中。
- 再次关闭袋子，使用颈部塞子，按摩袋子的内容物，使真菌接种物与谷物基质均匀混合。
- 将发酵袋在±25°C的受控温度下孵育，并确保培养物与环境之间有足够的气体交换。
注意：该过程必须在层流柜下进行。
- 发酵阶段
- 接种和孵育2天后，当可见的菌丝生长发生并且基质开始被生长的真菌聚集时，在发酵袋中手动按摩谷物基质。
注意：这样做是为了混合接种的颗粒，以允许在真菌营养生长的第一个早期阶段进行菌丝分枝。 - 使用厨房擀面杖来操纵基板床，以避免晶粒基板床的物理不均质性和基板质量的床厚。
注意：该过程促进真菌代谢，从而优化真菌孢子的产生，并最大化表面积，促进分生孢子产量18。 - 让发酵过程持续长达4-5周，并每2天检查发酵袋中是否存在发酵过程中可能产生的白色营养过度生长，这会极大地影响真菌分生孢子的产量。
注意：立即终止在含有任何白色营养过度生长的发酵袋中的发酵，并将真菌培养物干燥18.
- 接种和孵育2天后，当可见的菌丝生长发生并且基质开始被生长的真菌聚集时，在发酵袋中手动按摩谷物基质。
3. 囊孢子接种
- 胚芽孢子的产生和接种
- 制备液体培养基，含有1升蒸馏水，30克葡萄糖，20克酵母提取物，4克磷酸钾重基（K2HPO4），15毫升玉米浸泡液和10μg/ mL抗生素链霉素，用于 平海分枝 杆菌和 罗伯西分枝杆菌。
- 首先，加热蒸馏水，在达到沸点之前关闭，然后将除链霉素以外的每种成分加入锅中的热水中。将培养基轻轻煮沸3-4分钟，并不断搅拌培养基，以允许适当混合成分并防止一些成分在锅底沉淀。
- 将总共100 mL培养基倒入九个不同的250 mL烧瓶中，并在每个烧瓶上放置棉絮塞，并用铝箔作为塞子覆盖棉絮（图1A）。
- 在烧瓶中在121°C下高压灭菌55分钟。 高压灭菌后，让烧瓶中的培养基冷却，并向每个烧瓶中的培养基中加入10mg / mL链霉素（图1B）。
- 从2-3周龄的真菌培养板中收集2-3个真菌分生孢子细菌环，用于EPF分离物 M. pinghaense 和 M. robertsii，并在无菌条件下转移到250 mL烧瓶中的每个100 mL液体培养基中，并密封烧瓶。
- 将液体培养瓶在±25°C下孵育，在轨道振荡器上以140rpm振荡3天，一旦培养物显示出高浊度和真菌囊孢子生长的迹象，就停止孵育（图1C）。
- 为了检测培养物中任何可能的细菌污染，在孵育期间24小时后从每个液体培养瓶中抽取100μL样品，并在每个分离物的三个SDA板上板。将板在±25°C的受控温度下孵育48小时。
- 固体基材的制备
- 使用蒸煮的长粒白米作为 M. pinghaense和M. robertsii （改编自Jaronski和Jackson18）的囊孢子的固体基质介质。
- 如上所述，在步骤2.1.1-2.1.3中制备发酵袋，并为每个袋子加入1公斤大米和300毫升无菌蒸馏水。
- 轻轻混合发酵袋的内容物，并以直立位置置于外部高压釜袋中，并在121°C下高压灭菌55分钟。高压灭菌后，让底物在无菌条件下冷却±45分钟。
- 接种和发酵
- 在层流下取出 M. pinghaense 和 M. robertsii 的每个液体培养瓶的关闭，并在每个烧瓶的边缘燃烧10秒。
- 通过将颈部的棉絮塞取出100mL液体培养物倒入发酵袋中（图2）。将棉塞放回原处，并用橡皮筋固定的手术纸盖住袋子的颈部顶部。
注意：使用血细胞计数器测定每个烧瓶的囊孢子浓度，并使用1×107 - 5×108 囊孢子/ mL的囊孢子浓度来纯天然接种底物28。 - 通过摇晃和轻轻操作按摩基质来扭转袋子的顶部并混合袋子的内容物，并将袋子在±25°C下孵育，通过在袋子中压平基材以防止形成厚床18。
- 在接种和孵育后2-3天，通过按摩袋子的内容物来打破发酵袋中的底物，此时发生了可见的菌丝体生长和真菌对底物的结合（改编自Jaronski和Jackson18的技术）。
注意：让发酵持续4周。
图 1：高压灭菌前在 250 mL 烧瓶中的液体培养基。（A）（B）高压灭菌和接种EPF孢子后。（C）具有真菌胚芽孢子的浑浊培养基。请点击此处查看此图的大图。
图2：制备的囊孢子液体培养基。 （A） Metarhizium robertsii 和（B） Metarhizium pinghaense 在接种水稻之前作为固体基质。 请点击此处查看此图的大图。
4. 真菌培养物的干燥
- 在试验中使用之前，通过将孢子培养物转移到26-30千克（30 x 43 x 15250cm 3）的棕色纸袋中，将真菌培养物在发酵后干燥10-12天。
- 为了提高纸袋的拉伸强度，水平切掉每个袋子顶部三分之一，并在袋子的底部划线（图3A，B）。
图3：纸袋的制备，培养物的干燥过程和包装。（A，B）棕色纸袋的制备。生长在（C，E）蒸谷大米和（D，F）片状大麦上的Metarhizium种培养物的干燥程序。（G）用订书钉封闭的纸袋，形成三角形帐篷结构。请点击此处查看此图的大图。
