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Medicine

Kontrollierte halbautomatische laserinduzierte Verletzungen zur Untersuchung der Rückenmarksregeneration bei Zebrafischlarven

Published: November 22, 2021 doi: 10.3791/63259
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2, 1,2
1Centre for Discovery Brain Sciences, University of Edinburgh Medical School: Biomedical Sciences, 2Center for Regenerative Therapies at the TU Dresden

ERRATUM NOTICE

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Induktion gewebespezifischer und hochreproduzierbarer Verletzungen in Zebrafischlarven unter Verwendung eines Laserläsionssystems in Kombination mit einer automatisierten mikrofluidischen Plattform für die Larvenhandhabung.

Abstract

Zebrafischlarven besitzen bereits wenige Tage nach der Befruchtung ein voll funktionsfähiges Zentralnervensystem (ZNS) mit hoher Regenerationsfähigkeit. Dies macht dieses Tiermodell sehr nützlich für die Untersuchung von Rückenmarksverletzungen und Regeneration. Das Standardprotokoll zur Induktion solcher Läsionen besteht darin, den dorsalen Teil des Rumpfes manuell zu transektieren. Diese Technik erfordert jedoch ein umfangreiches Training und schädigt zusätzliches Gewebe. Es wurde ein Protokoll für laserinduzierte Läsionen entwickelt, um diese Einschränkungen zu umgehen, was eine hohe Reproduzierbarkeit und Vollständigkeit der Rückenmarkstransektion bei vielen Tieren und zwischen verschiedenen Sitzungen ermöglicht, selbst für einen ungeschulten Bediener. Darüber hinaus sind Gewebeschäden hauptsächlich auf das Rückenmark selbst beschränkt, wodurch verwirrende Effekte durch die Verletzung verschiedener Gewebe, z. B. Haut, Muskeln und ZNS, verringert werden. Darüber hinaus sind Hemi-Läsionen des Rückenmarks möglich. Die verbesserte Erhaltung der Gewebeintegrität nach einer Laserverletzung erleichtert weitere Dissektionen, die für zusätzliche Analysen wie die Elektrophysiologie erforderlich sind. Daher bietet diese Methode eine präzise Kontrolle des Verletzungsausmaßes, die manuell nicht erreichbar ist. Dies ermöglicht neue experimentelle Paradigmen in diesem mächtigen Modell in der Zukunft.

Introduction

Im Gegensatz zu Säugetieren können Zebrafische (Danio rerio) nach einer Verletzung ihr zentrales Nervensystem (ZNS) reparieren1. Die Verwendung von Zebrafischlarven als Modell für die Rückenmarksregeneration ist relativ neu. Es hat sich als wertvoll erwiesen, die zellulären und molekularen Mechanismen zu untersuchen, die der Reparatur zugrunde liegen2. Dies liegt an der einfachen Manipulation, dem kurzen Experimentierzyklus (jede Woche neue Larven), der optischen Transparenz des Gewebes und der geringen Größe der Larven, die sich ideal für die In-vivo-Fluoreszenzmikroskopie eignet.

Im Falle der Rückenmarksregeneration sind zwei weitere Vorteile der Verwendung von Larven die Geschwindigkeit der Genesung, einige Tage im Vergleich zu einigen Wochen für Erwachsene, und die Leichtigkeit, Verletzungen mit manuellen Techniken zu induzieren. Dies wurde in vielen Studien3,4,5, einschließlich neuerer Untersuchungen6,7, erfolgreich eingesetzt. Insgesamt führt dies zu einer erhöhten aussagekräftigen Datenproduktion, einer hohen Anpassungsfähigkeit experimenteller Protokolle und geringeren experimentellen Kosten. Die Verwendung von Larven, die jünger als 5 Tage nach der Befruchtung sind, reduziert auch den Einsatz von Tieren nach den 3R-Prinzipien in Tierversuchen8.

Nach einer Rückenmarksverletzung in Zebrafischlarven treten viele biologische Prozesse auf, darunter Entzündungsreaktion, Zellproliferation, Neurogenese, Migration überlebender oder neu erzeugter Zellen, Reformation funktioneller Axone und eine globale Umgestaltung neuronaler Prozessschaltkreise und Wirbelsäulengewebe6,7,9,10 . Um erfolgreich orchestriert zu werden, beinhalten diese Prozesse eine fein regulierte Interaktion zwischen einer Reihe von Zelltypen, extrazellulären Matrixkomponenten und biochemischen Signalen11,12. Die Entschlüsselung der Details dieser signifikanten Reorganisation eines komplexen Gewebes wie des Rückenmarks erfordert die Verwendung und Entwicklung präziser und kontrollierter experimenteller Ansätze.

