הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לגרימת פציעות ספציפיות לרקמות ולשחזור גבוה בזחלי דגי זברה באמצעות מערכת נגע בלייזר בשילוב עם פלטפורמה מיקרופלואידית אוטומטית לטיפול בזחלים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
פציעות חצי אוטומטיות מבוקרות הנגרמות בלייזר לחקר התחדשות חוט השדרה בזחלי דגי זברה
במאמר זה
הודעת תיקון
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
סיכום
תקציר
לזחלי דגי הזברה יש מערכת עצבים מרכזית מתפקדת לחלוטין (CNS) עם יכולת התחדשות גבוהה רק כמה ימים לאחר ההפריה. זה עושה את המודל החייתי הזה מאוד שימושי לחקר פגיעה בחוט השדרה והתחדשות. הפרוטוקול הסטנדרטי לגרימת נגעים כאלה הוא לחצות את החלק הגבי של תא המטען באופן ידני. עם זאת, טכניקה זו דורשת הכשרה נרחבת ופוגעת ברקמות נוספות. פותח פרוטוקול עבור נגעים הנגרמים בלייזר כדי לעקוף מגבלות אלה, המאפשר רבייה גבוהה ושלמות של העברת חוט השדרה על בעלי חיים רבים ובין מפגשים שונים, אפילו עבור מפעיל לא מאומן. יתר על כן, נזק לרקמות מוגבל בעיקר לחוט השדרה עצמו, מה שמפחית השפעות מבלבלות מפגיעה ברקמות שונות, למשל עור, שרירים ומערכת העצבים המרכזית. יתר על כן, נגעים חמי של חוט השדרה אפשריים. שימור משופר של שלמות הרקמות לאחר פגיעה בלייזר מקל על ניתוחים נוספים הדרושים לניתוחים נוספים, כגון אלקטרופיזיולוגיה. לפיכך, שיטה זו מציעה שליטה מדויקת על היקף הפגיעה שאינו ניתן להשגה באופן ידני. זה מאפשר פרדיגמות ניסיוניות חדשות במודל רב עוצמה זה בעתיד.
מבוא
בניגוד ליונקים, דגי זברה (דניו ריו) יכולים לתקן את מערכת העצבים המרכזית שלהם (CNS) לאחר פציעה1. השימוש בזחלי דגי זברה כמודל להתחדשות חוט השדרה הוא חדש יחסית. זה הוכיח ערך לחקור את המנגנונים התאיים והמולקולריים שבבסיס תיקון2. הסיבה לכך היא קלות המניפולציה, מחזור הניסויים הקצר (זחלים חדשים מדי שבוע), השקיפות האופטית של הרקמות, וגודלו הקטן של הזחלים, המותאם באופן אידיאלי למיקרוסקופיה פלואורסצנטית של vivo .
במקרה של התחדשות חוט השדרה, שני יתרונות נוספים של שימוש בזחלים הם מהירות ההתאוששות, כמה ימים לעומת כמה שבועות למבוגרים, ואת הקלות של גרימת פציעות באמצעות טכניקות ידניות. זה שי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל המחקרים בבעלי חיים בוצעו באישור משרד הפנים הבריטי ועל פי תקנותיו, תחת רישיון הפרויקט PP8160052. הפרויקט אושר על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת אדינבורו. לניתוחים ניסיוניים, זחלי דגי זברה עד גיל 5 ימים משני המינים שימשו לקווים הטרנסגניים הזמינים הבאים: Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP), Tg(Xla.Tubb:DsRed), Tg(betaactin:utrophin-mCherry), Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) ו- Tg(mnx1:gfp) (ראה קובץ משלים 1 לגבי הדור של קווי דגי הזברה הטרנסגניים). תרשים של הפרוטוקול באמצעות פלטפורמת הטיפול האוטומטית בזחלי דגי זברה מוצג באיור 1. כל התוכנות המותאמות אישית, קבצי ה- Script והפרוטוקולים הניסיוניים המפורטים המשמשים בעבו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
אימות של העברת חוט השדרה
חקירות מבניות ותפקודיות בוצעו כדי להעריך אם הפרוטוקול מאפשר העברה מלאה של חוט השדרה.
