Produzione di massa di funghi entomopatogeni, Metarhizium robertsii e Metarhizium pinghaense, per applicazioni commerciali contro gli insetti nocivi

Summary

I funghi entomopatogeni hanno acquisito importanza come agenti di controllo biologico degli insetti nocivi agricoli. In questo studio, la produzione di massa di un numero sufficiente di propaguli infettivi resilienti di isolati sudafricani di Metarhizium robertsii e M. pinghaense per l’applicazione commerciale contro gli insetti nocivi è stata condotta con successo utilizzando prodotti a base di cereali agricoli.

Abstract

I funghi entomopatogeni del complesso di specie Metarhizium anisopliae hanno acquisito importanza come agenti di controllo biologico degli insetti nocivi agricoli. L’aumento della resistenza dei parassiti agli insetticidi chimici, le crescenti preoccupazioni per gli effetti negativi degli insetticidi sulla salute umana e l’inquinamento ambientale da pesticidi hanno portato a una spinta globale per trovare nuove strategie sostenibili per la protezione delle colture e il controllo dei parassiti. In precedenza, sono stati condotti tentativi di coltura di massa di tali specie di funghi entomopatogeni (EPF) come Beauveria bassiana . Tuttavia, sono stati condotti solo tentativi limitati di coltura di massa di Metarhizium robertsii e M. pinghaense per l’uso contro gli insetti nocivi. Questo studio mirava a produrre in serie un numero sufficiente di propaguli infettivi resilienti di isolati sudafricani di M. robertsii e M. pinghaense per applicazioni commerciali. Tre prodotti a base di cereali agricoli, avena in fiocchi, orzo in fiocchi e riso, sono stati utilizzati come substrati di fermentazione solida EPF. Due metodi di inoculazione, sospensioni conidiali e la coltura fungina liquida di blastospore sono stati utilizzati per inoculare i substrati solidi. L’inoculazione con sospensioni conidiali è stata osservata come relativamente meno efficace, poiché sono stati osservati livelli aumentati di contaminazione sui substrati solidi rispetto a quando si utilizza il metodo di inoculazione delle blastospore. L’avena in scaglie non è risultata essere un substrato di crescita adatto sia per M. robertsii che per M. pinghaense, poiché nessun conidi secco è stato raccolto dal substrato. L’orzo in scaglie è stato trovato per favorire la produzione di M. robertsii conidia rispetto a quella di M. pinghaense, e una media di 1,83 g ± 1,47 g di conidia secca di M. robertsii e zero grammi di conidia M. pinghaense è stata raccolta dal substrato. I chicchi di riso sono risultati favorire la produzione di massa conidiale di isolati di M. pinghaense e M. robertsii , con una media di 8,2 g ± 4,38 g e 6 g ± 2 g raccolti dal substrato, rispettivamente.

Introduction

I funghi entomopatogeni (EPF) hanno acquisito importanza come agenti di protezione delle colture nel controllo biologico di importanti insetti nocivi agricoli ^1,2. Gli entomopatogeni, che si trovano naturalmente nel suolo, causano epizoozie nelle popolazioni di varie specie di parassiti³. Le specie di EPF sono specifiche dell’ospite e presentano relativamente pochi rischi in termini di attacco alle specie non bersaglio, e non sono tossiche per l’ambiente⁴. Gli EPF hanno un meccanismo unico per invadere il loro ospite, così come per propagarsi e persistere nel loro ambiente immediato¹. Attaccano l’ospite principalmente attraverso spore asessuate che si attaccano e penetrano nella cuticola dell’ospite per invadere e proliferare nell’emocoel ospite. L’ospite alla fine muore a causa dell’esaurimento dei nutrienti dell’emolinfa o a causa della tossiemia causata dai metaboliti tossici rilasciati dal fungo. Dopo la morte, in condizioni ambientali ideali, il fungo emerge sulla superficie esterna (micosi conclamata) del cadavere ospite ^5,6.

Le crescenti preoccupazioni per quanto riguarda gli effetti negativi dei residui chimici sulla salute umana, l’inquinamento ambientale e lo sviluppo della resistenza ai parassiti hanno portato alla spinta globale a ridurre gli input di insetticidi a base chimica e a trovare strategie alternative, nuove e sostenibili per la protezione delle colture e il controllo dei parassiti ^6,7,8 . Ciò ha fornito l’opportunità di sviluppare insetticidi a base microbica da utilizzare nei programmi di gestione integrata dei parassiti (IPM), che sono strategie ecologicamente più favorevoli rispetto al controllo chimico convenzionale ^3,8.

