Lésions semi-automatisées contrôlées induites par laser pour étudier la régénération de la moelle épinière chez les larves de poisson zèbre
Summary
Le présent protocole décrit une méthode pour induire des lésions tissulaires spécifiques et hautement reproductibles chez les larves de poisson zèbre à l’aide d’un système de lésion laser combiné à une plate-forme microfluidique automatisée pour la manipulation des larves.
Abstract
Les larves de poisson zèbre possèdent un système nerveux central (SNC) entièrement fonctionnel avec une capacité de régénération élevée seulement quelques jours après la fécondation. Cela rend ce modèle animal très utile pour étudier les lésions de la moelle épinière et la régénération. Le protocole standard pour induire de telles lésions consiste à transecter manuellement la partie dorsale du tronc. Cependant, cette technique nécessite un entraînement approfondi et endommage des tissus supplémentaires. Un protocole a été développé pour les lésions induites par laser afin de contourner ces limitations, permettant une reproductibilité et une exhaustivité élevées de la transsection de la moelle épinière sur de nombreux animaux et entre différentes séances, même pour un opérateur non formé. En outre, les lésions tissulaires se limitent principalement à la moelle épinière elle-même, ce qui réduit les effets de confusion liés à la blessure de différents tissus, par exemple la peau, les muscles et le SNC. De plus, des hémi-lésions de la moelle épinière sont possibles. L’amélioration de la préservation de l’intégrité des tissus après une blessure au laser facilite d’autres dissections nécessaires pour des analyses supplémentaires, telles que l’électrophysiologie. Par conséquent, cette méthode offre un contrôle précis de l’étendue de la blessure qui est irréalisable manuellement. Cela permet de nouveaux paradigmes expérimentaux dans ce modèle puissant à l’avenir.
Introduction
Contrairement aux mammifères, le poisson-zèbre (Danio rerio) peut réparer son système nerveux central (SNC) après une blessure1. L’utilisation des larves de poisson zèbre comme modèle de régénération de la moelle épinière est relativement récente. Il s’est avéré utile d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à la réparation2. Cela est dû à la facilité de manipulation, au cycle expérimental court (nouvelles larves chaque semaine), à la transparence optique des tissus et à la petite taille des larves, idéale pour la microscopie à fluorescence in vivo .
Dans le cas de la régénération de la moelle épinière, deux avantages supplémentaires de l’utilisation de larves sont la rapidité de récupération, quelques jours par rapport à quelques semaines pour les adultes, et la facilité d’induire des blessures à l’aide de techniques manuelles. Cela a été utilisé avec succès dans de nombreuses études3,4,5, y compris des enquêtes récentes6,7. Dans l’ensemble, cela conduit à une production accrue de données significatives, à une grande adaptabilité des protocoles expérimentaux et à une diminution des coûts expérimentaux. L’utilisation de larves moins de 5 jours après la fécondation réduit également l’utilisation d’animaux suivant les principes des 3R dans la recherche animale8.
Après une lésion de la moelle épinière chez les larves de poisson zèbre, de nombreux processus biologiques se produisent, notamment une réponse inflammatoire, une prolifération cellulaire, une neurogenèse, la migration des cellules survivantes ou nouvellement générées, la reformation des axones fonctionnels et un remodelage global des circuits des processus neuronaux et des tissus de la colonne vertébrale6,7,9,10 . Pour être orchestrés avec succès, ces processus impliquent une interaction finement régulée entre une gamme de types de cellules, de composants de matrice extracellulaire et de signaux biochimiques11,12. Démêler les détails de cette réorganisation importante d’un tissu complexe tel que la moelle épinière nécessite l’utilisation et le développement d’approches expérimentales précises et contrôlées.
Le principal paradigme expérimental utilisé pour étudier la régénération de la moelle épinière chez le poisson-zèbre consiste à utiliser des moyens chirurgicaux pour induire des lésions tissulaires par résection, coup de couteau ou cryofreinture3,13. Ces approches ont l’inconvénient de nécessiter une formation spécifique aux compétences en microchirurgie, ce qui prend du temps pour tout nouvel opérateur et peut empêcher leur utilisation dans des projets à court terme. En outre, ils induisent généralement des dommages aux tissus environnants, ce qui peut influencer la régénération.
Une autre approche consiste à induire des dommages cellulaires chimiquement14 ou par des manipulations génétiques15. Ce dernier permet des dégâts très ciblés. Cependant, une telle technique nécessite un long travail préparatoire pour générer de nouveaux poissons transgéniques avant de faire toute expérience, renouvelée chaque fois qu’un type de cellule unique est ciblé.