- 轻轻粉碎每个发酵袋中的基质，切掉每个袋子的一角，并通过切割角留下的空间将整个培养物转移到纸袋中（图3C-F）。为了避免真菌孢子过度逸出到空气中，请缓慢执行此过程。
注意：在无菌条件下，使用层流进行此过程，以避免污染。 - 标记每个纸袋并在每个袋子的顶端折叠两次，并用订书钉关闭以形成三角形帐篷结构，并将袋子放在钢丝晾衣架上，以便在±25°C的受控温度和30-40%的低湿度下适当，均匀地干燥。
- 每天翻转袋子，使培养物均匀干燥，并避免可能发生的任何营养再生，这将降低可收获真菌孢子的产量。
- 在干燥过程中每2天称重每个干燥袋，并继续每个袋子的干燥过程，直到连续几天之间观察到袋子的质量几乎没有变化。
5. 真菌分生孢子的收获
- 使用三个嵌套筛从培养物中机械地收获真菌分生孢子，测试筛（ETS）网35号（孔径为500μm），嵌套在测试筛（具有212μm孔径），嵌套在ETS网100号（具有150μm孔径）上，安装在收集盘上。
- 将干燥的培养样品缓慢装载到ETS网状35筛上，并在筛子上盖上盖子，以防止真菌分生孢子释放到空气中。
- 在筛子中加入10-12个玻璃弹珠，以协助真菌分生孢子通过网筛，避免分生孢子保留在筛子中，从而减少孢子回收。
- 用电工胶带用胶带密封筛口，防止分生孢子粉尘逸出。
- 将筛子放在装有粘性垫的振动振荡器上，以每分钟560-640次的振动固定收集盘和筛子20-25分钟（图4）。
注：技术改编自Jaronski和Jackson18。
图4：从大米和片状大麦上干燥的 Metarhizium robertsii 培养物中收获真菌孢子。 （A）将10-12个玻璃弹珠添加到筛子中，以协助真菌分生孢子通过网状筛网。 从 （B）水稻和（C）水稻的培养物中收获的分生孢子分生孢子菌几乎剥落。（D）振动筛上的筛子。 请点击此处查看此图的大图。
- 从收集盘中取出测试筛，收集分生孢子并将收集的分生孢子存放在密闭和不透水的拉链锁袋中，以便长期储存（3-6个月）。
6. 真菌分生孢子的定量
- 在从每个基质收获真菌分生孢子之前，测量并记录每个谷物基质的质量。
- 通过从固体基质的质量中减去收集的孢子的质量来测量收集的分生孢子的总重量。
注意：总分生孢子产量不仅涉及收获的分生孢子，还涉及留在固体基质上的真菌分生孢子。 - 称量基材，并从称重的基材中取出10克。将10g底物悬浮在0.05%吐温20中，并在10mL无菌蒸馏水中稀释。
- 涡旋混合悬浮液2分钟，并使用血细胞计数器进行孢子计数以确定从底物中洗涤的分生孢子的数量。
- 通过将 1000 μL 洗涤的分生孢子悬浮液转移到 9 mL 无菌蒸馏水中以构成 10 mL 稀释悬浮液来进行进一步的稀释。
- 涡旋混合分生孢子悬浮液2分钟，并确定分生孢子浓度。
注意：按照Inglis，Enkerli和Goettel30 描述的程序和公式来确定悬浮液的分生孢子浓度。 - 收集并从每个培养物中收集的总共0.1g收集的分生孢子粉在10mL无菌蒸馏水中补充0.05%吐温20，涡旋混合分生孢子悬浮液2分钟，并使用血细胞计数器测定分生孢子浓度。
- 通过将1000μL分生孢子悬浮液转移到9 mL无菌蒸馏水中以构成10 mL悬浮液稀释液来进行进一步的稀释。
- 涡旋混合分生孢子悬浮液2分钟，计算分生孢子浓度并确定每克分生孢子的数量。
- 将每克收获的粉末的分生孢子数乘以收获的分生孢子粉末的初始质量。将从基质中洗涤的分生孢子数量乘以用过的基质的总重量，即从中获取分生孢子的基质。
- 将两个给定值相加并除以基材的初始干重，以计算每公斤或每克底物的分生孢子数18。
注：计算主要针对水稻基质。对 平海分 枝杆菌和 罗伯氏 分枝杆菌分离株进行发芽或分生孢子活力试验，以确定产生的分生孢子的生存能力。
7. 数据分析
- 使用适当的计算机软件程序对获得的结果进行统计分析。
注：数据的统计分析是使用统计A版本13.5.0.17完成的。
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Representative Results
在真菌培养物的干燥阶段，随着时间的推移，观察到 M. pinghaense 和 M. robertsii 的水稻培养物含量质量下降，一旦培养物干燥，在质量上没有或几乎没有变化（图5）。收获的 M. pinghaense 和 M. robertsii 的干燥真菌分生孢子粉如图 6所示。
图5：10天内 水稻Metarhizium robertsii 和 M. pinghaense 培养物的袋子含量质量的变化（95%置信区间） （方差分析;F5，35 = 2.21;p = 0.08）。条形上方的不同字母表示几天内袋子含量质量的显着差异（p <0.05）。 请点击此处查看此图的大图。
