昆虫病原性真菌、メタリシウム・ロベルツィイおよびメタリシウム・ピンヘーンセの大量生産、害虫に対する商業利用
Summary
昆虫病原性真菌は、農業害虫の生物防除剤として重要性を増している。この研究では、害虫に対する商業利用のために、 Metarhizium robertsii および M. pinghaense の両方の南アフリカの分離株の十分な数の弾力性感染性プロパグルの大量生産が、農業穀物製品を使用して首尾よく行われた。
Abstract
メタリジウム・アニソプリアエ種複合体の昆虫病原性真菌は、農業害虫の生物防除剤として重要性を増している。化学殺虫剤に対する害虫抵抗性の増加、殺虫剤の人間の健康への悪影響に関する懸念の高まり、および農薬による環境汚染は、作物保護と害虫駆除のための新しい持続可能な戦略を見出す世界的な推進力をもたらしました。これまで、ボーベリア・バッシアナのような昆虫病原性真菌(EPF)種を大量培養する試みが行われている。しかしながら、昆虫害虫に対する使用のためにメタリジウム・ロベルツィイおよびM. pinghaenseを大量培養する試みは限定的にしか行われていない。この研究は、M. robertsiiおよびM. pinghaenseの南アフリカの分離株の十分な数の弾力性感染性伝播剤を商業用途のために大量生産することを目的としていた。3つの農業穀物製品、フレークドオート麦、フレーク大麦、および米をEPF固体発酵基質として使用した。2つの接種方法、分生子懸濁液および胚芽胞子の液体真菌培養物を固体基質に接種するために使用した。分生子懸濁液を用いた接種は、ブラストスポア接種法を使用した場合と比較して固体基質上に増加したレベルの汚染が観察されたため、比較的効果が低いことが観察された。フレーク状のオート麦は、M. robertsiiとM. pinghaenseの両方にとって適切な成長基質ではないことが判明し、基質から乾燥分生子が採取されなかった。フレーク状の大麦は、M. pinghaenseのそれよりもM. robertsii conidiaの生産に有利であることが見出され、平均1.83g±1.47gの乾燥M. robertsii分生子および0グラムのM. pinghaense分生子が基質から収穫された。 米粒は、M. pinghaense分離株とM. robertsii分離株の両方の分生子大量生産に有利に働くことが見出され、基質から収穫された±平均8.2g±4.38gおよび6gである。
Introduction
昆虫病原性真菌(EPF)は、重要な農業害虫の生物学的防除における作物保護剤として重要性を増している1、2。土壌中に自然に発生する昆虫病原体は、様々な害虫種の集団に流行を引き起こす3。EPFの種は宿主特異的であり、非標的種を攻撃するという点で比較的リスクが少なく、環境に対して毒性がない4。EPF には、ホストに侵入するための独自のメカニズムと、その直接の環境での伝播と永続化のための独自のメカニズムがあります 1。彼らは主に宿主のキューティクルに付着して浸透する無性胞子を介して宿主を攻撃し、宿主のヘモコエルに侵入して増殖する。宿主は、最終的に血リンパ栄養素の枯渇のために、または真菌によって放出される毒性代謝産物によって引き起こされる毒素血症の結果として死亡する。死後、理想的な環境条件下で、真菌は宿主死体5,6の外表面(明白な真菌症)に出現する。
残留化学物質が人間の健康、環境汚染、および害虫抵抗性の開発に及ぼす悪影響に関する懸念の高まりは、化学ベースの殺虫剤の投入を減らし、作物保護と害虫駆除のための代替的で斬新で持続可能な戦略を見つける世界的な推進力をもたらしました6,7,8 .これは、従来の化学防除よりも生態学的に有利な戦略である統合害虫管理(IPM)プログラムで使用するための微生物ベースの殺虫剤を開発する機会を提供しました3,8。
農業害虫のための微生物防除剤の開発を成功させるためには、まず適切な生物を単離し、特徴付け、同定し、標的害虫に対するその病原性を確認しなければならない。しかしながら、微生物剤の大規模生産のための容易で費用対効果の高い方法は、生物学的制御プログラム9、10、11、12、13において使用するための生存可能な生成物を製造するために必要とされる。相当量の良質の昆虫病原体の大量生産は、微生物株、環境、標的害虫、製剤、市場、施用戦略、および所望の最終製品に依存する14、15、16。EPFは、胚芽胞子を生成するための液体基質発酵または空中分生子6、17、18を生成する固体基質発酵プロセスを使用して大量生産することができる。しかし、昆虫病原体の大量生産および製剤化プロセスは、最終製品の病原性、コスト、貯蔵寿命、および現場有効性に直接影響する。IPMでの使用を成功させるためには、昆虫病原体の生産プロセスは、実行が容易で、最小限の労力を必要とし、毒性、生存可能、および持続性の高収量濃度のプロパグルを生産し、低コストでなければならない4,13,14,16。
昆虫病原体の栄養要件を理解することは、すべての培養方法による大量培養にとって重要である4,12。生産培地の栄養成分は、生物防除有効性、収量、乾燥耐性、および持続性を含む、結果として生じるプロパグルの属性に重大な影響を及ぼす8、19、20、21。生産手順の最適化は、このような要因に対処するように設計されています 22.EPFにとって、真菌分生子の良好な成長、胞子形成、および大量生産のための主な要件は、適切な水分、最適な成長温度、pH、CO2およびO2のガス交換、ならびに良好なリン、炭水化物、炭素、および窒素源を含む栄養である18。
JaronskiとJackson18は、自然条件下では、真菌の分生子が昆虫の死体の表面のような固体直立構造に担がれるため、固体基質発酵法を液体基質発酵法と比較してEPF生産のための自然プロセスに最も効率的かつ最も近い近似法として記述している。デンプンを含む農産物および副産物は、真菌が菌糸先端からの高濃度加水分解酵素の分泌を介してデンプンを容易に分解し、固体物質に浸透し、物質中に存在する栄養素にアクセスするため、主に低クレアリア菌の大量生産に使用されている11、17、18、23.穀物製品はまた、それらが水和および滅菌されると、基質が任意の液体媒体16、18、24からさらなる栄養素を吸収することができるので、健康なバイオマス生産のための要件を提供する。
以前は、いくつかの研究がボーベリア・バッシアナ(Bals)のようなEPF種を大量培養しようと試みた。Vuil., Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. Shrestha & Spatafora, Verticillium lecanii (Zimm.)ViegasとMetarhizium anisopliae(Metschn)の一部。ソロキン種複合体は、種々の基質16、23、24上に単離する。このような大量生産され商業的に開発された分離株には、M. anisopliae var Metarhizium acridum (Driver & Milner) J.F. Bisch, Rehner & Humberから開発されたGreen Muscle®(株IMI 330189)、Metarhizium 69(Meta 69株ICIPE69)、およびM. anisopliaeから開発されたReal Metarhizium 69(L9281)、およびB. bassiana25,26から開発されたBroadband® (株PPRI 5339)およびEco-Bb®が含まれる。.しかし、Metarhizium robertsii J.F. Bisch、S.A. Rehner & Humber、Metarhizium pinghaense Chen & Guoを大量培養する試みは限定的である。これら2つの分離株は、以前の研究で、ミツバチ、Pseudococcus viburni Signoret(半翅目:Pseudococcidae)の防除に最も効果的であるものとして選択されました27。したがって、現在の研究は、害虫に対する商業的適用のために、M. robertsiiおよびM. pinghaenseの局所分離株の十分な数の弾力性のある感染性プロパグルを処方し、大量生産することを目的としていた。固体基質発酵法を用いて、両方のEPF分離株について真菌分生子を大量生産した。2つのEPF接種法は、分生子懸濁液および胚芽胞子の液体真菌培養物を使用して、固体基質を接種するために使用した。
