ייצור המוני של פטריות אנטומופתוגניות, Metarhizium robertsii ו - Metarhizium pinghaense, ליישום מסחרי נגד חרקים מזיקים

Summary

פטריות אנטומופתוגניות צברו חשיבות כחומרי ההדברה הביולוגית של מזיקים חרקים חקלאיים. במחקר זה, הייצור ההמוני של מספר מספיק של התפשטות זיהומית גמישה של מבודדים דרום אפריקאים הן של Metarhizium robertsii והן של M. pinghaense ליישום מסחרי נגד מזיקים חרקים נערך בהצלחה באמצעות מוצרי תבואה חקלאיים.

Abstract

פטריות אנטומופתוגניות של קומפלקס המינים Metarhizium anisopliae צברו חשיבות כסוכני ההדברה הביולוגית של מזיקים חרקים חקלאיים. העלייה בעמידות המזיקים לקוטלי חרקים כימיים, החששות הגוברים לגבי ההשפעות השליליות של קוטלי חרקים על בריאות האדם והזיהום הסביבתי מחומרי הדברה הובילו לדחף עולמי למצוא אסטרטגיות קיימות חדשניות להגנת הצומח ולהדברת מזיקים. בעבר נערכו ניסיונות לתרבות המונית כגון מיני פטריות אנטומופתוגניות (EPF) כמו Beauveria bassiana . עם זאת, רק ניסיונות מוגבלים נעשו לתרבות ההמונים Metarhizium robertsii ו – M. pinghaense לשימוש נגד מזיקים חרקים. מחקר זה נועד לייצר באופן המוני מספר מספיק של התפשטות זיהומית גמישה של מבודדים דרום אפריקאים של M. robertsii ו- M. pinghaense ליישום מסחרי. שלושה מוצרי תבואה חקלאיים, שיבולת שועל מתקלפת, שעורה מתקלפת ואורז, שימשו כמצעי התסיסה המוצקים של EPF. שתי שיטות חיסון, תרחיפים חרוטיים ותרבות הפטריות הנוזלית של בלסטוספורים שימשו לחיסון המצעים המוצקים. חיסון באמצעות תרחיפים חרוטיים נצפה כפחות יעיל יחסית, שכן רמות מוגברות של זיהום נצפו על המצעים המוצקים ביחס לשימוש בשיטת החיסון של בלסטוספורה. שיבולת שועל מתקלפת נמצאה לא כמצע גידול מתאים הן ל-M. robertsii והן ל-M. pinghaense, מכיוון שלא נקטפו קונידיה יבשה מהמצע. נמצא כי שעורה מתקלפת מעדיפה את הייצור של M. robertsii conidia על פני זו של M. pinghaense, וממוצע של 1.83 גרם ± 1.47 גרם של M. robertsii conidia יבש ואפס גרם של M. pinghaense conidia נקטף מהמצע. גרגרי אורז נמצאו כמעדיפים את הייצור ההמוני החרוטי של מבודדי M. pinghaense ו-M. robertsii , עם ממוצע של 8.2 גרם ± 4.38 גרם ו-6 גרם ± 2 גרם שנקטפו מהמצע, בהתאמה.

Introduction

פטריות אנטומופתוגניות (EPF) צברו חשיבות כחומרים להגנת הצומח בהדברה ביולוגית של מזיקים חקלאיים חשובים ^1,2. האנטומופתוגנים, המתרחשים באופן טבעי בקרקע, גורמים לאפיזוטיקה באוכלוסיות של מיני מזיקים שונים³. המינים של EPF הם ספציפיים לפונדקאי ומהווים סיכונים מעטים יחסית במונחים של תקיפת מינים שאינם ממוקדים, והם אינם רעילים לסביבה⁴. ל-EPF יש מנגנון ייחודי לפלישה למארח שלהם, כמו גם להפצה והתמדה בסביבתם הקרובה¹. הם תוקפים את הפונדקאי בעיקר דרך נבגים א-מיניים שמתחברים לציפורן המארח וחודרים אליו כדי לפלוש ולהתרבות בהמוקול המארח. הפונדקאי מת בסופו של דבר עקב דלדול של חומרי המזון של ההמולימף או כתוצאה מהטוקסמיה הנגרמת על ידי המטבוליטים הרעילים המשתחררים על ידי הפטרייה. לאחר המוות, בתנאים סביבתיים אידיאליים, הפטרייה מופיעה על פני השטח החיצוניים (מיקוזיס גלוי) של הפונדקאי ^5,6.

