Summary
Entomopatojenik mantarlar tarımsal böcek zararlılarının biyolojik kontrol ajanları olarak önem kazanmıştır. Bu çalışmada, hem Metarhizium robertsii hem de M. pinghaense'nin Güney Afrika izolatlarının yeterli sayıda dirençli enfektif propagülünün böcek zararlılarına karşı ticari uygulama için seri üretimi, tarımsal tahıl ürünleri kullanılarak başarıyla gerçekleştirilmiştir.
Abstract
Metarhizium anisopliae tür kompleksinin entomopatojenik mantarları, tarımsal böcek zararlılarının biyolojik kontrol ajanları olarak önem kazanmıştır. Kimyasal böcek öldürücülere karşı haşere direncindeki artış, böcek öldürücülerin insan sağlığı üzerindeki olumsuz etkilerine ilişkin artan endişeler ve pestisitlerden kaynaklanan çevre kirliliği, bitki koruma ve haşere kontrolü için yeni sürdürülebilir stratejiler bulmak için küresel bir dürtüye yol açmıştır. Daha önce, Beauveria bassiana gibi entomopatojenik mantar (EPF) türlerini kitle kültürü girişimleri gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, böcek zararlılarına karşı kullanılmak üzere kitle kültürü Metarhizium robertsii ve M. pinghaense'ye sadece sınırlı girişimlerde bulunulmuştur. Bu çalışmada, M. robertsii ve M. pinghaense'nin Güney Afrika izolatlarının ticari uygulama için yeterli sayıda dirençli enfektif propagusunun seri olarak üretilmesi amaçlanmıştır. EPF katı fermantasyon substratları olarak üç tarımsal tahıl ürünü, pul pul yulaf, pul pul arpa ve pirinç kullanılmıştır. Katı substratları aşılamak için iki aşılama yöntemi, konidiyal süspansiyonlar ve blastosporların sıvı mantar kültürü kullanıldı. Konidiyal süspansiyonlar kullanılarak yapılan aşılamanın nispeten daha az etkili olduğu gözlenmiştir, çünkü blastospor aşılama yönteminin kullanılmasına göre katı substratlarda artan kontaminasyon seviyeleri gözlenmiştir. Pul yulafın hem M. robertsii hem de M. pinghaense için uygun bir büyüme substratı olmadığı bulunmuştur, çünkü substrattan kuru konidia toplanmamıştır. Çırpılmış arpanın M. robertsii conidia'nın üretimini M. pinghaense'ninkine tercih ettiği bulundu ve substrattan ortalama 1.83 g ± 1.47 g kuru M. robertsii conidia ve sıfır gram M. pinghaense conidia toplandı. Pirinç tanelerinin, hem M. pinghaense hem de M. robertsii izolatlarının konidiyal seri üretimini desteklediği, sırasıyla substrattan toplanan ortalama 8.2 g ± 4.38 g ve 6 g ± 2 g olduğu bulunmuştur.
Introduction
Entomopatojenik mantarlar (EPF), önemli tarımsal böcek zararlılarının biyolojik kontrolünde bitki koruma ajanları olarak önem kazanmıştır 1,2. Toprakta doğal olarak bulunan entomopatojenler, çeşitli haşere türlerinin popülasyonlarında epizootiklere nedenolur 3. EPF türleri konakçıya özgüdür ve hedef olmayan türlere saldırma açısından nispeten az risk oluşturur ve çevre için toksik değildirler4. EPF, konakçılarını istila etmek ve yakın çevrelerinde yaymak ve kalıcı olmak için benzersiz bir mekanizmaya sahiptir1. Konağa esas olarak, konakçı hemokolunda istila etmek ve çoğalmak için konakçı kütikülüne bağlanan ve nüfuz eden aseksüel sporlar yoluyla saldırırlar. Konakçı sonunda hemolenf besin maddelerinin tükenmesi nedeniyle veya mantar tarafından salınan toksik metabolitlerin neden olduğu tokseminin bir sonucu olarak ölür. Ölümü takiben, ideal çevre koşullarında, mantar konakçı kadavranın dış yüzeyinde (açık mikoz)ortaya çıkar 5,6.
Kimyasal kalıntıların insan sağlığı, çevre kirliliği ve haşere direncinin gelişimi üzerindeki olumsuz etkilerine ilişkin artan endişeler, kimyasal bazlı böcek öldürücülerin girdilerini azaltma ve mahsul koruma ve haşere kontrolü için alternatif, yeni ve sürdürülebilir stratejiler bulma yönündeki küresel dürtüye yol açmıştır 6,7,8 . Bu, geleneksel kimyasal kontrolden daha ekolojik olarak elverişli stratejiler olan Entegre Haşere Yönetimi (IPM) programlarında kullanılmak üzere mikrobiyal bazlı insektisitler geliştirme fırsatları sağlamıştır 3,8.
Bir tarımsal haşere için başarılı bir mikrobiyal kontrol ajanı geliştirmek için, önce uygun bir organizma izole edilmeli, karakterize edilmeli, tanımlanmalı ve hedef haşere için patojenitesi doğrulanmalıdır. Bununla birlikte, biyolojik kontrol programlarında kullanılmak üzere uygun bir ürün üretmek için mikrobiyal maddenin büyük ölçekli üretimi için kolay, uygun maliyetli bir yöntem gereklidir 9,10,11,12,13. Önemli miktarlarda kaliteli entomopatojenlerin seri üretimi, mikrobiyal suşa, çevreye, hedef zararlıya, formülasyona, pazara, uygulama stratejisine ve istenen son ürüne bağlıdır14,15,16. EPF, blastosporlar üretmek için sıvı substrat fermantasyonu veya hava konidia 6,17,18 üretmek için katı substrat fermantasyon işlemi kullanılarak seri olarak üretilebilir. Bununla birlikte, entomopatojenlerin seri üretim ve formülasyon süreci, nihai ürünün virülansı, maliyeti, raf ömrünü ve saha etkinliğini doğrudan etkiler. IPM'de başarılı bir şekilde kullanılması için, entomopatojenlerin üretim sürecinin çalıştırılması kolay olmalı, minimum emek gerektirmeli, yüksek verimli virülan, canlı ve kalıcı propagules konsantrasyonu üretmeli ve düşük maliyetliolmalıdır 4,13,14,16.