Protocol
Representative Results
Discussion
農業生態系における重要な農業害虫の生物学的防除のための微生物剤の統合の成功は、実験室条件下での第一歩としての昆虫病原体の成功と大量生産の容易さの両方に依存する。EPFの大量生産は、生物学的制御9、10、11、12、13を用いたIPMプログラムのためのEPF製品の大?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、このプロジェクトに資金を提供してくれたHort Pome、Hort Stone、およびTechnology and Human Resources for Industry Programme(THRIP:TP14062571871)に感謝したい。
オルシド:
レトディ・L・マトゥルウェ http://orcid.org/0000-0002-5118-3578
アントワネット・P・マラン・http://orcid.org/0000-0002-9257-0312
ノマコルワ・F・ストクウェ http://orcid.org/0000-0003-2869-5652
Materials
| 0.05% Tween 20 | Lasec | Added to conidial suspensions to allow fungal spores to mix with water | |
| 20 mL McCartney bottles | Lasec | Used to make conidial suspensions | |
| Aluminium foil | Used as a cover of the cotton wool plugs on 250-mL flask | ||
| Autoclave | Used to sterilize materials and ingredients used for the conidia production process | ||
| Autoclave bags | Lasec | Fermentation bags or solid substrate containers | |
| Autoclave tape | Lasec | To secure PVC pipes on the fermentation bags | |
| Brown Kraft paper bags | Used to dry conidia cultures on agricultural grains | ||
| Bunsen burnner | Labnet (Labnet International, Inc.) | Used to flame equipment (surgical blades,inoculating loops and rims of flasks) | |
| Clear edge test sieve | Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates | ||
| Corn steep liquor | SIGMA | 66071-94-1 | Ingredient of the blastospore liquid medium |
| Cotton Wool | Lasec | Used as plug of the neck for fermentation bags | |
| Duran laboratory bottles | Neolab | Used to autoclave SDA medium and distilled water | |
| Electrical tape | Used to tape and seal the sieve joints to prevent the escape of conidial dust | ||
| ENDECOTTS test sieve | Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates | ||
| Erlenmeyer Flasks, Narrow neck,250-mL flask | Lasec | Carrier of the blastospore liquid medium | |
| Ethanol (99%) | Lasec | Used to sterilize surgical blades and inoculating loops | |
| Flaked barley | Health Connection Wholefoods | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Flaked oats | Tiger brands | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Glucose | Merck | Ingredient of the blastospore liquid medium | |
| Growth Chamber/ incubators | For growing fungal conidia culture | ||
| Haemocytometer | Used to determine conidial concentrations | ||
| Inoculating loops | Lasec | For harvesting spores to innoculate liquid medium for blastospores growth | |
| Kitchen rolling pin | Used to manipulate the solid grain substrate bed | ||
| Laminar flow Cabinet | ESCO Laminar Flow Cabinet | Provide as sterile environment during substrate inoculation | |
| Metarhizium pinghaense conidia | Stellenbosch University | 5HEID | Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium pinghaense |