חששות גוברים לגבי ההשפעות השליליות של שאריות כימיות על בריאות האדם, זיהום סביבתי והתפתחות עמידות בפני מזיקים הובילו לדחף העולמי להפחית את התשומות של קוטלי חרקים מבוססי כימיקלים ולמצוא אסטרטגיות חלופיות, חדשניות וברות קיימא להגנת הצומח ולהדברת^{מזיקים 6,7,8} . זה סיפק הזדמנויות לפתח קוטלי חרקים מבוססי מיקרוביאלית לשימוש בתוכניות משולבות לניהול מזיקים (IPM), שהן אסטרטגיות חיוביות יותר מבחינה אקולוגית מאשר הדברה כימית קונבנציונלית ^3,8.

כדי לפתח חומר הדברה מיקרוביאלי מוצלח למזיק חקלאי, יש לבודד תחילה אורגניזם מתאים, לאפיין אותו, לזהותו ולאשר את הפתוגניות שלו למזיק המטרה. עם זאת, נדרשת שיטה קלה וחסכונית לייצור בקנה מידה גדול של החומר המיקרוביאלי כדי לייצר מוצר בר קיימא לשימוש בתוכניות הדברה ביולוגית ^{9,10,11,12,13}. ייצור המוני של כמויות משמעותיות של אנטומופתוגנים באיכות טובה תלוי בזן המיקרוביאלי, בסביבה, במזיק היעד, בפורמולציה, בשוק, באסטרטגיית היישום ובתוצר הסופי הרצוי 14,15,16. EPF יכול להיות מיוצר באופן המוני באמצעות תסיסת מצע נוזלי כדי לייצר בלסטוספורים או את תהליך התסיסה של המצע המוצק כדי לייצר קונידיה אווירית ^6,17,18. עם זאת, תהליך הייצור ההמוני והניסוח של אנטומופתוגנים משפיע ישירות על האלימות, על העלות, על חיי המדף ועל יעילות השדה של המוצר הסופי. לשימוש מוצלח ב- IPM, תהליך הייצור של האנטומופתוגנים חייב להיות קל להפעלה, לדרוש עבודה מינימלית, לייצר ריכוז בעל תפוקה גבוהה של התפשטות ארסית, בת קיימא ומתמשכת, ולהיות נמוך בעלות 4,13,14,16.

הבנת הדרישות התזונתיות של אנטומופתוגנים חשובה לגידול המוני בכל שיטות התרבות ^4,12. למרכיבים התזונתיים של מדיום הייצור יש השפעה משמעותית על התכונות של הממרחים המתקבלים, כולל יעילות ביו-קונטרול, תפוקה, סבילות לייבוש והתמדה 8,19,20,21. האופטימיזציה של הליכי הייצור נועדה לטפל בגורמים כאלה²². עבור EPF, הדרישות העיקריות לצמיחה טובה, ספורולציה וייצור המוני של קונידיה פטרייתית הן לחות מספקת, טמפרטורת גדילה אופטימלית, pH, חילופי גזים של CO₂ ו- O_2, ותזונה, כולל זרחן טוב, פחמימות, פחמן וחנקן מקורות¹⁸.