Entomopatojenlerin beslenme gereksinimlerinin anlaşılması, tüm kültürleme yöntemleriyle kitle ekimi için önemlidir 4,12. Üretim ortamının besin bileşenleri, biyokontrol etkinliği, verim, kuruma toleransı ve kalıcılık 8,19,20,21 dahil olmak üzere ortaya çıkan propagüllerin özellikleri üzerinde önemli bir etkiye sahiptir. Üretim prosedürlerinin optimizasyonu bu faktörleri ele almak için tasarlanmıştır22. EPF için, iyi büyüme, sporülasyon ve mantar konidiasının seri üretimi için temel gereksinimler yeterli nem, optimum büyüme sıcaklığı, pH, CO2 ve O2'nin gaz değişimi ve iyi fosfor, karbonhidrat, karbon ve azot kaynakları dahil olmak üzere beslenmedir18.
Jaronski ve Jackson18, katı substrat fermantasyon yöntemini, sıvı substrat fermantasyon yöntemine göre EPF üretimi için doğal prosese en verimli ve en yakın yaklaşım yöntemi olarak tanımlamaktadır, çünkü doğal koşullar altında, mantar konidiyumu, böcek kadavralarının yüzeyi gibi katı dik yapılar üzerinde doğar. Tarımsal ürünler ve nişasta içeren yan ürünler çoğunlukla hipokrealli mantarların seri üretimi için kullanılır, çünkü mantarlar nişastayı hifal uçlarından yüksek konsantrasyonlu hidrolitik enzimlerin salgılanması, katı maddeye nüfuz etmesi ve maddede bulunan besin maddelerine erişmesi yoluyla kolayca ayrışırlar11,17,18,23 . Tahıl ürünleri aynı zamanda sağlıklı biyokütle üretimi için gereksinimleri de sağlar, çünkü hidratlandıklarında ve sterilize edildiklerinde, substratlar herhangi bir sıvı ortamdan daha fazla besin maddesini emebilir16,18,24.
Daha önce, birkaç çalışma Beauveria bassiana (Bals.) gibi EPF türlerini kitle kültürüne çalıştı. Vuil., Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. Shrestha & Spatafora, Verticillium lecanii (Zimm.) Viegas ve Metarhizium anisopliae'nin bir kısmı (Metschn.) Sorokin türleri kompleksi çeşitli substratlar üzerinde izolatlar 16,23,24. Bu tür seri üretilen ve ticari olarak geliştirilen izolatlar arasında M. anisopliae var Metarhizium acridum (Driver & Milner) J.F. Bisch, Rehner & Humber, Metarhizium 69 (Meta 69 suşu ICIPE69) ve M. anisopliae'den geliştirilen Real Metarhizium 69 (L9281) ve B. bassiana25,26'dan geliştirilen Broadband® (suş PPRI 5339) ve Eco-Bb'den geliştirilen Yeşil Kas® (suş IMI 330189) ve Eco-Bb® bulunmaktadır. . Bununla birlikte, kitle kültürü Metarhizium robertsii J.F. Bisch., S.A. Rehner & Humber ve Metarhizium pinghaense Chen & Guo'ya sınırlı girişimlerde bulunulmuştur. Bu iki izolat, önceki bir çalışmada, mealybug, Pseudococcus viburni Signoret (Hemiptera: Pseudococcidae)27'nin kontrolünde en etkili olarak seçilmiştir. Bu nedenle, bu çalışma, böcek zararlılarına karşı ticari uygulama için M. robertsii ve M. pinghaense'nin yerel izolatlarının yeterli sayıda esnek enfektif propagülünün formüle edilmesini ve seri olarak üretilmesini amaçlamıştır. Katı substrat fermantasyon yöntemi, her iki EPF izolatı için mantar konidiasını seri üretmek için kullanıldı. Katı substratları aşılamak için konidiyal süspansiyonlar ve blastosporların sıvı mantar kültürü kullanılarak iki EPF aşılama yöntemi kullanıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mantar suşlarının kaynağı
- Güney Afrika'nın Western Cape eyaletindeki elma bahçelerinden toplanan M. pinghaense 5 HEID (GenBank Katılım numarası: MT367414/MT895630) ve M. robertsii 6EIKEN'in (MT378171/MT380849) Güney Afrika izole mantar suşlarını kullanın.
- Her EPF'nin kültürlerini, 1 g maya ekstresi (SDAY) ve 10 μL Streptomisin ile desteklenmiş 60 g Sabouraud dekstroz agar ortamı üzerinde izole edin.
NOT: EPF kültürlerini karanlıkta ± 25 °C kontrollü bir sıcaklıkta inkübe edin.
2. Metarhizium pinghaense ve M. robertsii konidiyal süspansiyon aşılama
- Katı substratların hazırlanması
- İki EPF izolatı için büyüme ortamı olarak pullanmış yulaf ve pul pul arpa olmak üzere iki tarım ürünü ve fermantasyon torbaları olarak otoklav torbaları (305 mm × 660 mm) kullanın.
- Otoklav torbasının açık ucundaki fermantasyon torbası için bir boyun oluşturmak üzere küçük bir polivinilklorür atık borusu (1000 mm × 50 mm) kullanın ve boruyu torbaya sabitlemek için otoklav bant kullanın.
- Fermantasyon sırasında yeterli gaz değişimine izin vermek için boruyu steril bir pamuk yünü tapası ile kapatın.
- Hem pullanmış yulafın hem de pullanmış arpanın kuru tanelerini (200 g) tartın ve fermantasyon torbalarına yerleştirin ve her torbaya 100 mL damıtılmış su ekleyin ve torbaların içeriğini iyice karıştırın.
- Otoklavlama ve sterilizasyondan önce nemi emmek için ıslak taneleri 15-30 dakika dinlendirin. Her tahıl tipi için altı torba hazırlayın ve kontaminasyonu önlemek için torbaları diğer otoklav torbalarına yerleştirin ve alt tabakaları 55 dakika boyunca 121 ° C'de otoklav yapın.
- Konidiyal süspansiyon inokulumunun hazırlanması
- Hem M. pinghaense hem de M. robertsii'nin mantar kültürlerinden 2-3 haftalık mantar konidiasını steril bir cerrahi bıçak kullanarak kazıyarak hasat edin.
- Toplanan mantar konidiasını 20 mL steril damıtılmış suda askıya alın,% 0.05 Tween 20 ile desteklenmiş ve konidiyal süspansiyonları 2 dakika boyunca vorteks ile karıştırın.
- 1 × 107 konidia / mL konsantrasyonda 20 mL konidiyal süspansiyon hazırlayın ve sırasıyla pul pul yulaf ve pul pul arpa katı substratlarını aşılayın.
NOT: Konidiyal konsantrasyonları belirlemek için bir hemositometre kullanın.
