פציעות חצי אוטומטיות מבוקרות הנגרמות בלייזר לחקר התחדשות חוט השדרה בזחלי דגי זברה
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לגרימת פציעות ספציפיות לרקמות ולשחזור גבוה בזחלי דגי זברה באמצעות מערכת נגע בלייזר בשילוב עם פלטפורמה מיקרופלואידית אוטומטית לטיפול בזחלים.
Abstract
לזחלי דגי הזברה יש מערכת עצבים מרכזית מתפקדת לחלוטין (CNS) עם יכולת התחדשות גבוהה רק כמה ימים לאחר ההפריה. זה עושה את המודל החייתי הזה מאוד שימושי לחקר פגיעה בחוט השדרה והתחדשות. הפרוטוקול הסטנדרטי לגרימת נגעים כאלה הוא לחצות את החלק הגבי של תא המטען באופן ידני. עם זאת, טכניקה זו דורשת הכשרה נרחבת ופוגעת ברקמות נוספות. פותח פרוטוקול עבור נגעים הנגרמים בלייזר כדי לעקוף מגבלות אלה, המאפשר רבייה גבוהה ושלמות של העברת חוט השדרה על בעלי חיים רבים ובין מפגשים שונים, אפילו עבור מפעיל לא מאומן. יתר על כן, נזק לרקמות מוגבל בעיקר לחוט השדרה עצמו, מה שמפחית השפעות מבלבלות מפגיעה ברקמות שונות, למשל עור, שרירים ומערכת העצבים המרכזית. יתר על כן, נגעים חמי של חוט השדרה אפשריים. שימור משופר של שלמות הרקמות לאחר פגיעה בלייזר מקל על ניתוחים נוספים הדרושים לניתוחים נוספים, כגון אלקטרופיזיולוגיה. לפיכך, שיטה זו מציעה שליטה מדויקת על היקף הפגיעה שאינו ניתן להשגה באופן ידני. זה מאפשר פרדיגמות ניסיוניות חדשות במודל רב עוצמה זה בעתיד.
Introduction
בניגוד ליונקים, דגי זברה (דניו ריו) יכולים לתקן את מערכת העצבים המרכזית שלהם (CNS) לאחר פציעה1. השימוש בזחלי דגי זברה כמודל להתחדשות חוט השדרה הוא חדש יחסית. זה הוכיח ערך לחקור את המנגנונים התאיים והמולקולריים שבבסיס תיקון2. הסיבה לכך היא קלות המניפולציה, מחזור הניסויים הקצר (זחלים חדשים מדי שבוע), השקיפות האופטית של הרקמות, וגודלו הקטן של הזחלים, המותאם באופן אידיאלי למיקרוסקופיה פלואורסצנטית של vivo .
במקרה של התחדשות חוט השדרה, שני יתרונות נוספים של שימוש בזחלים הם מהירות ההתאוששות, כמה ימים לעומת כמה שבועות למבוגרים, ואת הקלות של גרימת פציעות באמצעות טכניקות ידניות. זה שימש בהצלחה במחקרים רבים3,4,5, כולל חקירות האחרונות6,7. בסך הכל, זה מוביל לייצור נתונים משמעותיים מוגברים, הסתגלות גבוהה של פרוטוקולים ניסיוניים, וירידה בעלויות הניסוי. השימוש בזחלים מתחת ל-5 ימים לאחר ההפריה גם מפחית את השימוש בבעלי חיים בעקבות עקרונות ה-3R במחקר בבעלי חיים8.
לאחר פגיעה בחוט השדרה בזחלי דגי הזברה, מתרחשים תהליכים ביולוגיים רבים, כולל תגובה דלקתית, התפשטות תאים, נוירוגנזה, הגירה של תאים ששרדו או חדשים שנוצרו, רפורמציה של אקסונים פונקציונליים, ושיפוץ גלובלי של מעגלי תהליכים עצביים ורקמות עמוד שדרה6,7,9,10 . כדי להיות מתוזמר בהצלחה, תהליכים אלה כרוכים אינטראקציה מווסתת היטב בין מגוון של סוגי תאים, רכיבי מטריצה חוץ תאית, אותות ביוכימיים1,12. חשיפת הפרטים של ארגון מחדש משמעותי זה של רקמה מורכבת כגון חוט השדרה דורשת שימוש ופיתוח של גישות ניסיוניות מדויקות ומבוקרות.
הפרדיגמה הניסיונית העיקרית המשמשת לחקר התחדשות חוט השדרה בדגי זברה היא להשתמש באמצעים כירורגיים כדי לגרום נזק לרקמות על ידי כריתה, דקירה או קריוג’ורי3,13. לגישות אלה יש את החיסרון של דרישת הכשרה ספציפית במיומנויות מיקרוכירורגיות, אשר גוזל זמן רב עבור כל מפעיל חדש ועשוי למנוע את השימוש בהם בפרויקטים לטווח קצר. יתר על כן, הם בדרך כלל לגרום נזק לרקמות שמסביב, אשר עשוי להשפיע על התחדשות.