图6：收获的分生孢子。 （A）收集盘中收获的分生孢子。（B） Metarhizium robertsii. （C） M. pinghaense. 请点击此处查看此图的大图。
从每种谷物类型收获的 M. pinghaense和M. robertsii的平均分生孢子粉末中未观察到显着差异。两者收获的干分生孢子对 平海氏分枝 杆菌和 罗伯西分生孢子的平均分生孢子生存能力均为>90%。在水稻基质上， M. pinghaense 平均产生8.2克±4.38克分生孢子粉，略高于 为M. robertsii （6克±2克）获得的量。平均从片状大麦基质中收获1.83 g±1.47 g干 分 生孢子，而从基质收获零 M. pinghaense 。没有从片状燕麦底物中收获 M. pinghaense 或 M. robertsii 的干燥真菌分生孢子（图7）。
图7：分生孢子粉的平均值。 从三种固体基质（蒸谷米，片状大麦和片状燕麦）收获的 Metarhizium pinghaense 和 M. robertsii的分生孢子粉的平均量，以克为单位（95%置信区间）测量（方差分析：F2，27 = 2.82; p = 0.08）。 请点击此处查看此图的大图。
在从米粒收获的每克估计平均分生孢子中观察到M . pinghaense （3.51 x 107 / g ±0.43 x 107 / g）和 M. robertsii （4.31 x 107 / g ±0.38 x 107 / g）之间存在显着差异。M. robertsii 每克的平均分生孢子计数略高于 M. pinghaense （图8）。
图8：每克平均分生孢子。 来自水稻培养物的 Metarhizium pinghaense 和 M. robertsii （95%置信区间）的估计平均分生孢子/克（方差分析：F 1，7 = 8.47; p = 0.02）。 请点击此处查看此图的大图。
在M. pinghaense（5.02 x 10 7 / mL ±1.47 x 107 / mL）和M. robertsii（3.70x 10 7 / mL±0.91 x 107 / mL）之间，在用过的水稻基质上存在的估计分生孢子数量没有显着差异（图9）。然而，M. pinghaense在水稻基质上存在的分生孢子数量略高于M. robertsii。
图9：平均真菌分生孢子。来自用过的水稻培养基质上存在的培养物（F1，7 = 2.45;p = 0.16）的Metarhizium pinghaense和M robertsii（95%置信区间）的估计平均真菌分生孢子。请点击此处查看此图的大图。
从水稻基质培养物中获得的 平海氏菌 （5.09 x 107/g ±1.35 x 107/g）和 罗伯氏分枝杆菌 （3.55 x 107/g ±0.85 x 107/g）的估计总分生孢子产量没有显著差异。然而， M. pinghaense 产生的分生孢子产量略高于 M. robertsii， 后者产生的分生孢子产量较低（图10）。
图 10：分生孢子总产量。 水稻培养物中 Metarhizium pinghaense 和 M. robertsii （95%置信区间）的估计总分生孢子产量（F1，7 = 3.91; p = 0.09）。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
在农业生态系统中成功整合微生物制剂以生物控制重要的农业害虫取决于昆虫病原的成功和容易程度，这是实验室条件下的第一步。EPF的大规模生产对于使用生物防治的IPM计划的EPF产品的大规模应用和可用性非常重要9，10，11，12，13。不同EPF分离物的大规模生产的成功受生产基质或培养基的营养成分的影响，这些成分显着影响所得分生孢子的属性，包括其功效，干燥耐受性，现场持久性和分生孢子产量8，19，20，21.因此，在培养和发酵过程中开发大规模生产的昆虫病原体的营养需求的知识是重要的29。
在目前的研究中， M. robertsii 和 M. pinghaense 的大规模生产都是使用三种不同的农产品作为发酵基质进行的：蒸谷米，片状大麦和片状燕麦。观察到三种不同的晶粒底物显著影响真菌分离物的分生孢子产量。蒸煮大米非常有利于两种分离物的大规模生产，而片状的大麦谷物仅有利于 M. robertsii 的生产。观察是基于发酵后干真菌分生孢子粉的产量进行的。很少或没有，分生孢子是在发酵后从片状燕麦中收获的。在发酵过程中，发现片状燕麦在发酵袋中保留了更高水平的水分，这可能导致观察到谷物作为生产 M. pinghaense 和 M. robertsii的基质的性能不佳。在某些情况下，片状燕麦底物容易发生真菌分离物的白色营养菌丝体过度生长，这极大地影响了分生孢子产量，因为在含有过度生长的发酵袋中没有孢子形成。还观察到含有片状燕麦底物的发酵袋相对于含有片状大麦底物的发酵袋具有高水平的细菌污染。