- Katı substratların aşılanması
- Pamuk yünü boyun tapalarını çıkararak her torbayı açın ve hazırlanan 20 mL konidiyal süspansiyonu soğutulmuş otoklavlanmış alt tabakaya ekleyin.
- Boyun tıkaçlarını kullanarak torbaları tekrar kapatın ve mantar inokulumun tahıl substratı ile eşit şekilde karışmasını sağlamak için torbanın içeriğine masaj yapın.
- Fermantasyon torbalarını ± 25 ° C'lik kontrollü bir sıcaklıkta inkübe edin ve kültür ile çevre arasında yeterli gaz alışverişini sağlayın.
NOT: Bu prosedür laminer bir akış kabini altında yapılmalıdır.
- Fermantasyon aşaması
- Aşılama ve inkübasyondan 2 gün sonra, görünür misel büyümesi meydana geldiğinde ve substrat büyüyen mantar tarafından kümelenmeye başladığında, fermantasyon torbalarındaki tahıl substratlarına manuel olarak masaj yapın.
NOT: Bu, mantarların vejetatif büyümesinin ilk erken aşamalarında misel dallanmasının gerçekleşmesine izin vermek için aşılanmış granülleri karıştırmak için yapılır. - Tahıl substrat yataklarının fiziksel heterojenliğinden ve substrat kütlesinin yatak kalınlığından kaçınmak için substrat yatağını manipüle etmek için bir mutfak oklavası kullanın.
NOT: İşlem, mantar sporu üretimini optimize eden ve yüzey alanını en üst düzeye çıkararak konidiyal verimi teşvik eden mantar metabolizmasını teşvik eder18. - Fermantasyon işlemini 4-5 haftaya kadar devam edecek şekilde bırakın ve fermantasyon işlemi sırasında gelişebilecek ve mantar konidia verimini büyük ölçüde etkileyebilecek herhangi bir beyaz vejetatif aşırı büyümenin varlığı için fermantasyon torbalarını her 2 günde bir kontrol edin.
NOT: Beyaz vejetatif aşırı büyüme içeren fermantasyon torbalarındaki fermantasyonu derhal sonlandırın ve mantar kültürlerini kurutun18.
- Aşılama ve inkübasyondan 2 gün sonra, görünür misel büyümesi meydana geldiğinde ve substrat büyüyen mantar tarafından kümelenmeye başladığında, fermantasyon torbalarındaki tahıl substratlarına manuel olarak masaj yapın.
3. Blastospor aşılama
- Blastospor üretimi ve aşılama
- Hem M. pinghaense hem de M. robertsii için 1 L damıtılmış su, 30 g glikoz, 20 g maya ekstresi, 4 g potasyum fosfat diabazik (K2HPO4), 15 mL mısır dik likörü ve 10 μg / mL antibiyotik Streptomisin içeren bir sıvı kültür ortamı hazırlayın.
- İlk önce, damıtılmış suyu ısıtın, kaynama noktasına ulaşmadan önce kapatın ve Streptomisin hariç bileşenlerin her birini tenceredeki sıcak suya ekleyin. Ortamı 3-4 dakika boyunca hafifçe kaynatın ve malzemelerin uygun şekilde karıştırılmasına izin vermek ve bazı bileşenlerin tencerenin dibine yerleşmesini önlemek için ortamı sürekli karıştırın.
- Ortamın toplam 100 mL'sini dokuz farklı 250-mL şişeye dökün ve her şişeye bir pamuk yünü tapası yerleştirin ve pamuk yününü bir tıpa olarak alüminyum folyo ile örtün (Şekil 1A).
- Şişelerdeki ortamı 121 ° C'de 55 dakika otoklav yapın. Otoklavlamayı takiben, şişelerdeki ortamın soğumasını bekleyin ve her şişedeki ortama 10 mg / mL Streptomisin ekleyin (Şekil 1B).
- Hem EPF izolatları, M. pinghaense hem de M. robertsii için 2-3 haftalık mantar kültürü plakalarından iki ila üç bakteriyel mantar konidia döngüsü toplayın ve steril koşullar altında 250 mL şişelerdeki her 100 mL sıvı ortama aktarın ve şişeleri kapatın.
- Sıvı kültür şişelerini ± 25 ° C'de, 3 gün boyunca 140 rpm'de yörüngesel bir çalkalayıcıda inkübe edin ve kültürler mantar blastospor büyümesi ile yüksek bulanıklık belirtileri gösterdiğinde inkübasyonu durdurun (Şekil 1C).
- Kültürlerden kaynaklanan olası herhangi bir bakteriyel kontaminasyonu tespit etmek için, inkübasyon sırasında 24 saat sonra her sıvı kültür şişesinden 100 μL'lik bir numune alın ve izole başına üç SDA plakasına plaka koyun. Plakaları 48 saat boyunca, ± 25 ° C'lik kontrollü bir sıcaklıkta inkübe edin.
- Katı substratın hazırlanması
- Hem M. pinghaense hem de M. robertsii'nin blastosporları için katı bir substrat ortamı olarak kaynatılmış uzun taneli beyaz pirinç kullanın (Jaronski ve Jackson18'den uyarlanmıştır).
- Fermantasyon torbalarını yukarıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, 2.1.1-2.1.3 adımlarında hazırlayın ve her torba için 1 kg pirinç ve 300 mL steril damıtılmış su ekleyin.
- Fermantasyon torbalarının içeriğini yavaşça karıştırın ve dış otoklav torbalarına dik konumda yerleştirin ve otoklav 55 dakika boyunca 121 ° C'de otoklav yapın. Otoklavlamayı takiben, substratların steril koşullar altında 45 dakika ± soğumasını bekleyin.
- Aşılama ve fermantasyon
- Hem M. pinghaense hem de M. robertsii'nin sıvı kültür şişelerinin her birinin kapağını laminer bir akış altında çıkarın ve her şişenin kenarını 10 sn boyunca alevlendirin.
- 100-mL sıvı kültürleri, pamuk yünü tapalarını boyunlarından çıkararak fermantasyon torbalarına dökün (Şekil 2). Pamuklu tapaları tekrar takın ve torbanın boynunun üst kısmını lastik bir bantla sabitlenmiş cerrahi kağıtla örtün.
NOT: Bir hemositometre kullanarak her şişe için blastospor konsantrasyonunu belirleyin ve substratları28 noküle etmek için 1 × 107 - 5 × 108 blastospor / mL blastospor konsantrasyonlarını kullanın. - Torbanın üst kısmını bükün ve substratın masaj yoluyla sallanarak ve hafif manipülasyonunu yaparak torbanın içeriğini karıştırın ve kalın yatak oluşumunu önlemek için substratı torbalarda düzleştirerek torbaları ± 25 ° C'de inkübe edin18.