גישה נוספת היא לגרום נזק לתאים כימית14 או על ידי מניפולציות גנטיות15. זה האחרון מאפשר נזק ממוקד מאוד. עם זאת, טכניקה כזו דורשת עבודת הכנה ארוכה כדי ליצור דגים מהונדסים חדשים לפני ביצוע כל ניסוי, מחודש בכל פעם סוג תא ייחודי הוא ממוקד.
יש, אם כן, את הצורך בשיטה המאפשרת נגעים ממוקדים אך תכליתיים המתאימים למגוון מחקרים בהתחדשות. הפתרון הוא להשתמש בלייזר כדי לגרום נזק מקומי ברקמת העניין16,17,18,19,20. ואכן, השימוש בנזק לרקמות הנגרמות בלייזר מציג גישה חזקה ליצירת נגעים בחוט השדרה עם יתרונות רבים. המיקרוסקופים המצוידים במודולים כאלה של מניפולציה בלייזר מאפשרים לציין אזור מעוצב מותאם אישית שבו תתרחש אבלציה של תאים, עם היתרון הנוסף של שליטה זמנית. כך ניתן להתאים את גודלו ומיקום הנגע כדי לענות על כל שאלה.
התכונה החסרה של רוב מערכות נגע הלייזר היא האפשרות לגרום לפציעות באופן רב לשחזור עבור סדרה של זחלים. כאן מתואר פרוטוקול מקורי באמצעות לייזר UV כדי לגרום לנגעים מדויקים ומבוקרים חצי אוטומטיים בזחלי דגי זברה המבוססים על פלטפורמה מיקרופלואידית המיועדת לטיפול אוטומטי בזחלים21. יתר על כן, במערכת המוצגת כאן, זחלים מוכנסים נימי זכוכית, המאפשר סיבוב חופשי של החיה סביב ציר rostrocaudal שלה. המשתמש יכול לבחור איזה צד של הזחל להציג ללייזר תוך מתן הדמיה פלואורסצנטית כדי למקד במדויק את קרן הלייזר ולהעריך את הנזק לאחר הנגע.
הפרוטוקול המתואר כאן משמש עם מערכת הדמיה אוטומטית למחצה של זחלי דגי זברה בשילוב עם דיסק מסתובב המצויד בלייזר UV (המיועד להלן כמערכת VAST). עם זאת, הנקודות העיקריות של הפרוטוקול ורוב הטענות של הטכניקה תקפות לכל מערכת המצוידת בלייזר המסוגל לאבלציה של תאים, כולל מיקרוסקופים לסריקת לייזר שני פוטונים, מיקרוסקופים של דיסק מסתובב המסופקים עם לייזר UV (מודול FRAP), או מיקרוסקופי וידאו עם מודול לייזר לייזר למניפולציה בתמונה. אחד ההבדלים העיקריים בין מערכת VAST לבין טיפול מדגם קונבנציונאלי יהיה כי עבור האחרון, הרכבה זחלים בנקודת התכה נמוכה התעוררו על כיסויי זכוכית / צלחות פטרי תחתית זכוכית במקום לטעון אותם בצלחת 96-well- well יהיה צורך.
היתרונות המוצעים בשיטה זו פותחים הזדמנויות למחקר חדשני על המנגנונים התאיים והמולקולריים במהלך תהליך ההתחדשות. יתר על כן, איכות הנתונים הגבוהה מאפשרת חקירות כמותיות בהקשר רב תחומי.
Protocol
Representative Results
Discussion
יש צורך דחוף בהבנה עמוקה יותר של התהליכים במשחק במהלך התחדשות בדגי זברה. מודל זה של בעלי חיים מציע יתרונות רבים למחקר ביו-רפואי, במיוחד עבור פגיעות בחוט השדרה1. רוב המחקרים כוללים נגעים ידניים הדורשים מפעיל מאומן היטב ולגרום נזק רב רקמות. פרוטוקול נגע לייזר מוצג כאן, המאפשר שלי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי BBSRC (BB/S0001778/1). CR ממומן על ידי הנסיכה המלכותית TENOVUS סקוטלנד מחקר רפואי תוכנית מלגות. אנו מודים לדיוויד גרינלד (CRH, אוניברסיטת אדינבורו) וקייטי ריד (CDBS, אוניברסיטת אדינבורו) על המתנה הנדיבה של דגים מהונדסים (ראה קובץ משלים). אנו מודים לדניאל סונג (CRH, אוניברסיטת אדינבורו) על הגישה האדיבה לקונפוקל 3i ספינינג-דיסק.