Das primäre experimentelle Paradigma, das zur Untersuchung der Rückenmarksregeneration bei Zebrafischen verwendet wird, besteht darin, chirurgische Mittel zu verwenden, um Gewebeschäden durch Resektion, Stechen oder Kryoverletzungen zu induzieren3,13. Diese Ansätze haben den Nachteil, dass sie eine spezifische Ausbildung in mikrochirurgischen Fähigkeiten erfordern, was für jeden neuen Bediener zeitaufwendig ist und ihre Verwendung in kurzfristigen Projekten verhindern kann. Darüber hinaus induzieren sie in der Regel Schäden am umgebenden Gewebe, die die Regeneration beeinflussen können.

Ein anderer Ansatz besteht darin, Zellschäden chemisch zu induzieren14 oder durch genetische Manipulationen15. Letzteres ermöglicht einen sehr gezielten Schaden. Eine solche Technik erfordert jedoch lange Vorarbeiten, um neue transgene Fische zu erzeugen, bevor ein Experiment durchgeführt wird, das jedes Mal erneuert wird, wenn ein einzigartiger Zelltyp ins Visier genommen wird.

Es besteht daher die Notwendigkeit einer Methode, die gezielte, aber vielseitige Läsionen ermöglicht, die für eine Vielzahl von Studien zur Regeneration geeignet sind. Eine Lösung besteht darin, einen Laser zu verwenden, um lokalisierte Schäden im interessierenden Gewebe zu induzieren16,17,18,19,20. Tatsächlich stellt die Verwendung von laserinduzierten Gewebeschäden einen robusten Ansatz zur Erzeugung von Rückenmarksläsionen mit vielen Vorteilen dar. Die mit solchen Lasermanipulationsmodulen ausgestatteten Mikroskope ermöglichen die Angabe eines kundenspezifisch geformten Bereichs, in dem die Zellablation stattfinden wird, mit dem zusätzlichen Vorteil der zeitlichen Kontrolle. Die Größe und Position der Läsion kann so angepasst werden, um eventuelle Fragen zu beantworten.

Das fehlende Merkmal der meisten Laserläsionssysteme ist die Möglichkeit, Verletzungen auf hochgradig reproduzierbare Weise für eine Reihe von Larven zu induzieren. Hier wird ein Originalprotokoll unter Verwendung eines UV-Lasers beschrieben, um halbautomatische, präzise und kontrollierte Läsionen in Zebrafischlarven zu induzieren, die auf einer mikrofluidischen Plattform basieren, die für die automatisierte Larvenhandhabung entwickelt wurde21. Darüber hinaus werden in dem hier vorgestellten System Larven in eine Glaskapillare eingeführt, die eine freie Rotation des Tieres um seine rostrocaudale Achse ermöglicht. Der Benutzer kann wählen, welche Seite der Larve dem Laser präsentiert werden soll, während die Fluoreszenzbildgebung den Laserstrahl präzise anvisieren und den Schaden nach der Läsion beurteilen kann.

Das hier beschriebene Protokoll wird mit einem halbautomatischen Zebrafischlarven-Bildgebungssystem in Kombination mit einer sich drehenden Scheibe verwendet, die mit einem UV-Laser ausgestattet ist (im Folgenden als VAST-System bezeichnet). Die Hauptpunkte des Protokolls und die meisten Ansprüche der Technik gelten jedoch für jedes System, das mit einem Laser ausgestattet ist, der zur Zellablation fähig ist, einschließlich Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopen, Spinnscheibenmikroskopen, die mit einem UV-Laser (FRAP-Modul) ausgestattet sind, oder Videomikroskope mit einem Lasermodul zur Fotomanipulation. Einer der Hauptunterschiede zwischen dem VAST-System und der konventionellen Probenhandhabung besteht darin, dass für letzteres die Montage von Larven in Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt auf Glasabdeckungen / Petrischalen mit Glasboden erforderlich ist, anstatt sie in eine 96-Well-Platte zu laden.

Die Vorteile, die diese Methode bietet, eröffnen Möglichkeiten für innovative Forschungen zu den zellulären und molekularen Mechanismen während des Regenerationsprozesses. Darüber hinaus ermöglicht die hohe Datenqualität quantitative Untersuchungen in einem multidisziplinären Kontext.