Il y a donc besoin d’une méthode permettant des lésions ciblées mais polyvalentes adaptées à une variété d’études en régénération. Une solution consiste à utiliser un laser pour induire des dommages localisés dans le tissu d’intérêt16,17,18,19,20. En effet, l’utilisation de lésions tissulaires induites par le laser présente une approche robuste pour générer des lésions de la moelle épinière avec de nombreux avantages. Les microscopes équipés de tels modules de manipulation laser permettent de spécifier une zone de forme personnalisée où l’ablation cellulaire aura lieu, avec l’avantage supplémentaire du contrôle temporel. La taille et la position de la lésion peuvent ainsi être adaptées pour répondre à toutes les questions.
La caractéristique manquante de la plupart des systèmes de lésions laser est la possibilité d’induire des blessures de manière hautement reproductible pour une série de larves. Ici, un protocole original est décrit à l’aide d’un laser UV pour induire des lésions semi-automatisées précises et contrôlées chez les larves de poisson zèbre sur la base d’une plate-forme microfluidique conçue pour la manipulation automatisée des larves21. De plus, dans le système présenté ici, les larves sont insérées dans un capillaire en verre, ce qui permet une rotation libre de l’animal autour de son axe rostrocaudal. L’utilisateur peut choisir le côté de la larve à présenter au laser tout en permettant à l’imagerie par fluorescence de cibler précisément le faisceau laser et d’évaluer les dommages après la lésion.
Le protocole décrit ici est utilisé avec un système d’imagerie semi-automatisé des larves de poisson-zèbre combiné à un disque rotatif équipé d’un laser UV (désigné ci-après comme le système VAST). Cependant, les principaux points du protocole et la plupart des revendications de la technique sont valables pour tout système équipé d’un laser capable d’ablation cellulaire, y compris les microscopes à balayage laser à deux photons, les microscopes à disque rotatif équipés d’un laser UV (module FRAP) ou les vidéomicroscopes avec un module laser pour la manipulation de photos. L’une des principales différences entre le système VAST et la manipulation conventionnelle des échantillons sera que, pour ces derniers, le montage de larves dans l’agarose à faible point de fusion sur des couvercles en verre / boîtes de Petri à fond de verre au lieu de les charger dans une plaque de 96 puits sera nécessaire.
Les avantages offerts par cette méthode ouvrent des opportunités pour la recherche innovante sur les mécanismes cellulaires et moléculaires au cours du processus de régénération. De plus, la haute qualité des données permet des enquêtes quantitatives dans un contexte multidisciplinaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il est urgent de mieux comprendre les processus en jeu lors de la régénération chez le poisson-zèbre. Ce modèle animal offre de nombreux avantages pour la recherche biomédicale, en particulier pour les lésions de la moelle épinière1. La plupart des études portent sur des lésions manuelles qui nécessitent un opérateur bien formé et induisent des lésions multi-tissulaires. Un protocole de lésion laser est présenté ici, permettant de contrôler les caractéristiques de la lésion et…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par le BBSRC (BB/S0001778/1). CR est financé par le Princess Royal TENOVUS Scotland Medical Research Scholarship Programme. Nous remercions David Greenald (CRH, Université d’Édimbourg) et Katy Reid (CDBS, Université d’Édimbourg) pour l’aimable don de poisson transgénique (voir dossier supplémentaire). Nous remercions Daniel Soong (CRH, Université d’Édimbourg) pour l’aimable accès au disque rotatif confocal 3i.
Materials
| Software | |||
| Microscope software Zen Blue 2.0 | Carl Zeiss | ||
| ImageJ/FIJI | Open-Source | ||
| Visual Studio Code | Microsoft | ||
| Microscope and accessories | |||
| ApoTome microscope | Carl Zeiss | ||
| C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens | Carl Zeiss | ||
| dual AxioCam 506 m CCD cameras | Carl Zeiss | ||
| Laser scanning confocal microscope LSM880 | Carl Zeiss | ||
| Spinning-disk module CSU-X1 | Yokogawa | ||
| Upright microscopeAxio Examiner D1 | Carl Zeiss | ||
| UV laser | Micropoint | ||
| VAST BioImager | Union Biometrica | ||
| Labware | |||
| 90 mm Petri dish | Thermo-Fisher | 101R20 | |
| 96-well plate | Corning | 3841 | |
| Chemicals | |||
| Click-It EdU Imaging Kit | Invitrogen | C10637 | |
| aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Antibodies | |||
| Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488 | Jackson | 703-545-155 | |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Jackson | 715-165-150 | |
| Mouse anti-GFP | Abcam | AB13970 | |
| Mouse anti-tubulin acetylated antibody | Sigma | T6793 | |
| Transgenic zebrafish lines | |||
| Tg(beta-actin:utrophin-mCherry) | N/A | Established by David Greenhald, University of Edinburgh | |
| Tg(mnx1:gfp) | N/A | First described in [Flanagan-Steet et al. 2005] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed) | N/A | First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) | N/A | Established by Katy Reid, University of Edinburgh | |
| Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) | N/A | Established by David Greenhald, University of Edinburgh |
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