- Substratı, torbaların içeriğine masaj yaparak, aşılama ve inkübasyondan 2-3 gün sonra, görünür misel büyümesi ve substratın mantar tarafından bağlanması meydana geldiğinde (Jaronski ve Jackson18'in tekniğinden uyarlanmıştır) fermantasyon torbalarında kırın.
NOT: Fermantasyonun 4 hafta boyunca devam etmesine izin verin.
Resim 1: 250-mL şişelerde sıvı kültür ortamı . (A) Otoklavlamadan önce. (B) EPF sporları ile otoklavlama ve aşılamadan sonra. (C) Mantar blastosporları içeren bulanık ortam. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: Hazırlanmış blastospor sıvı kültür ortamı. (A) Metarhizium robertsii ve (B) Pirincin katı bir substrat olarak aşılanmasından önce Metarhizium pinghaense. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
4. Mantar kültürlerinin kurutulması
- Mantar kültürlerini, fermantasyondan sonraki 10-12 gün boyunca, denemelerde kullanılmadan önce, sporlandırılmış kültürleri 26-30 kg (30 x 43 x 15250cm3) kahverengi kağıt torbalara aktararak kurutun.
- Kağıt torbaların çekme dayanımını artırmak için, her torbanın üst kısmının üçte birini yatay olarak kesin ve torbanın alt kısmını hizalayın (Şekil 3A, B).
Şekil 3: Kağıt torbaların hazırlanması, kültürlerin kurutma işlemi ve paketleme. (A,B) Kahverengi kese kağıtların hazırlanması. (C,E) kaynatılmış pirinç ve (D,F) pul pul arpa üzerinde yetiştirilen Metarhizium türü kültürlerinin kurutma işlemi. (G) Üçgen bir çadır yapısı oluşturmak için zımbalarla kapatılmış kağıt torbalar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- Her fermantasyon torbasındaki substratı yavaşça parçalayın, her torbanın köşesini kesin ve tüm kültürü, kesme köşesinin bıraktığı boşluktan kağıt torbalara aktarın (Şekil 3C-F). Mantar sporlarının havaya aşırı kaçmasını önlemek için, bu işlemi yavaşça gerçekleştirin.
NOT: Kontaminasyonu önlemek için bu işlemi steril koşullar altında, laminer akış kullanarak gerçekleştirin. - Her bir kağıt torbayı etiketleyin ve her torbanın üst ucuna iki kez katlayın ve üçgen bir çadır yapısı oluşturmak için zımbalarla kapatın ve torbaları, 25 ° C'± kontrollü bir sıcaklıkta ve% 30-40'lık düşük nemde düzgün, hatta kurumaya izin vermek için tel kurutma raflarına yerleştirin.
- Kültürlerin eşit kurumasına izin vermek ve hasat edilebilir mantar sporlarının verimini düşürecek herhangi bir vejetatif yeniden büyümeden kaçınmak için torbaları günlük olarak çevirin.
- Kurutma işlemi sırasında her bir kurutma torbasını her 2 günde bir tartın ve birbirini izleyen günler arasında torbaların kütlesinde çok az değişiklik gözlenene kadar veya hiç değişiklik gözlenmeyene kadar her torba için kurutma işlemine devam edin.
5. Mantar konidia hasadı
- Bir toplama tavasına monte edilmiş ETS örgü no. 100 (150-μm diyafram açıklığıyla) üzerine yuvalanmış üç iç içe geçmiş elek (500-μm diyafram açıklığında), bir test eleği (500-μm diyafram açıklığında), bir test eleği (500-μm diyafram açıklığında) kullanarak mantar konidiasını kültürlerden mekanik olarak hasat edin.
- Kuru kültür numunesini ETS ağ no. 35 elek üzerine yavaşça yükleyin ve mantar konidiasının havaya salınmasını önlemek için elek üzerine bir kapak yerleştirin.
- Mantar konidiasının ağ ekranlarından geçişine yardımcı olmak için eleklere 10-12 cam mermer ekleyin ve konidianın elek içinde tutulmasını önleyin, bu da spor iyileşmesinin azalmasına neden olabilir.
- Konidiyal tozun kaçmasını önlemek için elek bağlantılarını elektrik bandı kullanarak bantlayın ve kapatın.
- Elekleri yapışkan bir ped ile donatılmış titreşimli bir çalkalayıcıya yerleştirin, toplama tavasını ve elekleri 20-25 dakika boyunca, dakikada 560-640 titreşimlik bir hareketle sabitlemek için (Şekil 4).
NOT: Jaronski ve Jackson18'den uyarlanmış teknik.
Şekil 4: Kurutulmuş Metarhizium robertsii kültürlerinden mantar sporlarının pirinç ve pul pul arpa üzerinde toplanması. (A) Mantar konidiasının ağ ekranlarından geçişine yardımcı olmak için eleklere 10-12 cam mermer eklenir. M. robertsii conidia (B) pirinç üzerine kültürlerden hasat edildi ve (C) zar zor pul pul döküldü. (D) Titreşimli çalkalayıcıda elenir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- Test eleklerini toplama tavasından çıkarın, konidia toplayın ve toplanan konidiayı uzun süreli depolama için (3-6 ay) hava geçirmez ve su geçirimsiz fermuar kilidi torbalarında saklayın.
6. Üretilen mantar konidiasının nicelleştirilmesi
- Her bir substrattan mantar konidiasının toplanmasından önce her bir tahıl substratının kütlesini ölçün ve kaydedin.
- Toplanan sporların kütlesini katı substratın kütlesinden çıkararak toplanan konidianın toplam ağırlığını ölçün.
NOT: Toplam konidia verimi sadece hasat edilen konidiayı değil, aynı zamanda katı substrat üzerinde kalan fungal konidiayı da içerir. - Substratı tartın ve tartılan substrattan 10 g çıkarın. Substratın 10 gramını% 0.05 Aralık 20'de askıya alın ve 10 mL steril damıtılmış suda seyreltin.
- Vorteks-süspansiyonu 2 dakika boyunca karıştırın ve substrattan yıkanan konidia sayısını belirlemek için spor sayımını yapmak için bir hemositometre kullanın.
- 10 mL seyreltme süspansiyonu oluşturmak için 10 mL yıkanmış konidiyal süspansiyonun 1000 μL'sini 9 mL steril damıtılmış suya aktararak daha fazla seyreltme yapın.