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Protocol

Alle Tierversuche wurden mit Genehmigung des britischen Innenministeriums und gemäß seinen Vorschriften unter der Projektlizenz PP8160052 durchgeführt. Das Projekt wurde vom University of Edinburgh Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt. Für experimentelle Analysen wurden Zebrafischlarven, die bis zu 5 Tage alt sind, beiderlei Geschlechts der folgenden verfügbaren transgenen Linien verwendet: Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP), Tg(Xla.Tubb:DsRed), Tg(betaactin:utrophin-mCherry), Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) und Tg(mnx1:gfp) (siehe Zusatzdatei 1 zur Erzeugung der transgenen Zebrafischlinien). Ein Schema des Protokolls unter Verwendung der automatisierten Zebrafischlarven-Handling-Plattform ist in Abbildung 1 dargestellt. Alle benutzerdefinierten Software, Skripte und detaillierten experimentellen Protokolle, die in dieser Arbeit verwendet werden, sind unter https://github.com/jasonjearly/micropointpy/ verfügbar.

1. Probenvorbereitung

  1. Um 5 Uhr nach der Befruchtung die Embryonen nach dem richtigen Entwicklungsstadium sortieren21. Verwerfen Sie tote Eier und schlecht entwickelte und überentwickelte Embryonen.
  2. 3 Tage nach der Befruchtung (dpf) werden die Larven betäubt, indem Sie 2 ml 0,4% Aminobenzoesäure-ethylmethylester zu 50 ml Fischpflanzenwasser in einer 90 mm Petrischale hinzufügen. Verwenden Sie Tiere, die mit Phenylthioharnstoff (PTU) (siehe Materialtabelle) aufgezogen wurden, um Hautpigmentierung zu verhindern, wenn es sich um ein Problem handelt, was bei Rückenmarksverletzungen bei 3 DPF-Larven, die in diesem Protokoll beschrieben sind, nicht der Fall ist.
    HINWEIS: Diese relativ hohe Anästhesiekonzentration wird verwendet, um Bewegungen der Larven nach dem Lasereinschlag zu verhindern.
  3. Untersuchen Sie die Embryonen auf fluoreszierende Reporterexpression (Zusatzdatei 1).
    HINWEIS: Ein fluoreszierender Reporter für das Rückenmark (oder eine andere interessante Struktur) ist oft erforderlich, um die Effizienz der Verletzung zu beurteilen. Die Verwendung von tg (Xla.Tubb: DsRed) hilft, das Rückenmark zu identifizieren.
  4. Übertragen Sie die ausgewählten Larven in eine 96-Well-Platte für den Einsatz im VAST-System (siehe Materialtabelle) mit 300 μL Fischanlagenwasser pro Bohrloch. Verwenden Sie das Medium, das das Anästhetikum enthält, direkt aus der 90-mm-Petrischale. Stellen Sie sicher, dass Sie nur eine Larve pro Brunnen haben. Bereiten Sie eine zusätzliche leere 96-Well-Platte vor, um die läsionierten Larven zu sammeln.
    HINWEIS: Wenn Sie ein anderes Laserläsionssystem verwenden, montieren Sie die Larven in 1% Low-Melting Point (LMP) Agarosegel in einer geeigneten Beobachtungskammer.

