Lesiones controladas semiautomatizadas inducidas por láser para estudiar la regeneración de la médula espinal en larvas de pez cebra
Summary
El presente protocolo describe un método para inducir lesiones específicas de tejido y altamente reproducibles en larvas de pez cebra utilizando un sistema de lesiones láser combinado con una plataforma microfluídica automatizada para el manejo de larvas.
Abstract
Las larvas de pez cebra poseen un sistema nervioso central (SNC) completamente funcional con una alta capacidad regenerativa solo unos días después de la fertilización. Esto hace que este modelo animal sea muy útil para estudiar la lesión y regeneración de la médula espinal. El protocolo estándar para inducir tales lesiones es transectar la parte dorsal del tronco manualmente. Sin embargo, esta técnica requiere un entrenamiento extenso y daña tejidos adicionales. Se desarrolló un protocolo para lesiones inducidas por láser para eludir estas limitaciones, lo que permite una alta reproducibilidad e integridad de la transección de la médula espinal en muchos animales y entre diferentes sesiones, incluso para un operador no entrenado. Además, el daño tisular se limita principalmente a la propia médula espinal, lo que reduce los efectos de confusión de la lesión de diferentes tejidos, por ejemplo, piel, músculo y SNC. Además, las hemi-lesiones de la médula espinal son posibles. La preservación mejorada de la integridad del tejido después de una lesión por láser facilita las disecciones adicionales necesarias para análisis adicionales, como la electrofisiología. Por lo tanto, este método ofrece un control preciso de la extensión de la lesión que es inalcanzable manualmente. Esto permite nuevos paradigmas experimentales en este poderoso modelo en el futuro.
Introduction
A diferencia de los mamíferos, el pez cebra (Danio rerio) puede reparar su sistema nervioso central (SNC) después de una lesión1. El uso de larvas de pez cebra como modelo para la regeneración de la médula espinal es relativamente reciente. Ha demostrado ser valioso investigar los mecanismos celulares y moleculares subyacentes a la reparación2. Esto se debe a la facilidad de manipulación, el ciclo experimental corto (nuevas larvas cada semana), la transparencia óptica de los tejidos y el pequeño tamaño de las larvas, ideal para la microscopía de fluorescencia in vivo .
En el caso de la regeneración de la médula espinal, dos ventajas adicionales del uso de larvas son la velocidad de recuperación, unos pocos días en comparación con unas pocas semanas para los adultos, y la facilidad de inducir lesiones utilizando técnicas manuales. Esto se ha utilizado con éxito en muchos estudios3,4,5, incluyendo investigaciones recientes6,7. En general, esto conduce a una mayor producción de datos significativos, una alta adaptabilidad de los protocolos experimentales y una disminución de los costos experimentales. El uso de larvas menores de 5 días después de la fertilización también reduce el uso de animales siguiendo los principios 3R en la investigación con animales8.
Después de una lesión de la médula espinal en larvas de pez cebra, ocurren muchos procesos biológicos, incluida la respuesta inflamatoria, la proliferación celular, la neurogénesis, la migración de células sobrevivientes o recién generadas, la reforma de los axones funcionales y una remodelación global de los circuitos de procesos neuronales y los tejidos de la columna vertebral6,7,9,10 . Para ser orquestados con éxito, estos procesos implican una interacción finamente regulada entre una variedad de tipos de células, componentes de la matriz extracelular y señales bioquímicas11,12. Desentrañar los detalles de esta reorganización significativa de un tejido complejo como la médula espinal requiere el uso y desarrollo de enfoques experimentales precisos y controlados.
El principal paradigma experimental utilizado para estudiar la regeneración de la médula espinal en el pez cebra es utilizar medios quirúrgicos para inducir daño tisular por resección, apuñalamiento o crioinjuria3,13. Estos enfoques tienen la desventaja de requerir capacitación específica en habilidades de microcirugía, lo que consume mucho tiempo para cualquier nuevo operador y puede evitar su uso en proyectos a corto plazo. Además, generalmente inducen daño a los tejidos circundantes, lo que puede influir en la regeneración.
Otro enfoque es inducir daño celular químicamente14 o mediante manipulaciones genéticas15. Este último permite daños altamente dirigidos. Sin embargo, tal técnica requiere un largo trabajo preparatorio para generar nuevos peces transgénicos antes de hacer cualquier experimento, renovados cada vez que se apunta a un tipo de célula único.
Existe, por lo tanto, la necesidad de un método que permita lesiones dirigidas pero versátiles adecuadas para una variedad de estudios en regeneración. Una solución consiste en utilizar un láser para inducir daño localizado en el tejido de interés16,17,18,19,20. De hecho, el uso de daño tisular inducido por láser presenta un enfoque robusto para generar lesiones de la médula espinal con muchas ventajas. Los microscopios equipados con tales módulos de manipulación láser permiten especificar un área de forma personalizada donde se producirá la ablación celular, con el beneficio adicional del control temporal. El tamaño y la posición de la lesión se pueden adaptar para abordar cualquier pregunta.