| Metarhizium robertsii conidia | Stellenbosch University | 6EIKEN | Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium robertsii |
| Microscope | ZEIZZ (Scope. A1) | Used to determine conidial concentrations and conidial viability | |
| Orbital shaker | IncoShake- LABOTEC | Used for the blastospore production process | |
| Parboiled rice | Spekko | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Penicillin-Streptomycin | SIGMA | Added to the SDA medium to prevent bacterial contamination | |
| Petri-dishes | Lasec | Containers for the SDA medium | |
| Pipettes and pipette tips | Labnet (BioPette PLUS) | Used to measure liquids ingredients | |
| Polyvinylchloride Marley waste pipe | Used to create a neck for the fermentation bag | ||
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | SIGMA-ALDRICH | Ingredient of the blastospore liquid medium | |
| Rubber band | Used to secure the secure the surgical paper over the fermentation bag PVC pipe necks | ||
| Sabaroud dextrose agar (SDA) | NEOGEN Culture Media | Medium used to culture spores of both Metarhizium pinghaense and Metarhizium robertsii | |
| Sterile distilled water | To hydrate agricultural grains, to make conidial suspensions | ||
| Sticky pad | Used to secure the seives on the vibratory shaker | ||
| Surgical blade | Lasec | Used to scrape off spores from fungal cultures | |
| Surgical paper | Lasec | Used to cover the PVC necks and cotton wool plugs of the fermentation bag | |
| Vibratory shaker | Used to shake conidia off the agricultural grain substrates | ||
| Vortex mixer | Labnet (Labnet International, Inc.) | Used to mix conidial suspensions in Mc Cartney bottles | |
| Yeast extract | Biolab | Added to the SDA medium to improve spore germination and growth | |
| Zipper-lock bags | GLAD | Used to to store harvested fungal conidia |
References
- Shah, P. A., Pell, J. K. Entomopathogenic fungi as biological control agents. Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5), 413-423 (2003).
- Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. A review of the biology and control of the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae), with special reference to biological control using entomopathogenic fungi and nematodes. African Entomology. 29 (1), 1-16 (2020).
- Ibrahim, L., Laham, L., Touma, A., Ibrahim, S. Mass production, yield, quality, formulation and efficacy of entomopathogenic Metarhizium anisopliae conidia. Current Journal of Applied Science and Technology. 9 (5), 427-440 (2015).
- Banu, J. G., Rajalakshmi, S. Standardisation of media for mass multiplication of entomopathogenic fungi. Indian Journal of Plant Protection. 42 (1), 91-93 (2014).
- Roberts, D. W., Humber, R. A., Cole, G. T., Kendrick, W. B. Entomogenous fungi. Biology of Conidial Fungi. , 201-236 (1981).
- Feng, M. G., Poprawski, T. J., Khachatourians, G. G. Production, formulation and application of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana for insect control. Current status. Biocontrol Science and Technology. 4 (1), 3-34 (1994).
- Karanja, L. W., Phiri, N. A., Oduor, G. I. Effect of different solid substrates on mass production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae entomopathogens. The Proceedings of the12th KARI Biennial Scientific Conference. , 8-12 (2010).