2. Vorbereitung des Mikroskops

  1. Schalten Sie alle Systemkomponenten (VAST, Mikroskop, Laser, PC) ein, einschließlich des Lasers für die Ablation.
  2. Sobald die Hardware vollständig initialisiert ist, starten Sie die Mikroskopsoftware ImageJ / Fiji, eine integrierte Python-Entwicklungsumgebung (IDE) und die automatisierte Zebrafisch-Bildgebungssoftware (VAST-System), wenn Sie diese Plattform verwenden (siehe Materialtabelle).
  3. Richten Sie die VAST-Software mit den folgenden Schritten ein.
    1. Wenn die VAST-Software gestartet wird, wählen Sie im ersten Fenster Platte und klicken Sie auf die Schaltfläche Fertig (Abbildung 2A). Ein weiteres kleines Fenster wird auftauchen und fragen, ob die Kapillare leer und sauber ist. Überprüfen Sie, indem Sie sich das Bild der Kapillare ansehen, ob sich darin Luftblasen befinden. Wenn nicht, klicken Sie auf Ja. Wenn Blasen vorhanden sind, klicken Sie auf Nein und folgen Sie den Schritten 2.3.2-2.3.3 (Abbildung 2B).
    2. Klicken Sie im Fenster Large Particle (LP) Sampler auf Prime , um Luftblasen zu entfernen (Abbildung 2C).
    3. Gehen Sie zum Hauptfenster der Software (mit dem Kapillarbild) und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild. Wählen Sie im Popupmenü die Option "Leeres Kapillarbild aufzeichnen " (Abbildung 2B).
    4. Gehen Sie im LP Sampler-Fenster zum Menü Datei und wählen Sie die Option Skript öffnen . Wählen Sie eine Datei aus, die das Skript enthält, das dem auszuführenden Experiment entspricht.
    5. Gehen Sie im Hauptfenster der VAST-Software zu Datei und wählen Sie Open Experiment. Wählen Sie die Experimentdatei aus, die dem geplanten Experiment entspricht.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Kontrollkästchen Automatische Entladung und Massenausgabe an Abfall NICHT aktiviert sind.
  4. Richten Sie die Mikroskopsoftware für die Bildgebung ein.
    1. Starten Sie die Mikroskop-Imaging-Software (siehe Materialtabelle), um die Hardware zu initialisieren. Dies kann je nach System einige Minuten dauern.
    2. Gehen Sie zu den Erfassungseinstellungen und richten Sie das Mikroskop für die Abbildung des in den Larven exprimierten Fluorophors ein. Verwenden Sie ein 10x NA 0,5 Wassertauchobjektiv, um sicherzustellen, dass das Fokusvolumen entlang der optischen Achse ausreichend verlängert ist, um die gesamte Tiefe des Rückenmarks oder des Zielgewebes zu läsionieren.
  5. Richten Sie ImageJ/Fiji für Laser-Läsionen ein.
    1. Gehen Sie zum Menü Datei und wählen Sie Neu/Skript , um das Skriptfenster zu öffnen.
    2. Gehen Sie im Fenster Neu zum Menü Datei und wählen Sie Öffnen , um das Laserläsionsskript (Manual_MP_Operation.ijm) zu laden.
  6. Richten Sie die Python-IDE ein.
    1. Starten Sie die Python-IDE.
    2. Gehen Sie zum Menü Datei und wählen Sie Datei öffnen , um das Skript zur Verwaltung des Lasers zu laden (Watch_for_ROIs_py3.py).
    3. Wechseln Sie zum Menü Ausführen , und wählen Sie Ohne Debuggen ausführen aus, um das Skript auszuführen. Stellen Sie sicher, dass eine Abfolge von Meldungen im Bedienfeld "TERMINAL" zusammen mit etwas Rauschen angezeigt wird, während das Laserdämpfungsglied initialisiert wird (Abbildung 2D).