ג’רונסקי וג’קסון¹⁸ מתארים את שיטת התסיסה של המצע המוצק כשיטת הקירוב היעילה ביותר והקרובה ביותר לתהליך הטבעי לייצור EPF ביחס לשיטת התסיסה של המצע הנוזלי מכיוון שבתנאים טבעיים, הקונידיום הפטרייתי נישא על מבנים זקופים מוצקים, כמו פני השטח של חרקים. מוצרים חקלאיים ותוצרי לוואי המכילים עמילן משמשים בעיקר לייצור המוני של פטריות היפוקריאליות, שכן הפטריות מתפרקות בקלות עמילן באמצעות הפרשה של אנזימים הידרוליטיים מרוכזים מאוד מקצות ההיפל שלהם, כדי לחדור לחומר המוצק, ולגשת לחומרים המזינים הקיימים בחומר 11,17,18,23 . מוצרי הדגנים מספקים גם את הדרישות לייצור ביומסה בריאה מכיוון שכאשר הם מיובשים ומעוקרים, המצעים יכולים לספוג חומרים מזינים נוספים מכל מדיום נוזלי ^16,18,24.

בעבר, מספר מחקרים ניסו להרים את תרבות ההמונים של מיני EPF כמו Beauveria bassiana (Bals.) Vuil., Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. Shrestha &Spatafora, Verticillium lecanii (Zimm.) ויגאס וחלק מה-Metarhizium anisopliae (Metschn.) קומפלקס מיני סורוקין מבודד על מצעים שונים 16,23,24. מבודדים כאלה שיוצרו בייצור המוני ופותחו באופן מסחרי כוללים את שריר^® ירוק (זן IMI 330189), שפותח מ- M. anisopliae var Metarhizium acridum (דרייבר ומילנר) J.F. Bisch, Rehner &Humber, Metarhizium 69 (זן Meta 69 ICIPE69), ו- Real Metarhizium 69 (L9281), שפותח מ– M. anisopliae, ופס^® רחב (זן PPRI 5339) ו- Eco-Bb^®, שפותח מ- B. bassiana^25,26 . עם זאת, נעשו ניסיונות מוגבלים לתרבות המונים Metarhizium robertsii J.F. Bisch., S.A. Rehner &Humber ו– Metarhizium pinghaense Chen &Guo. שני מבודדים אלה נבחרו במחקר קודם כיעילים ביותר לשליטה ב-mealybug, Pseudococcus viburni Signoret (Hemiptera: Pseudococcidae)²⁷. לכן, המחקר הנוכחי נועד לנסח ולייצר באופן המוני מספר מספיק של התפשטות זיהומית גמישה של המבודדים המקומיים של M. robertsii ו- M. pinghaense ליישום מסחרי נגד מזיקים חרקים. שיטת התסיסה של המצע המוצק שימשה לייצור המוני של הקונידיה הפטרייתית עבור שני מבודדי EPF. שתי שיטות חיסון EPF, תוך שימוש במתלים חרוטיים ובתרבית הפטרייתית הנוזלית של בלסטוספורים, שימשו לחיסון המצעים המוצקים.

Protocol

1. מקור הזנים הפטרייתיים השתמש בזנים פטרייתיים מבודדים בדרום אפריקה של M. pinghaense 5 HEID (מספר הצטרפות GenBank: MT367414/MT895630) ו – M. robertsii 6EIKEN (MT378171/MT380849), שנאספו ממטעי תפוחים במחוז הכף המערבי, דרום אפריקה. גידול תרביות של כל EPF מבודדות על 60 גרם של מדיום אגר דקסטרוז של Sabouraud …

Representative Results

ירידה במסת התוכן של התרבויות על אורז הן עבור M. pinghaense והן עבור M. robertsii נצפתה עם הזמן במהלך שלב הייבוש של תרבויות הפטריות, כאשר לא נצפה שינוי, או מעט, במסה לאחר שהתרביות התייבשו (איור 5). אבקת הקונידיה הפטרייתית היבשה שנקטפה הן של M. pinghaense והן של M. robertsii מוצגת <st…