在大规模生产使用片状大麦作为底物的 M. pinghaense 方面观察到高水平的腐生真菌或酵母污染。在发酵过程的后期阶段，通过用于接种底物的真菌以外的真菌的生长和分生观察到腐生真菌污染。在分生孢子孢子形成之前的发酵初始阶段诊断底物污染是困难的。发酵过程中的细菌和酵母菌污染被认为表现为基质中的湿斑块，片状燕麦和大麦粒都倾向于比米粒吸收和保持水分更长的时间。这是使用这两种底物作为发酵底物以大规模生产两 种Metarhizium 分离物的限制。
本研究期间进行的观察表明，用于接种每个晶粒基质的接种方法类型影响了分生孢子的产生。分生孢子悬浮液接种法的效果相对较差，因为接种的片状燕麦和片状大麦的污染程度相对于对稻粒使用液体培养的囊孢子接种方法相比有所增加。与液体培养的囊孢子接种方法不同，分生孢子悬浮液方法不允许在接种底物之前检测悬浮液中可能存在的污染物，从而导致在发酵袋中观察到的高水平污染。Jaronski和Jackson18 描述了可能导致所用底物可能污染的几个因素，例如底物缺乏完全灭菌，非无菌接种以及袋子中发酵基质的处理不当。在含有片状大麦和片状燕麦的发酵袋中观察到的污染也可能是由于底物缺乏完全灭菌造成的，这可能发生在高压灭菌过程中。Jaronski和Jackson18 还描述了使用分生孢子悬浮液作为接种剂是不利的，因为它导致在从琼脂培养基收获分生孢子期间污染的机会增加。
在田间，在合适的宿主感染期间，真菌首先通过增殖在昆虫的血细胞中积累生物量，然后在其出现并在昆虫30的外固体表面上孢子化。当使用液体 - 囊孢子发酵方法时，模拟了这样的过程。因此，肉汤代表昆虫的血液，用真菌分生孢子接种肉汤代表昆虫的初始接触和感染，肉汤中胚芽孢子的形成代表感染昆虫血液内部发生的芽孢子过程的增殖。随着时间的推移，米粒的最终接种和真菌在谷物上的孢子化代表了一旦真菌开始从昆虫尸体内部出现，昆虫角质层上发生的事情。这可以解释为什么液体囊孢子发酵方法比分生孢子悬浮液接种方法效果更好。
Jaronski和Jackson18 将片状燕麦和片状大麦粒描述为与大米籽粒相比， 是Metarhizium 物种大规模培养的首选农业谷物，因为发现这两种谷物类型在发酵过程中保持其水分含量。然而，目前的研究与上述研究人员的观察和结论相矛盾，因为片状燕麦和片状大麦都没有被发现是 M. pinghaense 或 M. robertsii的良好固体发酵底物。研究发现，大米是两种分离物的良好谷物基质，因为它不会像先前研究所建议的那样分解成可以与最终产物混合的小颗粒。
目前的研究表明，使用米粒可以成功地培养和大规模生产 Metarhizium 物种的分离物，并且不同的谷物往往以不同的方式影响分生孢子孢子和产量。这可能是由于不同的谷物在这种营养成分方面存在差异，例如碳：氮比和碳浓度。已知生长培养基的碳浓度和碳：氮比会影响分生孢子的产量，以及其在活力和毒力方面的质量22。用于接种底物的接种技术也被证明会影响在特定农业谷物基质上大规模生产EPF分离物的成功程度。因此，本研究中描述的液体囊孢子发酵技术被推荐为农业谷物基质的最佳接种方法，用于大规模生产 M. pinghaense 和 M. robertsii 分离物。使用这种方法允许在使用接种剂之前可能检测污染，这可能阻碍相对于使用分生孢子悬浮液接种技术的所需EPF分离物的大规模生产。还建议使用米粒作为固体基质，用于大规模生产 M. pinghaense 和 M. robertsii的分生孢子，而不是片状大麦和片状燕麦。所描述的技术对于分生孢子在田间条件下针对农业生态系统中重要害虫的未来大规模生产和商业应用具有重要意义。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者要感谢Hort Pome，Hort Stone以及技术和人力资源行业计划（THRIP：TP14062571871）为该项目提供资金。
ORCID：
莱托迪·马图 http://orcid.org/0000-0002-5118-3578
安托瓦内特·马兰 http://orcid.org/0000-0002-9257-0312
诺玛克霍尔瓦·斯托克韦 http://orcid.org/0000-0003-2869-5652
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Tween 20 | Lasec | Added to conidial suspensions to allow fungal spores to mix with water | |