La característica que falta en la mayoría de los sistemas de lesiones láser es la posibilidad de inducir lesiones de una manera altamente reproducible para una serie de larvas. Aquí se describe un protocolo original utilizando un láser UV para inducir lesiones semiautomatizadas precisas y controladas en larvas de pez cebra basadas en una plataforma microfluídica diseñada para el manejo automatizado de larvas21. Además, en el sistema presentado aquí, las larvas se insertan en un capilar de vidrio, lo que permite la rotación libre del animal alrededor de su eje rostrocaudal. El usuario puede elegir qué lado de la larva presentar al láser mientras permite que las imágenes de fluorescencia se dirijan con precisión al rayo láser y evalúen el daño después de la lesión.
El protocolo descrito aquí se utiliza con un sistema de imágenes de larvas de pez cebra semiautomatizado combinado con un disco giratorio equipado con un láser UV (designado en lo sucesivo como el sistema VAST). Sin embargo, los puntos principales del protocolo y la mayoría de las afirmaciones de la técnica son válidos para cualquier sistema equipado con un láser capaz de ablación celular, incluidos los microscopios de escaneo láser de dos fotones, los microscopios de disco giratorio provistos de un láser UV (módulo FRAP) o los videomicroscopios con un módulo láser para la manipulación fotográfica. Una de las principales diferencias entre el sistema VAST y el manejo convencional de muestras será que para este último, se requerirá el montaje de larvas en agarosa de bajo punto de fusión en cubiertas de vidrio / placas de Petri con fondo de vidrio en lugar de cargarlas en una placa de 96 pocillos.
Los beneficios que ofrece este método abren oportunidades para la investigación innovadora sobre los mecanismos celulares y moleculares durante el proceso de regeneración. Además, la alta calidad de los datos permite realizar investigaciones cuantitativas en un contexto multidisciplinario.
Protocol
Representative Results
Discussion
Existe una necesidad urgente de una comprensión más profunda de los procesos en juego durante la regeneración en el pez cebra. Este modelo animal ofrece muchos beneficios para la investigación biomédica, en particular para las lesiones de la médula espinal1. La mayoría de los estudios involucran lesiones manuales que requieren un operador bien entrenado e inducen daño multisular. Aquí se presenta un protocolo de lesiones con láser, que permite controlar las características de la lesión…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por el BBSRC (BB/S0001778/1). CR está financiado por el Programa de Becas de Investigación Médica Princess Royal TENOVUS Scotland. Agradecemos a David Greenald (CRH, Universidad de Edimburgo) y Katy Reid (CDBS, Universidad de Edimburgo) por el amable regalo de peces transgénicos (Ver Archivo Complementario). Agradecemos a Daniel Soong (CRH, Universidad de Edimburgo) por el amable acceso al disco giratorio 3i confocal.
Materials
| Software | |||
| Microscope software Zen Blue 2.0 | Carl Zeiss | ||
| ImageJ/FIJI | Open-Source | ||
| Visual Studio Code | Microsoft | ||
| Microscope and accessories | |||
| ApoTome microscope | Carl Zeiss | ||
| C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens | Carl Zeiss | ||
| dual AxioCam 506 m CCD cameras | Carl Zeiss | ||
| Laser scanning confocal microscope LSM880 | Carl Zeiss | ||
| Spinning-disk module CSU-X1 | Yokogawa | ||
| Upright microscopeAxio Examiner D1 | Carl Zeiss | ||
| UV laser | Micropoint | ||
| VAST BioImager | Union Biometrica | ||
| Labware | |||
| 90 mm Petri dish | Thermo-Fisher | 101R20 | |
| 96-well plate | Corning | 3841 | |
| Chemicals | |||
| Click-It EdU Imaging Kit | Invitrogen | C10637 | |
| aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Antibodies | |||
| Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488 | Jackson | 703-545-155 | |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Jackson | 715-165-150 | |
| Mouse anti-GFP | Abcam | AB13970 | |
| Mouse anti-tubulin acetylated antibody | Sigma | T6793 | |
| Transgenic zebrafish lines | |||
| Tg(beta-actin:utrophin-mCherry) | N/A | Established by David Greenhald, University of Edinburgh | |
| Tg(mnx1:gfp) | N/A | First described in [Flanagan-Steet et al. 2005] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed) | N/A | First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) | N/A | Established by Katy Reid, University of Edinburgh | |
| Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) | N/A | Established by David Greenhald, University of Edinburgh |
References
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