3. Laserläsionen auf dem VAST-System durchführen

  1. Zentrieren Sie die Kapillare relativ zum Mikroskopobjektiv, indem Sie die Bühne bewegen, indem Sie auf die Pfeiltasten im Hauptfenster der VAST-Software klicken (Abbildung 2B).
  2. Konzentrieren Sie sich auf die Oberseite der Kapillare, indem Sie durch die Okulare schauen und das Durchlicht des Mikroskops verwenden.
    VORSICHT: Die Kapillare ist sehr zerbrechlich und kann brechen, wenn sie vom Ziel berührt wird. Bewegen Sie den Mikroskopknopf langsam, wenn Sie ein- und ausfokussieren.
  3. Legen Sie die 96-Well-Platten auf den Plattenhalter des LP Samplers des VAST-Systems. Legen Sie die Platte mit Larven auf den linken Halter und die Platte zur Sammlung auf die rechte. Stellen Sie sicher, dass die Platten richtig ausgerichtet sind: Der A1-Brunnen muss sich in der vorderen linken Ecke der Halterung befinden.
  4. Klicken Sie in der VAST-Software im LP Sampler-Fenster auf die Schaltfläche Plate Template und wählen Sie alle Wells aus, die Larven enthalten. Klicken Sie auf die Schaltfläche OK, um das Fenster zu validieren und zu schließen (Abbildung 2C).
  5. Klicken Sie im LP Sampler-Fenster auf die Schaltfläche Run Plate , um das Laden einer Larve zu starten.
    HINWEIS: Nach einiger Zeit sollte die Larve in der Kapillare an der Position sichtbar sein (vordefiniert in der Experimentdefinitionsdatei), so dass das Rückenmark verletzt werden kann. Das VAST-Tablettlicht schaltet sich nach einigen Umdrehungen aus, um die Larve mit der seitlichen Seite zum Mikroskopobjektiv zu bringen.
  6. Gehen Sie zur Mikroskopsoftware und klicken Sie auf die Schaltfläche Live, um die Larve abzubilden.
  7. Drehen Sie den Fokusknopf des Mikroskops, bis der zentrale Kanal des Rückenmarks sichtbar ist.
    HINWEIS: Es kann einfacher sein, zuerst mit Durchlicht zu fokussieren und dann mit Fluoreszenz zu verfeinern.
  8. Machen Sie einen Schnappschuss in Fluoreszenz und speichern Sie das Bild in einem dedizierten Ordner.
  9. Öffnen Sie das Bild in ImageJ und passen Sie den Kontrast bei Bedarf an (über das Menü Bild/Anpassen/Helligkeit/Kontrast... in ImageJ).
  10. Klicken Sie auf das ROI-Linienwerkzeug (Region of Interest) und zeichnen Sie eine kurze Linie (20 μm), die auf dem Rückenmark zentriert ist (Abbildung 3A).
  11. Schalten Sie das Mikroskop auf die 100% reflektierende Spiegelposition.
  12. Laden Sie das ImageJ-Skript und klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen . Verwenden Sie die folgenden Parameter: Wiederholung - 2; Beispiel - 1; Breite - 40 Mikron; Dämpfung - 89 (Volle Laserleistung) (Abbildung 3C).
  13. Wenn die Laserschusssequenz beendet ist, wechseln Sie in der Bildgebungssoftware zur Fluoreszenzbildgebung und passen Sie den Fokus bei Bedarf an.
    HINWEIS: Eine Verschiebung des Fokus wird häufig aufgrund einer Schweifverschiebung während der Laserbelichtung beobachtet.
  14. Machen Sie einen neuen Schnappschuss und speichern Sie ihn.
  15. Öffnen Sie dieses neue Bild in ImageJ und zeichnen Sie eine neue Linie, die größer als das Rückenmark selbst sein sollte (~ 80 μm), beginnend unter der ventralen Seite des Rückenmarks im oberen Teil des Notochords und in Richtung der dorsalen Seite, um im Raum zwischen dem Rückenmark und der Haut zu enden (Abbildung 3B).
  16. Schalten Sie das Mikroskop auf die 100% reflektierende Spiegelposition.
  17. Gehen Sie zum ImageJ-Skriptfenster und klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen . Verwenden Sie die folgenden Parameter: Wiederholung - 2; Beispiel - 1; Breite - 40 Mikrometer; Dämpfung - 89 (Volle Laserleistung).
  18. Nachdem die (längere) Laserschusssequenz abgeschlossen ist, überprüfen Sie die Transsektionsqualität, indem Sie Fluoreszenz und Fokussierung abbilden. Stellen Sie sicher, dass keine Zellen oder Axone in der Läsionsstelle intakt bleiben, die als dunkler oder als schwacher und homogener fluoreszierender Bereich erscheinen sollte (Abbildung 3D, unteres Feld).
  19. Sammeln Sie die läsionierten Larven in die leere 96-Well-Platte (mit den gleichen Well-Koordinaten wie die des ursprünglichen Wells), indem Sie zum VAST-Hauptsoftwarefenster gehen und auf die Schaltfläche Collect klicken.
  20. Schalten Sie die VAST-Systemleuchte wieder ein, indem Sie auf das Kontrollkästchen Tray Light unten links im Fenster klicken.
  21. Wiederholen Sie die Schritte 3.3-3.17 für jede neue Larve, die verletzt werden soll.

4. Handhabung nach der Läsion und zusätzliche Experimente

  1. Nehmen Sie die Larven so schnell wie möglich von der 96-Well-Platte und geben Sie sie in eine saubere Petrischale mit frischem Fischanlagenwasser, damit sich die Larven nach der Läsion erholen können. Die Petrischale bei 28 °C in einen Inkubator stellen.
    HINWEIS: Der Schaden breitet sich oft in der ersten Stunde nach der Läsion weiter aus. Das tatsächliche Ausmaß der Läsion sollte daher nach einer Verzögerung von ca. 1 h mittels Fluoreszenzbildgebung beurteilt werden.