Discussion

האינטגרציה המוצלחת של חומרים מיקרוביאליים להדברה ביולוגית של מזיקים חקלאיים חשובים באגרואקוסיסם תלויה הן בהצלחה והן בקלות הייצור ההמוני של האנטומופתוגנים כצעד ראשון בתנאי מעבדה. הייצור ההמוני של EPF חשוב ליישום בקנה מידה גדול ולזמינות של מוצרי EPF עבור תוכניות IPM באמצעות הדברה ביולוגית<sup …

Materials

0.05% Tween 20	Lasec		Added to conidial suspensions to allow fungal spores to mix with water
20 mL McCartney bottles	Lasec		Used to make conidial suspensions
Aluminium foil			Used as a cover of the cotton wool plugs on 250-mL flask
Autoclave			Used to sterilize materials and ingredients used for the conidia production process
Autoclave bags	Lasec		Fermentation bags or solid substrate containers
Autoclave tape	Lasec		To secure PVC pipes on the fermentation bags
Brown Kraft paper bags			Used to dry conidia cultures on agricultural grains
Bunsen burnner	Labnet (Labnet International, Inc.)		Used to flame equipment (surgical blades,inoculating loops and rims of flasks)
Clear edge test sieve			Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates
Corn steep liquor	SIGMA	66071-94-1	Ingredient of the blastospore liquid medium
Cotton Wool	Lasec		Used as plug of the neck for fermentation bags
Duran laboratory bottles	Neolab		Used to autoclave SDA medium and distilled water
Electrical tape			Used to tape and seal the sieve joints to prevent the escape of conidial dust
ENDECOTTS test sieve			Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates
Erlenmeyer Flasks, Narrow neck,250-mL flask	Lasec		Carrier of the blastospore liquid medium
Ethanol (99%)	Lasec		Used to sterilize surgical blades and inoculating loops
Flaked barley	Health Connection Wholefoods		Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii
Flaked oats	Tiger brands		Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii
Glucose	Merck		Ingredient of the blastospore liquid medium
Growth Chamber/ incubators			For growing fungal conidia culture
Haemocytometer			Used to determine conidial concentrations
Inoculating loops	Lasec		For harvesting spores to innoculate liquid medium for blastospores growth
Kitchen rolling pin			Used to manipulate the solid grain substrate bed
Laminar flow Cabinet	ESCO Laminar Flow Cabinet		Provide as sterile environment during substrate inoculation
Metarhizium pinghaense conidia	Stellenbosch University	5HEID	Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium pinghaense
Metarhizium robertsii conidia	Stellenbosch University	6EIKEN	Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium robertsii
Microscope	ZEIZZ (Scope. A1)		Used to determine conidial concentrations and conidial viability
Orbital shaker	IncoShake- LABOTEC		Used for the blastospore production process
Parboiled rice	Spekko		Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii
Penicillin-Streptomycin	SIGMA		Added to the SDA medium to prevent bacterial contamination
Petri-dishes	Lasec		Containers for the SDA medium
Pipettes and pipette tips	Labnet (BioPette PLUS)		Used to measure liquids ingredients
Polyvinylchloride Marley waste pipe			Used to create a neck for the fermentation bag
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)	SIGMA-ALDRICH		Ingredient of the blastospore liquid medium
Rubber band			Used to secure the secure the surgical paper over the fermentation bag PVC pipe necks
Sabaroud dextrose agar (SDA)	NEOGEN Culture Media		Medium used to culture spores of both Metarhizium pinghaense and Metarhizium robertsii
Sterile distilled water			To hydrate agricultural grains, to make conidial suspensions
Sticky pad			Used to secure the seives on the vibratory shaker
Surgical blade	Lasec		Used to scrape off spores from fungal cultures
Surgical paper	Lasec		Used to cover the PVC necks and cotton wool plugs of the fermentation bag
Vibratory shaker			Used to shake conidia off the agricultural grain substrates
Vortex mixer	Labnet (Labnet International, Inc.)		Used to mix conidial suspensions in Mc Cartney bottles
Yeast extract	Biolab		Added to the SDA medium to improve spore germination and growth
Zipper-lock bags	GLAD		Used to to store harvested fungal conidia