- Konidiyal süspansiyonları 2 dakika boyunca vorteks-karıştırın ve konidiyal konsantrasyonları belirleyin.
NOT: Süspansiyonların konidiyal konsantrasyonunu belirlemek için Inglis, Enkerli ve Goettel30 tarafından açıklanan prosedürü ve formülü izleyin. - Her kültürden toplanan konidiyal tozun toplam 0.1 g'ını,% 0.05 Ara 20 ile desteklenmiş 10 mL steril damıtılmış suda toplayın ve askıya alın ve konidiyal süspansiyonu 2 dakika boyunca vorteks-karıştırın ve bir hemositometre kullanarak konidiyal konsantrasyonu belirleyin.
- 10 mL konidiyal süspansiyonun 1000 μL'sini, 10 mL süspansiyon seyreltmelerini oluşturmak için 9 mL steril damıtılmış suya aktararak daha fazla seyreltme yapın.
- Konidiyal süspansiyonları 2 dakika boyunca vorteks-karıştırın, konidiyal konsantrasyonları hesaplayın ve gram başına konidia sayısını belirleyin.
- Hasat edilen tozun gramı başına konidia sayısını, hasat edilen konidiyal tozun başlangıç kütlesi ile çarpın. Substrattan yıkanan konidia sayısını, harcanan substratın toplam ağırlığı ile çarpın, konidianın hasat edildiği substrattır.
- Verilen iki değeri bir araya getirin ve18 numaralı substratın kg veya g başına konidia sayısını hesaplamak için substratın ilk kuru ağırlığına bölün.
NOT: Hesaplamalar esas olarak pirinç substratı için yapılmıştır. Çimlenme veya konidiyal canlılık testi, üretilen konidianın yaşayabilirliğini belirlemek için hem M . pinghaense hem de M. robertsii izolatları için yapıldı.
7. Veri analizi
- Elde edilen sonuçların istatistiksel analizini yapmak için uygun bir bilgisayar yazılımı programı kullanın.
NOT: Verilerin istatistiksel analizi STATISTICA sürüm 13.5.0.17 kullanılarak yapılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hem M. pinghaense hem de M. robertsii için pirinç üzerindeki kültürlerin içerik kütlesinde bir düşüş, mantar kültürlerinin kuruma aşamasında zamanla gözlenmiş, kültürler kuruduktan sonra kütlede hiç veya çok az değişiklik gözlenmiştir (Şekil 5). Hem M. pinghaense hem de M. robertsii'nin hasat edilmiş kuru fungal conidia tozu Şekil 6'da gösterilmiştir.
Şekil 5: Metarhizium robertsii ve M. pinghaense kültürlerinin pirinç üzerindeki torba içerik kütlesindeki değişim (%95 güven aralığı) 10 gün içinde (ANOVA; F5,35 = 2,21 ; p = 0,08). Çubukların üzerindeki farklı harfler, torba içerik kütlesinde günler içinde elde edilen anlamlı farkı (p < 0.05) gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Hasat edilmiş konidia. (A) Toplama tavasında hasat edilen konidia. (B) Metarhizium robertsii. (C) M. pinghaense. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Hem M. pinghaense hem de M. robertsii için her bir tahıl türünden toplanan ortalama konidiyal tozda anlamlı bir fark gözlenmemiştir. Her ikisi için de hasat edilen kuru konidia, hem M. pinghaense hem de M. robertsii için ortalama% >90 konidiyal canlılığa sahipti. Pirinç substratında, M. pinghaense ortalama 8.2 g ± 4.38 g konidiyal toz üretti ve bu da M. robertsii için elde edilen miktarı biraz aştı (6 g ± 2 g). Pullanmış arpa substratından ortalama 1.83 g ± 1.47 g kuru M. robertsii conidia hasat edilirken, substrattan sıfır M. pinghaense hasat edildi. Pullanmış yulaf substratından M. pinghaense veya M. robertsii için kuru mantar konidiası toplanmamıştır (Şekil 7).
Şekil 7: Ortalama konidia tozu miktarı. Metarhizium pinghaense ve M. robertsii'nin ortalama konidia tozu miktarı, üç katı substrattan toplanan gram (% 95 güven aralığı) cinsinden ölçülür: yarı kaynatılmış pirinç, pullanmış arpa ve pul pul yulaf (ANOVA: F2,27 = 2.82; p = 0.08). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Pirinç tanelerinden toplanan gram başına tahmini ortalama konidiada M. pinghaense (3.51 x 10 7/g ± 0.43 x 10 7/g) ile M. robertsii (4.31 x 107/g ± 0.38 x 107/g) arasında anlamlı bir fark gözlenmiştir. M. robertsii, gram başına ortalama konidia sayısı, M. pinghaense'den biraz daha yüksekti (Şekil 8).
Şekil 8: Gram başına ortalama konidia. Pirinç kültürlerinden Metarhizium pinghaense ve M. robertsii için gram başına tahmini ortalama konidia (% 95 güven aralığı) (ANOVA: F 1,7 = 8.47; p = 0.02). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Harcanan pirinç substratında bulunan tahmini konidia sayısında M. pinghaense (5.02 x 10 7/mL ± 1.47 x 10 7/mL) ile M. robertsii (3.70 x 107/mL ± 0.91 x 107/mL) arasında anlamlı bir fark gözlenmedi (Şekil 9). Bununla birlikte, M. pinghaense, pirinç substratında M. robertsii'den biraz daha fazla sayıda konidia vardı.
Şekil 9: Ortalama fungal konidia. Metarhizium pinghaense ve M robertsii'nin tahmini ortalama fungal konidiası, harcanan pirinç kültürü substratlarında bulunan kültürlerden (F1,7 = 2.45; p = 0.16) %95 güven aralığı). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Pirinç substrat kültürlerinden elde edilen M. pinghaense (5.09 x 10 7/g ± 1.35 x 10 7/g) ile M. robertsii (3.55 x 10 7/g ± 0.85 x 10 7/g) arasında tahmini toplam konidia veriminde anlamlı bir fark gözlenmedi. Bununla birlikte, M. pinghaense, daha düşük bir konidiyal verim üreten M. robertsii'den biraz daha yüksek bir konidiyal verim üretti (Şekil 10).