| 20 mL McCartney bottles | Lasec | Used to make conidial suspensions | |
| Aluminium foil | Used as a cover of the cotton wool plugs on 250-mL flask | ||
| Autoclave | Used to sterilize materials and ingredients used for the conidia production process | ||
| Autoclave bags | Lasec | Fermentation bags or solid substrate containers | |
| Autoclave tape | Lasec | To secure PVC pipes on the fermentation bags | |
| Brown Kraft paper bags | Used to dry conidia cultures on agricultural grains | ||
| Bunsen burnner | Labnet (Labnet International, Inc.) | Used to flame equipment (surgical blades,inoculating loops and rims of flasks) | |
| Clear edge test sieve | Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates | ||
| Corn steep liquor | SIGMA | 66071-94-1 | Ingredient of the blastospore liquid medium |
| Cotton Wool | Lasec | Used as plug of the neck for fermentation bags | |
| Duran laboratory bottles | Neolab | Used to autoclave SDA medium and distilled water | |
| Electrical tape | Used to tape and seal the sieve joints to prevent the escape of conidial dust | ||
| ENDECOTTS test sieve | Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates | ||
| Erlenmeyer Flasks, Narrow neck,250-mL flask | Lasec | Carrier of the blastospore liquid medium | |
| Ethanol (99%) | Lasec | Used to sterilize surgical blades and inoculating loops | |
| Flaked barley | Health Connection Wholefoods | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Flaked oats | Tiger brands | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Glucose | Merck | Ingredient of the blastospore liquid medium | |
| Growth Chamber/ incubators | For growing fungal conidia culture | ||
| Haemocytometer | Used to determine conidial concentrations | ||
| Inoculating loops | Lasec | For harvesting spores to innoculate liquid medium for blastospores growth | |
| Kitchen rolling pin | Used to manipulate the solid grain substrate bed | ||
| Laminar flow Cabinet | ESCO Laminar Flow Cabinet | Provide as sterile environment during substrate inoculation | |