Materials
| Software | |||
| Microscope software Zen Blue 2.0 | Carl Zeiss | ||
| ImageJ/FIJI | Open-Source | ||
| Visual Studio Code | Microsoft | ||
| Microscope and accessories | |||
| ApoTome microscope | Carl Zeiss | ||
| C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens | Carl Zeiss | ||
| dual AxioCam 506 m CCD cameras | Carl Zeiss | ||
| Laser scanning confocal microscope LSM880 | Carl Zeiss | ||
| Spinning-disk module CSU-X1 | Yokogawa | ||
| Upright microscopeAxio Examiner D1 | Carl Zeiss | ||
| UV laser | Micropoint | ||
| VAST BioImager | Union Biometrica | ||
| Labware | |||
| 90 mm Petri dish | Thermo-Fisher | 101R20 | |
| 96-well plate | Corning | 3841 | |
| Chemicals | |||
| Click-It EdU Imaging Kit | Invitrogen | C10637 | |
| aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Antibodies | |||
| Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488 | Jackson | 703-545-155 | |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Jackson | 715-165-150 | |
| Mouse anti-GFP | Abcam | AB13970 | |
| Mouse anti-tubulin acetylated antibody | Sigma | T6793 | |
| Transgenic zebrafish lines | |||
| Tg(beta-actin:utrophin-mCherry) | N/A | Established by David Greenhald, University of Edinburgh | |
| Tg(mnx1:gfp) | N/A | First described in [Flanagan-Steet et al. 2005] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed) | N/A | First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) | N/A | Established by Katy Reid, University of Edinburgh | |
| Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) | N/A | Established by David Greenhald, University of Edinburgh |
References
- Becker, C. G., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
- Ohnmacht, J., et al. Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish. Development. 143 (9), 1464-1474 (2016).
- Anguita-Salinas, C., et al. Cellular dynamics during spinal cord regeneration in larval zebrafish. Developmental Neuroscience. 41 (1-2), 112-122 (2019).
- Chapela, D., et al. A zebrafish drug screening platform boosts the discovery of novel therapeutics for spinal cord injury in mammals. Scientific Reports. 9, 1-12 (2019).
- Schlüßler, R., et al. Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging. Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).
- Cavone, L., et al. A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord. Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).
- Keatinge, M., et al. CRISPR gRNA phenotypic screening in zebrafish reveals pro-regenerative genes in spinal cord injury. PLoS Genetics. 17 (4), 1-21 (2021).
- . National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research Available from: https://nc3rs.org.uk (2021)
- Hui, S. P., et al. Genome wide expression profiling during spinal cord regeneration identifies comprehensive cellular responses in Zebrafish. PLOS ONE. 9 (1), 1-23 (2014).
- Vasudevan, D., et al. Regenerated interneurons integrate into locomotor circuitry following spinal cord injury. Experimental Neurology. 342, 1-10 (2021).
- Becker, T., Becker, C. G. Dynamic cell interactions allow spinal cord regeneration in zebrafish. Current Opinion in Physiology. 14, 64-69 (2020).
- Wehner, D., et al. Wnt signaling controls pro-regenerative Collagen XII in functional spinal cord regeneration in zebrafish. Nature Communications. 8 (126), 1-16 (2017).
- Briona, L. K., Dorsky, R. I. Spinal cord transection in the larval Zebrafish. Journal of Visualised Experiments: JoVE. (87), (2014).
- Kamei, C. N., Liu, Y., Drummond, I. A. Kidney regeneration in adult Zebrafish by gentamicin induced injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), (2015).
- Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits. Science. 305 (5681), 254-258 (2004).
- Xu, Y., Chen, M., Hu, B., Huang, R., Hu, B. In vivo imaging of mitochondrial transport in single-axon regeneration of zebrafish mauthner cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11 (4), 1-12 (2017).
- Nichols, E. L., Smith, C. J. Functional regeneration of the sensory root via axonal invasion. Cell Reports. 30 (1), 9-17 (2020).
- Ellström, I. D., et al. Spinal cord injury in zebrafish induced by near-infrared femtosecond laser pulses. Journal of Neuroscience Methods. 311, 259-266 (2016).
- Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. Microglia exit the CNS in spinal root avulsion. PLOS Biology. 17 (2), 1-30 (2019).
- Early, J. J., et al. An automated high-resolution in vivo screen in zebrafish to identify chemical regulators of myelination. eLife. , 1-31 (2018).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- . AndOr Micropoint Manual Available from: https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual (2021)
- Knafo, S., et al. Mechanosensory neurons control the timing of spinal microcircuit selection during locomotion. eLife. 6, 25260 (2017).
- Tsarouchas, T. M., et al. Dynamic control of proinflammatory cytokines Il-1β and Tnf-α by macrophages in zebrafish spinal cord regeneration. Nature Communications. 9, (2018).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Howell, D. . Statistical methods for psychology. , 324-325 (2002).
- Tukey, J. Comparing individual means in the analysis of variance. Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).
- Song, M., Mohamad, O., Chen, D., Yu, S. P. Coordinated development of voltage-gated Na+ and K+ currents regulates functional maturation of forebrain neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (10), 1551-1563 (2013).
- Hong, S., Lee, P., Baraban, S., Lee, L. P. A novel long-term, multi-channel and non-invasive electrophysiology platform for Zebrafish. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
- Menelaou, E., McLean, D. L. Hierarchical control of locomotion by distinct types of spinal V2a interneurons in zebrafish. Nature Communications. 10, 1-12 (2019).