Şekil 10: Toplam konidia verimi. Metarhizium pinghaense ve M. robertsii'nin pirinç üzerindeki kültürlerden tahmini toplam konidia verimi (% 95 güven aralığı) (F1,7 = 3.91; p = 0.09). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Önemli tarımsal böcek zararlılarının biyolojik kontrolü için mikrobiyal ajanların bir agroekosisteme başarılı bir şekilde entegre edilmesi, laboratuvar koşullarında ilk adım olarak entomopatojenlerin hem başarısına hem de seri üretiminin kolaylığına bağlıdır. EPF'nin seri üretimi, biyolojik kontrol 9,10,11,12,13 kullanan IPM programları için EPF ürünlerinin büyük ölçekli uygulaması ve kullanılabilirliği için önemlidir. Farklı EPF izolatlarının seri üretiminin başarısı, üretim substratının veya ortamının besin bileşenlerinden etkilenir ve bu da elde edilen konidianın etkinlikleri, kuruma toleransı, alan kalıcılığı ve konidiyal verim dahil olmak üzere özelliklerini önemli ölçüde etkiler 8,19,20,21 . Bu nedenle, yetiştirme ve fermantasyon işlemi sırasında seri üretilen entomopatojenlerin beslenme gereksinimleri hakkında bilgi geliştirmek önemlidir29.
Bu çalışmada, hem M. robertsii hem de M. pinghaense'nin seri üretimi, fermantasyon substratları olarak üç farklı tarım ürünü kullanılarak gerçekleştirilmiştir: yarı kaynatılmış pirinç, pullanmış arpa ve pul pul yulaf. Üç farklı tahıl substratının, mantar izolatlarının konidiyal verimini önemli ölçüde etkilediği gözlenmiştir. Yarı kaynatılmış pirinç, her iki izolatın seri üretimi için oldukça elverişliyken, pullanmış arpa taneleri sadece M. robertsii'nin üretimini tercih ediyordu. Gözlemler, fermantasyonu takiben kuru fungal konidia tozunun verimine dayanarak yapıldı. Çok az ya da hayır, conidia fermantasyondan sonra pullanmış yulaftan toplandı. Pullanmış yulafların, fermantasyon işlemi sırasında fermantasyon torbalarında daha yüksek nem seviyelerini koruduğu bulunmuştur, bu da tahılın M. pinghaense ve M . robertsii'nin üretimi için bir substrat olarak gözlemlenen düşük performansına neden olabilir. Pullanmış yulaf substratı, bazı durumlarda mantar izolatlarının beyaz vejetatif misel aşırı büyümesine eğilimliydi, bu da aşırı büyümeyi içeren fermantasyon torbalarında sporülasyon meydana gelmediğinden, konidiyal verimi büyük ölçüde etkiledi. Pullanmış yulaf substratına sahip fermantasyon torbalarının, pul pul arpa substratları içeren fermantasyon torbalarına göre yüksek düzeyde bakteriyel kontaminasyona sahip olduğu gözlenmiştir.
M. pinghaense'nin substrat olarak pullanmış arpa kullanılarak seri üretimi ile ilgili yüksek düzeyde saprofitik mantar veya maya kontaminasyonu gözlenmiştir. Saprofitik mantar kontaminasyonu, fermantasyon işleminin daha sonraki bir aşamasında, substratı aşılamak için kullanılandan başka bir mantarın büyümesi ve konidiogenezi yoluyla gözlenmiştir. Konidiyal sporülasyondan önce, fermantasyonun ilk aşamasında substrat kontaminasyonunu teşhis etmek zordu. Fermantasyon işlemi sırasında bakteri ve maya kontaminasyonunun, substrattaki ıslak lekelerle kendini gösterdiği düşünülmektedir ve hem pullanmış yulaf hem de arpa taneleri, pirinç tanelerinden daha uzun süre nemi emme ve tutma eğilimindedir. Bu, bu iki substratın iki Metarhizium izolatının seri üretimi için fermantasyon substratları olarak kullanılmasının bir sınırlamasıydı.
Mevcut çalışma sırasında yapılan gözlemler, her bir tahıl substratını aşılamak için kullanılan aşılama yönteminin tipinin konidiyal üretimi etkilediğini göstermiştir. Konidiyal süspansiyon aşılama yönteminin nispeten daha az etkili olduğu bulunmuştur, çünkü aşılanmış pullanmış yulaf ve pul pul arpa, pirinç taneleri üzerinde sıvı kültürlü blastospor aşılama yönteminin kullanıldığı zamana göre artan bir kirlilik seviyesi göstermiştir. Sıvı kültürlü blastospor aşılama yönteminden farklı olarak, konidiyal süspansiyon yöntemi, substratların aşılanmasından önce süspansiyonlardaki olası kirleticilerin tespit edilmesine izin vermez, bu da fermantasyon torbalarında gözlenen yüksek kirlilik seviyelerine neden olur. Jaronski ve Jackson18 , substratın tam sterilizasyonunun olmaması, steril olmayan aşılama ve fermantasyon substratının torbalarda yanlış kullanılması gibi kullanılan substratların olası kontaminasyonuna yol açabilecek çeşitli faktörleri tanımlamıştır. Pullanmış arpa ve pul pul yulaf içeren fermantasyon torbalarında gözlenen kirlenme, otoklavlama işlemi sırasında meydana gelebilecek olan substratın tam sterilizasyonunun olmamasından da kaynaklanmış olabilir. Jaronski ve Jackson18 ayrıca, konidiyal süspansiyonların aşılayıcı olarak kullanılmasını, bir agar ortamından konidiyal hasat sırasında kontaminasyon şansının artmasına neden olduğu için dezavantajlı olarak tanımladı.
Tarlada, uygun konakçıların enfeksiyonu sırasında, mantar ilk olarak, böceklerin dış katı yüzeyinde ortaya çıkmadan ve sporülasyondan önce, çoğalma yoluyla böceklerin hemokelinde biyokütle oluşturur30. Böyle bir işlem, sıvı-blastospor fermantasyon yöntemi kullanılırken taklit edildi. Buna göre, et suyu böceğin hemokolunu, et suyunun mantar konidia ile aşılanması, böceğin ilk temasını ve enfeksiyonunu temsil etti ve et suyundaki blastosporların oluşumu, enfekte olmuş böceğin hemocoel'inde meydana gelen blastospor sürecinin çoğalmasını temsil etti. Pirinç tanelerinin son aşılaması ve mantarın zamanla tahıllar üzerindeki sporülasyonu, mantar böceğin kadavrasının içinden çıkmaya başladığında böceğin kütikülünde meydana gelenleri temsil ediyordu. Bu, sıvı blastospor fermantasyon yönteminin neden konidiyal süspansiyon aşılama yönteminden daha iyi çalıştığını açıklayabilir.