| Metarhizium pinghaense conidia | Stellenbosch University | 5HEID | Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium pinghaense |
| Metarhizium robertsii conidia | Stellenbosch University | 6EIKEN | Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium robertsii |
| Microscope | ZEIZZ (Scope. A1) | Used to determine conidial concentrations and conidial viability | |
| Orbital shaker | IncoShake- LABOTEC | Used for the blastospore production process | |
| Parboiled rice | Spekko | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Penicillin-Streptomycin | SIGMA | Added to the SDA medium to prevent bacterial contamination | |
| Petri-dishes | Lasec | Containers for the SDA medium | |
| Pipettes and pipette tips | Labnet (BioPette PLUS) | Used to measure liquids ingredients | |
| Polyvinylchloride Marley waste pipe | Used to create a neck for the fermentation bag | ||
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | SIGMA-ALDRICH | Ingredient of the blastospore liquid medium | |
| Rubber band | Used to secure the secure the surgical paper over the fermentation bag PVC pipe necks | ||
| Sabaroud dextrose agar (SDA) | NEOGEN Culture Media | Medium used to culture spores of both Metarhizium pinghaense and Metarhizium robertsii | |
| Sterile distilled water | To hydrate agricultural grains, to make conidial suspensions | ||
| Sticky pad | Used to secure the seives on the vibratory shaker | ||
| Surgical blade | Lasec | Used to scrape off spores from fungal cultures | |
| Surgical paper | Lasec | Used to cover the PVC necks and cotton wool plugs of the fermentation bag | |
| Vibratory shaker | Used to shake conidia off the agricultural grain substrates | ||
| Vortex mixer | Labnet (Labnet International, Inc.) | Used to mix conidial suspensions in Mc Cartney bottles | |
| Yeast extract | Biolab | Added to the SDA medium to improve spore germination and growth | |
| Zipper-lock bags | GLAD | Used to to store harvested fungal conidia |
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