ראשית, כדי לוודא כי אובדן פלואורסצנטיות באתר הנגע נבע מנזק לרקמות עצביות ולא מהלבנת פלואורסצנטיות מתאורת הלייזר, בוצע אימונוסטנציה באמצעות נוגדן נגד טובולין אצטילציה (ראה טבלת חומרים ותיק משלים 1). נצפתה הפרעה מוחלטת של האקסונים בין הצדדים הקואודליים והרוסטרליים של הנגע, המאשרת את המעבר המלא של חוט השדרה (איור 4.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
יש צורך דחוף בהבנה עמוקה יותר של התהליכים במשחק במהלך התחדשות בדגי זברה. מודל זה של בעלי חיים מציע יתרונות רבים למחקר ביו-רפואי, במיוחד עבור פגיעות בחוט השדרה1. רוב המחקרים כוללים נגעים ידניים הדורשים מפעיל מאומן היטב ולגרום נזק רב רקמות. פרוטוקול נגע לייזר מוצג כאן, המאפשר שליטה על מאפייני הנגע ונזק מופחת לרקמות שמסביב. יתר על כן, טכניקה זו היא קלה מספיק כדי לשמש בהצלחה על ידי ניסויים לא מאומנים יחסית.
שלבים קריטיים בפרוטוקול הם כיול הלייזר וההגדרה של החזר על ההשקעה. ב.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי BBSRC (BB/S0001778/1). CR ממומן על ידי הנסיכה המלכותית TENOVUS סקוטלנד מחקר רפואי תוכנית מלגות. אנו מודים לדיוויד גרינלד (CRH, אוניברסיטת אדינבורו) וקייטי ריד (CDBS, אוניברסיטת אדינבורו) על המתנה הנדיבה של דגים מהונדסים (ראה קובץ משלים). אנו מודים לדניאל סונג (CRH, אוניברסיטת אדינבורו) על הגישה האדיבה לקונפוקל 3i ספינינג-דיסק.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>תוכנה | |||
| תוכנת מיקרוסקופ Zen Blue 2.0 | Carl Zeiss | ||
| ImageJ/FIJI | |||
| קוד קוד חזותי | מיקרוסופט | ||
| <חזק>מיקרוסקופ ואביזרים | |||
| מיקרוסקופ | ApoTomeCarl Zeiss | ||
| C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) עדשת טבילה | Carl Zeiss | ||
| כפולה AxioCam 506 m CCD מצלמות | Zeiss | ||
| סריקת לייזר מיקרוסקופ קונפוקלי LSM880 | Carl Zeiss | ||
| מודול דיסק מסתובב CSU-X1 | מיקרוסקופ Yokogawa | ||
| זקוףבוחן Axio D1 | Carl Zeiss | ||
| לייזר UV | Micropoint | ||
| VAST BioImager | Union Biometrica | ||
| Labware | |||
| 90 mm צלחת פטרי | Thermo-Fisher | 101R20 | |
| צלחת 96 בארות | Corning | 3841 | |
| <חזק>כימיקלים | |||
| Click-It EdU Imaging | Kit Invitrogen | C10637 | |
| חומצה אמינו-בנזואית-אתיל מתיל-אסטר (MS222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| <נוגדנים חזקים> | |||
| חמור נגד עוף Alexa Fluor 488 | Jackson | 703-545-155 | |
| חמור נגד עכבר Cy3 | ג'קסון | 715-165-150 | |
| עכבר אנטי-GFP | Abcam | AB13970 | |
| עכבר נוגדן אצטילציה נגד טובולין | Sigma | T6793 | |
| <חזק>טרנסגני קווי דג זברה | |||
| Tg(beta-actin:utrophin-mCherry) | N/A | הוקם על ידי דיוויד גרינהלד, אוניברסיטת אדינבורו | |
| Tg(mnx1:gfp) | N/A | שתואר לראשונה ב-[Flanagan-Steet et al. 2005] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed) | N/A | תואר לראשונה ב-[Peri and Nusslein-Volhard 2008] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed; mpeg1:GFP) | N/A | הוקם על ידי קייטי ריד, אוניברסיטת אדינבורו | |
| Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) | N/A | הוקם על ידי דיוויד גרינהלד, אוניברסיטת אדינבורו |
מקורות
- Becker, C. G., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
- Ohnmacht, J., et al. Spinal motor ne....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תיקון
Formal Correction: Erratum:Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
Posted by JoVE Editors on 4/07/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae. The title was updated.
The title was updated from:
Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
to:
Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