5. Fehlerbehebung

  1. Wenn Luftblasen in den Röhrchen und Kapillaren des VAST-Systems vorhanden sind, klicken Sie auf die Schaltfläche Prime im LP Sampler-Fenster, um sie zu entfernen.
  2. Betrachten Sie die erfolglosen Läsionen (beurteilt anhand der verbleibenden Fluoreszenz in der Läsionsstelle, abgesehen von dem erwarteten Rest- und homogenen Hintergrund), die auf mehrere unten genannte Gründe zurückzuführen sein können.
    1. Geringe Laserleistung: Versuchen Sie es in diesem Fall mit einem höheren Wert.
      HINWEIS: Das VAST-System ist mit einem Farbstofflaser ausgestattet. Dies bedeutet, dass sich die Konzentration der Farbstofflösung, die für die Laserlichterzeugung verwendet wird, mit der Zeit ändern kann, was zu einer Abnahme der Laserleistung führt. Der Ersatz durch eine neue Lösung löst in der Regel das Problem22.
    2. Schlechte Kalibrierung: Überprüfen Sie in diesem Fall die Kalibrierung und Leistung des Lasersystems gemäß Schritt 5.2.2.1-5.2.2.4. Wenn der Laser nicht richtig kalibriert ist, wird er nicht an die gewünschte Stelle gerichtet, was zu erfolglosen Läsionen oder unerwünschten Schäden in benachbarten Geweben führt.
      1. Legen Sie einen Spiegelträger auf die Kapillarkammer. Konzentrieren Sie sich auf die beschichtete Seite (sie sollte dem Ziel zugewandt sein). Verwenden Sie eine vorherige Standardeinstellung in der Folie, um die Fokussierung zu vereinfachen.
      2. Wenden Sie ein Muster der Laserablation mit einem Kalibrierskript an.
      3. Beurteilen Sie die Qualität des Musters. Die Flecken oder Linien sollten scharf und nicht verschwommen erscheinen.
      4. Verwenden Sie eine Rampe mit steigender Leistung, um zu bewerten, ob sich die Laserleistung im Vergleich zu den vorherigen Sitzungen geändert hat.
    3. Larvenbewegung während Läsionen: Larven reagieren unterschiedlich auf Anästhesie; So kann die Laserläsion während des Prozesses Bewegungen des Schwanzes auslösen und so eine erfolgreiche Durchtrennung verhindern. Wenn dies geschieht, nehmen Sie eine zusätzliche Iteration der Laserläsionsschritte vor, um es abzuschließen und gleichzeitig Schäden am umgebenden Gewebe zu vermeiden.
    4. Schlechter Fokus: Wenn dies geschieht, konzentrieren Sie sich auf die Mitte des zentralen Kanals, um die besten Ergebnisse zu erzielen.
    5. ROI-Zeichnung, Position und Größe: Die Position und Größe des ROI sind entscheidend für erfolgreiche Durchschnitte. Der ROI sollte größer als das Rückenmark sein und auf der Mitte des Rückenmarks zentriert sein. Um dies zu lösen, beginnen Sie, den ROI von der ventralen Seite des Rückenmarks zu ziehen und gehen Sie auf die dorsale Seite, um eine erfolgreiche Transsektion zu erhalten. Dies ist wahrscheinlich auf Schwanzbewegungen zurückzuführen, die durch die Abfolge von Laserschüssen während des Ablationsverfahrens ausgelöst werden.

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Representative Results

Validierung der Rückenmarkstransektion
Es wurden strukturelle und funktionelle Untersuchungen durchgeführt, um zu beurteilen, ob das Protokoll eine vollständige Rückenmarkstransektion zulässt.

Erstens, um zu überprüfen, ob der Verlust der Fluoreszenz an der Läsionsstelle auf neuronale Gewebeschäden und nicht auf Fluoreszenz-Photobleichen durch die Laserbeleuchtung zurückzuführen war, wurde eine Immunfärbung mit einem Antikörper gegen acetyliertes Tubulin (siehe Materialtabelle und Zusatzdatei 1) durchgeführt. Es wurde eine vollständige Störung der Axone zwischen der kaudalen und der rostralen Seite der Läsion beobachtet, was die vollständige Transsektion des Rückenmarks bestätigte (Abbildung 4B). Eine erfolgreiche Rückenmarkstransektion sollte keine verbleibende neuronale Projektion über die Läsionsstelle hinterlassen (siehe Abbildung 4C für ein Beispiel für eine erfolglose Läsion). Mit dieser Technik wurde die Erfolgsrate von Rückenmarkslaserläsionen auf 75% geschätzt (vier unvollständige Transsektionen bei 16 Tieren).