- Prasad, C. S., Pal, R. Mass production and economics of entomopathogenic fungus, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae and Verticillium lecanii on agricultural and industrial waste. Scholars Journal of Agriculture and Veterinary Sciences. 1 (1), 28-32 (2014).
- Ehlers, R. U. Mass production of entomopathogenic nematodes for plant protection. Applied Microbiology and Biotechnology. 56 (5), 623-633 (2001).
- Pham, T. A., Kim, J. J., Kim, S. G., Kim, K. Production of blastospore of entomopathogenic Beauveria bassiana in a submerged batch culture. Mycobiology. 37 (3), 218-224 (2009).
- Bhadauria, B. P., Puri, S., Singh, P. K. Mass production of entomopathogenic fungi using agricultural products. The Bioscan. 7 (2), 229-232 (2012).
- Latifian, M., Rad, B., Amani, M. Mass production of entomopathogenic fungi Metarhizium anisopliae by using agricultural products based on liquid-solid diphasic method for date palm pest control. International Journal of Farming and Allied Sciences. 3 (4), 368-372 (2014).
- Agale, S. V., Gopalakrishnan, S., Ambhure, K. G., Chandravanshi, H., Gupta, R., Wani, S. P. Mass production of entomopathogenic fungi (Metarhizium anisopliae) using different grains as a substrate. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 7 (1), 2227-2232 (2018).
- Jackson, M. A. Optimizing nutritional conditions for the liquid culture production of effective fungal biological control agents. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 19 (3), 180-187 (1997).
- Deshpande, M. V. Mycopesticides production by fermentation. Potential and challenges. Critical Reviews in Microbiology. 25 (3), 229-243 (1999).
- Sahayaraj, K., Namasivayam, S. K. R. Mass production of entomopathogenic fungi using agricultural products and by products. African Journal of Biotechnology. 7 (12), 1907-1910 (2008).
- Feng, K. C., Liu, L. B., Tzeng, Y. M. Verticillium lecanii spore production in solid-state and liquid-state fermentations. Bioprocess Engineering. 23 (1), 25-29 (2000).
- Jaronski, S. T., Jackson, M. A., Lacey, L. A. Mass production of entomopathogenic Hypocreales. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology 2nd edition. , 255-284 (2012).
- Vega, F. E., Jackson, M. A., Mercandier, G., Poprawski, T. J. The impact of nutrition on spore yields for various fungal entomopathogens in liquid culture. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 19 (4), 363-368 (2003).
- El Damir, M. Effect of growing media and water volume on conidial production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Journal of Biological Sciences. 6 (2), 269-274 (2006).
- Pandey, A. K., Kanaujia, K. R. Effect of different grains as solid substrates on sporulation, viability and pathogenicity of Metarhizium anisopliae (Metschnikoff) Sorokin. Journal of Biological Control. 22 (2), 369-374 (2008).
- Kassa, A., et al. Whey for mass production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Mycological Research. 112 (5), 583-591 (2008).
- Sharma, S., Gupta, R. B. L., Yadavam, C. P. S. Selection of a suitable medium for mass multiplication of entomofungal pathogens. Indian Journal of Entomology. 64 (3), 254-261 (2002).
- Bich, G. A., Castrillo, M. L., Villalba, L. L., Zapata, P. D. Evaluation of rice by-products, incubation time, and photoperiod for solid state mass multiplication of the biocontrol agents Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Agronomy Research. 16 (5), 1921-1930 (2018).
- Price, R. E., Müller, E. J., Brown, H. D., D’Uamba, P., Jone, A. A. The first trial of a Metarhizium anisopliae var. acridum mycoinsecticide for the control of the red locust in a recognised outbreak area. International Journal of Tropical Insect Science. 19 (4), 323-331 (1999).
- Hatting, J. L., Moore, S. D., Malan, A. P. Microbial control of phytophagous invertebrate pests in South Africa. Current status and future prospects. Journal of Invertebrate Pathology. 165, 54-66 (2019).
- Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. Laboratory screening of entomopathogenic fungi and nematodes for pathogenicity against the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae). Biocontrol Science and Technology. , (2021).
- Inglis, G. D., Enkerli, J., Goettel, M. S. Laboratory techniques used for entomopathogenic fungi: Hypocreales. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , 189-253 (2012).
- Mehta, J., et al. Impact of carbon & nitrogen sources on the Trichoderma viride (Biofungicide) and Beauveria bassiana (entomopathogenic fungi). European Journal of Experimental Biology. 2 (6), 2061-2067 (2012).
- Burges, H. D. Formulation of mycoinsecticides. Formulation of Microbial Biopesticides. , 131-185 (1998).