Per sviluppare un agente di controllo microbico di successo per un parassita agricolo, un organismo adatto deve prima essere isolato, caratterizzato, identificato e la sua patogenicità per l’organismo nocivo bersaglio confermato. Tuttavia, è necessario un metodo semplice ed economico per la produzione su larga scala dell’agente microbico per produrre un prodotto valido da utilizzare nei programmi di controllo biologico 9,10,11,12,13. La produzione di massa di quantità sostanziali di entomopatogeni di buona qualità dipende dal ceppo microbico, dall’ambiente, dal parassita bersaglio, dalla formulazione, dal mercato, dalla strategia di applicazione e dal prodotto finale desiderato 14,15,16. L’EPF può essere prodotto in serie utilizzando la fermentazione del substrato liquido per produrre blastospore o il processo di fermentazione del substrato solido per produrre conidi^{aerei 6,17,18}. Tuttavia, il processo di produzione e formulazione di massa di entomopathogens influenza direttamente la virulenza, il costo, la durata di conservazione e l’efficacia sul campo del prodotto finale. Per un uso di successo nella difesa integrata, il processo di produzione degli entomopatogeni deve essere facile da eseguire, richiedere manodopera minima, produrre una concentrazione ad alto rendimento di propaguli virulenti, vitali e persistenti ed essere a basso costo 4,13,14,16.

Comprendere le esigenze nutrizionali degli entomopatogeni è importante per la coltivazione di massa con tutti i metodi di^{coltivazione 4,12}. I componenti nutrizionali del mezzo di produzione hanno un impatto significativo sugli attributi dei propaguli risultanti, tra cui l’efficacia del biocontrollo, la resa, la tolleranza all’essiccazione e la persistenza 8,19,20,21. L’ottimizzazione delle procedure di produzione è progettata per affrontare tali fattori²². Per l’EPF, i requisiti principali per una buona crescita, sporulazione e produzione di massa di conidi fungini sono l’umidità adeguata, la temperatura di crescita ottimale, il pH, lo scambio di gas di CO₂ e O₂ e la nutrizione, comprese buone fonti di fosforo, carboidrati, carbonio e azoto¹⁸.

Jaronski e Jackson¹⁸ descrivono il metodo di fermentazione del substrato solido come il metodo di approssimazione più efficiente e più vicino al processo naturale per la produzione di EPF rispetto al metodo di fermentazione del substrato liquido perché, in condizioni naturali, il conidio fungino è portato su solide strutture erette, come la superficie dei cadaveri di insetti. I prodotti agricoli e i sottoprodotti contenenti amido sono utilizzati principalmente per la produzione di massa di funghi ipocrealeani, poiché i funghi decompongono facilmente l’amido attraverso la secrezione di enzimi idrolitici altamente concentrati dalle loro punte ifali, per penetrare nella sostanza solida e per accedere ai nutrienti presenti nella sostanza ^11,17,18,23 . I prodotti a base di cereali forniscono anche i requisiti per una produzione sana di biomassa perché, quando sono idratati e sterilizzati, i substrati possono assorbire ulteriori nutrienti da qualsiasi mezzo liquido 16,18,24.

In precedenza, diversi studi hanno tentato di coltivare in massa specie di EPF come Beauveria bassiana (Bals.) Vuil., Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. Shrestha & Spatafora, Verticillium lecanii (Zimm.) Viegas e alcuni dei Metarhizium anisopliae (Metschn.) Il complesso di specie Sorokin si isola su vari substrati 16,23,24. Tali isolati prodotti in serie e sviluppati commercialmente includono Green Muscle^® (ceppo IMI 330189), sviluppato da M. anisopliae var Metarhizium acridum (Driver & Milner) J.F. Bisch, Rehner & Humber, Metarhizium 69 (ceppo Meta 69 ICIPE69), e Real Metarhizium 69 (L9281), sviluppato da M. anisopliae, e Broadband^® (ceppo PPRI 5339) ed Eco-Bb^®, sviluppato da B. bassiana^25,26 . Tuttavia, sono stati fatti tentativi limitati alla cultura di massa Metarhizium robertsii J.F. Bisch., S.A. Rehner & Humber e Metarhizium pinghaense Chen & Guo. Questi due isolati sono stati selezionati in uno studio precedente come i più efficaci per il controllo della cocciniglia, Pseudococcus viburni Signoret (Hemiptera: Pseudococcidae)²⁷. Pertanto, l’attuale studio mirava a formulare e produrre in serie un numero sufficiente di propaguli infettivi resilienti degli isolati locali di M. robertsii e M. pinghaense per l’applicazione commerciale contro gli insetti nocivi. Il metodo di fermentazione del substrato solido è stato utilizzato per produrre in serie i conidi fungini per entrambi gli isolati di EPF. Due metodi di inoculazione EPF, utilizzando sospensioni conidiali e la coltura fungina liquida di blastospore, sono stati utilizzati per inoculare i substrati solidi.