Jaronski ve Jackson18, pullanmış yulaf ve pul pul arpa tanelerini, pirinç tanelerine kıyasla, Metarhizium türlerinin kütle kültürü için tercih edilen tarımsal tahıllar olarak tanımladılar, çünkü iki tahıl türünün fermantasyon işlemi sırasında nem içeriğini korudukları bulundu. Bununla birlikte, mevcut çalışma, yukarıda belirtilen araştırmacıların gözlemleri ve sonuçlarıyla çelişmektedir, çünkü hem pullanmış yulaf hem de pullanmış arpa, M. pinghaense veya M. robertsii için iyi katı fermantasyon substratları olarak bulunmamıştır. Pirinç, her iki izolat için de iyi bir tahıl substratı olarak bulundu, çünkü önceki çalışmalarda önerildiği gibi, nihai ürünle karışabilecek küçük parçacıklara ayrışmadı.
Mevcut çalışma, Metarhizium türlerinin izolatlarının pirinç taneleri kullanılarak başarılı bir şekilde kültürlenebileceğini ve seri üretilebileceğini ve farklı tanelerin konidiyal sporülasyonu etkileme eğiliminde olduğunu ve farklı verim verdiğini göstermiştir. Bunun nedeni, farklı tanelerin bu tür beslenme bileşimi açısından farklılık göstermesi olabilir, örneğin karbon: azot oranları ve karbon konsantrasyonu. Karbon konsantrasyonu ve karbon: Bir büyüme ortamının azot oranının, konidia verimini ve ayrıca canlılık ve virülans açısından kalitesini etkilediği bilinmektedir22. Substratları aşılamak için kullanılan aşılama tekniklerinin, belirli tarımsal tahıl substratları üzerindeki EPF izolatlarının seri üretiminde elde edilen başarı derecesini de etkilediği gösterilmiştir. Bu nedenle, mevcut çalışmada açıklanan sıvı blastospor fermantasyon tekniğinin, hem M. pinghaense hem de M. robertsii izolatlarının seri üretimi için tarımsal tahıl substratları için en iyi aşılama yöntemi olduğu önerilmektedir. Böyle bir yöntemin kullanılması, aşılayıcıların kullanımından önce kontaminasyonun olası tespitine izin verir, bu da konidiyal süspansiyon aşılama tekniğinin kullanımına göre istenen EPF izolatının seri üretimini engelleyebilir. Pirinç tanelerinin, pul pul arpa ve pul pul yulaf yerine, hem M. pinghaense hem de M. robertsii'nin konidiasının seri üretimi için katı substratlar olarak kullanılması önerilir. Tarif edilen teknik, agroekosistemlerdeki önemli böcek zararlılarına karşı tarla koşullarında konidianın gelecekteki seri üretimi ve ticari uygulaması için önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, projeyi finanse ettikleri için Hort Pome, Hort Stone ve Endüstri için Teknoloji ve İnsan Kaynakları Programı'na (THRIP: TP14062571871) teşekkür eder.
ORCID:
Letodi L. Mathulwe http://orcid.org/0000-0002-5118-3578
Antoinette P. Malan http://orcid.org/0000-0002-9257-0312
Nomakholwa F. Stokwe http://orcid.org/0000-0003-2869-5652
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Tween 20 | Lasec | Added to conidial suspensions to allow fungal spores to mix with water | |
| 20 mL McCartney bottles | Lasec | Used to make conidial suspensions | |
| Aluminium foil | Used as a cover of the cotton wool plugs on 250-mL flask | ||
| Autoclave | Used to sterilize materials and ingredients used for the conidia production process | ||
| Autoclave bags | Lasec | Fermentation bags or solid substrate containers | |
| Autoclave tape | Lasec | To secure PVC pipes on the fermentation bags | |
| Brown Kraft paper bags | Used to dry conidia cultures on agricultural grains | ||
| Bunsen burnner | Labnet (Labnet International, Inc.) | Used to flame equipment (surgical blades,inoculating loops and rims of flasks) | |
| Clear edge test sieve | Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates | ||
| Corn steep liquor | SIGMA | 66071-94-1 | Ingredient of the blastospore liquid medium |
| Cotton Wool | Lasec | Used as plug of the neck for fermentation bags | |
| Duran laboratory bottles | Neolab | Used to autoclave SDA medium and distilled water | |
| Electrical tape | Used to tape and seal the sieve joints to prevent the escape of conidial dust | ||
| ENDECOTTS test sieve | Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates | ||
| Erlenmeyer Flasks, Narrow neck,250-mL flask | Lasec | Carrier of the blastospore liquid medium | |
| Ethanol (99%) | Lasec | Used to sterilize surgical blades and inoculating loops | |
| Flaked barley | Health Connection Wholefoods | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Flaked oats | Tiger brands | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Glucose | Merck | Ingredient of the blastospore liquid medium | |
| Growth Chamber/ incubators | For growing fungal conidia culture | ||
| Haemocytometer | Used to determine conidial concentrations | ||
| Inoculating loops | Lasec | For harvesting spores to innoculate liquid medium for blastospores growth | |
| Kitchen rolling pin | Used to manipulate the solid grain substrate bed | ||
| Laminar flow Cabinet | ESCO Laminar Flow Cabinet | Provide as sterile environment during substrate inoculation | |
| Metarhizium pinghaense conidia | Stellenbosch University | 5HEID | Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium pinghaense |
| Metarhizium robertsii conidia | Stellenbosch University | 6EIKEN | Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium robertsii |
| Microscope | ZEIZZ (Scope. A1) | Used to determine conidial concentrations and conidial viability | |
| Orbital shaker | IncoShake- LABOTEC | Used for the blastospore production process | |
| Parboiled rice | Spekko | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Penicillin-Streptomycin | SIGMA | Added to the SDA medium to prevent bacterial contamination | |
| Petri-dishes | Lasec | Containers for the SDA medium | |
| Pipettes and pipette tips | Labnet (BioPette PLUS) | Used to measure liquids ingredients | |
| Polyvinylchloride Marley waste pipe | Used to create a neck for the fermentation bag | ||
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | SIGMA-ALDRICH | Ingredient of the blastospore liquid medium | |
| Rubber band | Used to secure the secure the surgical paper over the fermentation bag PVC pipe necks | ||
| Sabaroud dextrose agar (SDA) | NEOGEN Culture Media | Medium used to culture spores of both Metarhizium pinghaense and Metarhizium robertsii | |
| Sterile distilled water | To hydrate agricultural grains, to make conidial suspensions | ||
| Sticky pad | Used to secure the seives on the vibratory shaker | ||
| Surgical blade | Lasec | Used to scrape off spores from fungal cultures | |
| Surgical paper | Lasec | Used to cover the PVC necks and cotton wool plugs of the fermentation bag | |
| Vibratory shaker | Used to shake conidia off the agricultural grain substrates | ||
| Vortex mixer | Labnet (Labnet International, Inc.) | Used to mix conidial suspensions in Mc Cartney bottles | |
| Yeast extract | Biolab | Added to the SDA medium to improve spore germination and growth | |
| Zipper-lock bags | GLAD | Used to to store harvested fungal conidia |
References
- Shah, P. A., Pell, J. K. Entomopathogenic fungi as biological control agents. Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5), 413-423 (2003).
- Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. A review of the biology and control of the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae), with special reference to biological control using entomopathogenic fungi and nematodes. African Entomology. 29 (1), 1-16 (2020).
- Ibrahim, L., Laham, L., Touma, A., Ibrahim, S. Mass production, yield, quality, formulation and efficacy of entomopathogenic Metarhizium anisopliae conidia. Current Journal of Applied Science and Technology. 9 (5), 427-440 (2015).
- Banu, J. G., Rajalakshmi, S. Standardisation of media for mass multiplication of entomopathogenic fungi. Indian Journal of Plant Protection. 42 (1), 91-93 (2014).
- Roberts, D. W., Humber, R. A. Entomogenous fungi. Biology of Conidial Fungi. Cole, G. T., Kendrick, W. B. , Academic Press. New York. 201-236 (1981).
- Feng, M. G., Poprawski, T. J., Khachatourians, G. G. Production, formulation and application of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana for insect control. Current status. Biocontrol Science and Technology. 4 (1), 3-34 (1994).
- Karanja, L. W., Phiri, N. A., Oduor, G. I. Effect of different solid substrates on mass production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae entomopathogens. The Proceedings of the12th KARI Biennial Scientific Conference. , Nairobi, Kenya. 8-12 (2010).
- Prasad, C. S., Pal, R. Mass production and economics of entomopathogenic fungus, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae and Verticillium lecanii on agricultural and industrial waste. Scholars Journal of Agriculture and Veterinary Sciences. 1 (1), 28-32 (2014).
- Ehlers, R. U. Mass production of entomopathogenic nematodes for plant protection. Applied Microbiology and Biotechnology. 56 (5), 623-633 (2001).
- Pham, T. A., Kim, J. J., Kim, S. G., Kim, K. Production of blastospore of entomopathogenic Beauveria bassiana in a submerged batch culture. Mycobiology. 37 (3), 218-224 (2009).
- Bhadauria, B. P., Puri, S., Singh, P. K. Mass production of entomopathogenic fungi using agricultural products. The Bioscan. 7 (2), 229-232 (2012).
- Latifian, M., Rad, B., Amani, M. Mass production of entomopathogenic fungi Metarhizium anisopliae by using agricultural products based on liquid-solid diphasic method for date palm pest control. International Journal of Farming and Allied Sciences. 3 (4), 368-372 (2014).
- Agale, S. V., Gopalakrishnan, S., Ambhure, K. G., Chandravanshi, H., Gupta, R., Wani, S. P. Mass production of entomopathogenic fungi (Metarhizium anisopliae) using different grains as a substrate. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 7 (1), 2227-2232 (2018).
- Jackson, M. A. Optimizing nutritional conditions for the liquid culture production of effective fungal biological control agents. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 19 (3), 180-187 (1997).
- Deshpande, M. V. Mycopesticides production by fermentation. Potential and challenges. Critical Reviews in Microbiology. 25 (3), 229-243 (1999).
- Sahayaraj, K., Namasivayam, S. K. R. Mass production of entomopathogenic fungi using agricultural products and by products. African Journal of Biotechnology. 7 (12), 1907-1910 (2008).
- Feng, K. C., Liu, L. B., Tzeng, Y. M. Verticillium lecanii spore production in solid-state and liquid-state fermentations. Bioprocess Engineering. 23 (1), 25-29 (2000).
- Jaronski, S. T., Jackson, M. A. Mass production of entomopathogenic Hypocreales. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology 2nd edition. Lacey, L. A. , Academic Press. London. 255-284 (2012).
- Vega, F. E., Jackson, M. A., Mercandier, G., Poprawski, T. J. The impact of nutrition on spore yields for various fungal entomopathogens in liquid culture. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 19 (4), 363-368 (2003).
- El Damir, M. Effect of growing media and water volume on conidial production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Journal of Biological Sciences. 6 (2), 269-274 (2006).
- Pandey, A. K., Kanaujia, K. R. Effect of different grains as solid substrates on sporulation, viability and pathogenicity of Metarhizium anisopliae (Metschnikoff) Sorokin. Journal of Biological Control. 22 (2), 369-374 (2008).
- Kassa, A., et al. Whey for mass production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Mycological Research. 112 (5), 583-591 (2008).
- Sharma, S., Gupta, R. B. L., Yadavam, C. P. S. Selection of a suitable medium for mass multiplication of entomofungal pathogens. Indian Journal of Entomology. 64 (3), 254-261 (2002).
- Bich, G. A., Castrillo, M. L., Villalba, L. L., Zapata, P. D. Evaluation of rice by-products, incubation time, and photoperiod for solid state mass multiplication of the biocontrol agents Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Agronomy Research. 16 (5), 1921-1930 (2018).
- Price, R. E., Müller, E. J., Brown, H. D., D'Uamba, P., Jone, A. A. The first trial of a Metarhizium anisopliae var. acridum mycoinsecticide for the control of the red locust in a recognised outbreak area. International Journal of Tropical Insect Science. 19 (4), 323-331 (1999).
- Hatting, J. L., Moore, S. D., Malan, A. P. Microbial control of phytophagous invertebrate pests in South Africa. Current status and future prospects. Journal of Invertebrate Pathology. 165, 54-66 (2019).
- Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. Laboratory screening of entomopathogenic fungi and nematodes for pathogenicity against the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae). Biocontrol Science and Technology. , (2021).
- Inglis, G. D., Enkerli, J., Goettel, M. S. Laboratory techniques used for entomopathogenic fungi: Hypocreales. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , Academic Press, Elsevier. Chapter 7 189-253 (2012).
- Mehta, J., et al. Impact of carbon & nitrogen sources on the Trichoderma viride (Biofungicide) and Beauveria bassiana (entomopathogenic fungi). European Journal of Experimental Biology. 2 (6), 2061-2067 (2012).
- Burges, H. D. Formulation of mycoinsecticides. Formulation of Microbial Biopesticides. , Springer. Dordrecht. 131-185 (1998).