Der Funktionsverlust nach Laserläsion wurde mittels Calciumbildgebung untersucht. An intakten Fischen erzeugt die spontan koordinierte neuronale Netzwerkaktivität Fluoreszenzspitzen entlang des gesamten Rückenmarks. Eine erfolgreiche Transsektion würde die Ausbreitung dieser Aktivität zwischen beiden Seiten der Läsion unterbrechen. Um die Qualität der Rückenmarkstransektion zu kontrollieren, wurden Laserläsionen an tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) Larven bei 3 dpf durchgeführt. Nach der Entnahme in einer neuen Multi-Well-Platte wurden die Larven leicht betäubt. Sie wurden auf einem Glasdeckglas aus Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt montiert, um Fluoreszenz-Zeitrafferaufnahmen auf einem konfokalen Mikroskop von 3 h nach der Verletzung durchzuführen. Ein Aktivitätsverlust auf der kaudalen Seite der Läsionsstelle wurde beobachtet. Tatsächlich zeigt die Quantifizierung der Fluoreszenz, dass Spikes aufgrund der spontanen Aktivität des Fisches nur auf der rostralen Seite nach der Verletzung vorhanden waren, aber in koordinierter Weise in den entsprechenden rostralen und kaudalen Positionen bei intakten Fischen auftraten (Abbildung 4D, E). Das niedrige Restsignal auf der Schwanzseite nach einer Verletzung war wahrscheinlich auf die Aktivität sensorischer Neuronen (wahrscheinlich Rohon-Bart-Sinnesneuronen auf der Schwanzseite des Rückenmarks23) als Reaktion auf die Schwanzbewegung zurückzuführen, die durch Muskelkontraktion auf der rostralen Seite induziert wurde.

Regenerationsprozesse, die durch Laserläsionen induziert werden
Nach 24 Stunden nach der Verletzung (hpi) begann sich die Wunde zu schließen, was zu einer teilweisen Wiederherstellung der ursprünglichen Struktur des Rückenmarks nach 48 h führte (Abbildung 5D). Unter Verwendung der Calciumbildgebung wurde eine partielle funktionelle Rekonnektion (Abbildung 5E, F) nach 48 hpi bestätigt. Die Berechnung des Verhältnisses (von den Autoren als Connectivity Restoration Index bezeichnet) zwischen der Amplitude der Spikes im kaudalen Bereich und im rostralen Bereich (Abbildung 5G) zeigte einen Anstieg zwischen 3, 24 und 48 hpi, wie während der Rückenmarksregeneration erwartet.

Laserläsionen lösen eine Immunantwort aus
Die Rekrutierung von Makrophagen (mpeg1:GFP + Zellen) wurde nach Laserläsionen mit tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) Larven-Laserläsionen beobachtet (Abbildung 5H,I). Dies steht im Einklang mit früheren Studien der Autoren mit manuellen Läsionen, die die wesentliche Rolle von Makrophagen für eine erfolgreiche Regeneration des Rückenmarks in Zebrafischlarven belegen6,24. Diese Beobachtung zeigt, dass Immunreaktionen nach einer Laserverletzung untersucht werden können und bestätigt, dass Gewebeschäden aufgetreten sind.

Laserläsionen und manuelle Läsionen lösen eine erhöhte Neurogenese im Rückenmark aus
Frühere Studien haben manuelle Läsionen verwendet, um die Neurogenese zu untersuchen, die nach einer Rückenmarksverletzung auftritt6,15. Laserläsionen könnten ein wertvolles Werkzeug sein, um dieses Phänomen zu untersuchen. Ein zuvor veröffentlichtes Experiment zeigte eine erhöhte Neurogenese nach einer manuellen Rückenmarksverletzung im Vergleich zu nicht läsionierten Kontrollen15. Hier wurden tg(mnx1:gfp)-Fische als Motoneuronen verwendet und fluoreszierend markiert. Die Anti-GFP-Antikörper-Färbung wurde verwendet, um die Sichtbarkeit von GFP in den Larven zu verbessern. Dies wurde mit EdU staining25 (siehe Supplementary File 1) kombiniert, das neu erzeugte Neuronen kennzeichnet. EdU wurde unmittelbar nach einer Verletzung bei 3 dpf hinzugefügt, was bedeutet, dass alle mit EdU markierten Zellen nach der Verletzung erzeugt wurden. Daher stellen Zellen, die eine kolokalisierte Färbung aufweisen, neue Motoneuronen dar, die nach einer Rückenmarksverletzung geboren werden. Die Anzahl der kolokalisierten Zellen auf beiden Seiten der Verletzungsstelle oder in einem Bereich, der der Lage und Größe der Verletzungsstelle in unverläsionierten Kontrollen (in zwei 50-μm-Fenstern erfasst) entspricht, wurde gezählt, und der Unterschied in der mittleren Anzahl der kolokalisierten Zellen wurde mit einem Einweg-ANOVA26 analysiert.