Protocol

1. Fonte di ceppi fungini Utilizzare ceppi fungini isolati sudafricani di M. pinghaense 5 HEID (GenBank Numero di adesione: MT367414/MT895630) e M. robertsii 6EIKEN (MT378171/MT380849), raccolti da meleti nella provincia del Capo Occidentale, in Sudafrica. Coltivare colture di ciascun isolato di EPF su 60 g di mezzo agar destrosio Sabouraud, integrato con 1 g di estratto di lievito (SDAY) e 10 μL di streptomicina.NOTA: Incubare colture di EPF a temperat…

Representative Results

Un declino della massa di contenuto delle colture sul riso sia per il M. pinghaense che per il M. robertsii è stato osservato nel tempo durante la fase di essiccazione delle colture fungine, con nessun o poco cambiamento osservato nella massa una volta che le colture erano secche (Figura 5). La polvere di conidi fungini secchi raccolti sia del M. pinghaense che del M. robertsii è mostrata nella Figura 6. <p class="jove_c…

Discussion

Il successo dell’integrazione di agenti microbici per il controllo biologico di importanti insetti nocivi agricoli in un agroecosistema dipende sia dal successo che dalla facilità di produzione di massa degli entomopatogeni come primo passo in condizioni di laboratorio. La produzione di massa di EPF è importante per l’applicazione su larga scala e la disponibilità di prodotti EPF per programmi IPM utilizzando il controllo biologico 9,10,11,12,13.<su…

Materials

0.05% Tween 20	Lasec		Added to conidial suspensions to allow fungal spores to mix with water
20 mL McCartney bottles	Lasec		Used to make conidial suspensions
Aluminium foil			Used as a cover of the cotton wool plugs on 250-mL flask
Autoclave			Used to sterilize materials and ingredients used for the conidia production process
Autoclave bags	Lasec		Fermentation bags or solid substrate containers
Autoclave tape	Lasec		To secure PVC pipes on the fermentation bags
Brown Kraft paper bags			Used to dry conidia cultures on agricultural grains
Bunsen burnner	Labnet (Labnet International, Inc.)		Used to flame equipment (surgical blades,inoculating loops and rims of flasks)
Clear edge test sieve			Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates
Corn steep liquor	SIGMA	66071-94-1	Ingredient of the blastospore liquid medium
Cotton Wool	Lasec		Used as plug of the neck for fermentation bags
Duran laboratory bottles	Neolab		Used to autoclave SDA medium and distilled water
Electrical tape			Used to tape and seal the sieve joints to prevent the escape of conidial dust
ENDECOTTS test sieve			Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates
Erlenmeyer Flasks, Narrow neck,250-mL flask	Lasec		Carrier of the blastospore liquid medium
Ethanol (99%)	Lasec		Used to sterilize surgical blades and inoculating loops
Flaked barley	Health Connection Wholefoods		Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii
Flaked oats	Tiger brands		Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii
Glucose	Merck		Ingredient of the blastospore liquid medium
Growth Chamber/ incubators			For growing fungal conidia culture
Haemocytometer			Used to determine conidial concentrations
Inoculating loops	Lasec		For harvesting spores to innoculate liquid medium for blastospores growth
Kitchen rolling pin			Used to manipulate the solid grain substrate bed
Laminar flow Cabinet	ESCO Laminar Flow Cabinet		Provide as sterile environment during substrate inoculation
Metarhizium pinghaense conidia	Stellenbosch University	5HEID	Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium pinghaense
Metarhizium robertsii conidia	Stellenbosch University	6EIKEN	Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium robertsii
Microscope	ZEIZZ (Scope. A1)		Used to determine conidial concentrations and conidial viability
Orbital shaker	IncoShake- LABOTEC		Used for the blastospore production process
Parboiled rice	Spekko		Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii
Penicillin-Streptomycin	SIGMA		Added to the SDA medium to prevent bacterial contamination
Petri-dishes	Lasec		Containers for the SDA medium
Pipettes and pipette tips	Labnet (BioPette PLUS)		Used to measure liquids ingredients
Polyvinylchloride Marley waste pipe			Used to create a neck for the fermentation bag
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)	SIGMA-ALDRICH		Ingredient of the blastospore liquid medium
Rubber band			Used to secure the secure the surgical paper over the fermentation bag PVC pipe necks
Sabaroud dextrose agar (SDA)	NEOGEN Culture Media		Medium used to culture spores of both Metarhizium pinghaense and Metarhizium robertsii
Sterile distilled water			To hydrate agricultural grains, to make conidial suspensions
Sticky pad			Used to secure the seives on the vibratory shaker
Surgical blade	Lasec		Used to scrape off spores from fungal cultures
Surgical paper	Lasec		Used to cover the PVC necks and cotton wool plugs of the fermentation bag
Vibratory shaker			Used to shake conidia off the agricultural grain substrates
Vortex mixer	Labnet (Labnet International, Inc.)		Used to mix conidial suspensions in Mc Cartney bottles
Yeast extract	Biolab		Added to the SDA medium to improve spore germination and growth
Zipper-lock bags	GLAD		Used to to store harvested fungal conidia