Dieses Protokoll wurde bei manuell und laserläsionierten Larven verwendet, um die Auswirkungen jeder Läsionsmethode auf die Neurogenese zu vergleichen (Abbildung 6). Es wurde kein Unterschied in der Anzahl der markierten Zellen zwischen manuellen und Laserläsionen beobachtet. Unbelastete Fische zeigten unter beiden Läsionsbedingungen weniger doppelt markierte Zellen als Läsionsfische (Abbildung 6D). Dies steht im Einklang mit früheren Ergebnissen, die eine erhöhte Neurogenese bei manuell läsionierten Fischen im Vergleich zu nicht läsionierten Fischen zeigen15.

Diese Ergebnisse unterstützen die Ergebnisse der Kalziumbildgebung und der acetylierten Tubulinfärbung, da die Laserverletzung eine Regenerationsreaktion hervorruft, die mit einer manuellen Läsion vergleichbar ist. Dies deutet darauf hin, dass die Laserläsion nicht einfach die Fluoreszenz in den Zellen ausbleicht, sondern zu einer Verletzung führt, die die gleichen zellulären Reaktionen auslöst wie eine manuelle Läsion.

Laserläsionen führen zu weniger Haut- und Muskelschäden als manuelle Läsionen
Manuelle Läsionen führen oft zu großen Mengen an Muskel- und Hautschäden. Im Gegensatz dazu können Laserläsionen gezielter auf das Rückenmark gerichtet werden, wodurch die Schädigung anderer Gewebe reduziert wird. Um dies zu veranschaulichen, wurden Tg (beta-actin: utrophin-mCh) Larven verwendet, um manuelle und Laserläsionen durchzuführen. Diese Linie markiert fluoreszierend ein F-Aktin-bindendes Protein, das die Visualisierung von Rückenmarkszellen und Muskelfasern ermöglicht. Die Larven wurden dann live montiert und abgebildet (Abbildung 7A,B). Abbildung 7A zeigt die Schädigung des Rückenmarks. Der Mangel an Utrophin an der Verletzungsstelle sowohl bei Laser- als auch bei manuellen Läsionsbedingungen deutet darauf hin, dass beide Läsionsmethoden die Zellen im Rückenmark geschädigt haben. Abbildung 7B zeigt den Muskelschaden. Es gibt eine klare Chevron-ähnliche Struktur für die Myotome im unverläsionierten Zustand, und Bündel von Aktinfasern sind sichtbar. Es gibt eine sichtbare Störung der Myotomform im manuellen Läsionszustand, und es sind weniger Aktinfasern vorhanden. Dies zeigt erhebliche Muskelschäden. Im Laserläsionszustand bleibt jedoch die Chevronstruktur des Myoms erhalten. Es gibt einige Schäden an den Muskelfasern, aber dies ist in einem oder zwei Myotomen enthalten, verglichen mit vier im manuellen Läsionszustand. Darüber hinaus gibt es geringfügige Hautschäden im Laserläsionszustand im Vergleich zum manuellen Läsionszustand, wie in Bildern mit einem Stereomikroskop in Abbildung 7C gezeigt.

Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass reproduzierbare, halbautomatische Laserläsionen das Potenzial haben, ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der neuronalen Regeneration in Zebrafischen zu sein.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung des halbautomatischen Laserverletzungs-Workflows. Drei Tage nach der Befruchtung (dpf) werden die Larven in eine 96-Well-Platte geladen und auf die automatisierte Larven-Handling-Plattform gelegt. Dann wird jede Larve in eine Kapillare geladen, die unter einer 10x NA 0,5-Linse auf einem aufrechten Mikroskop für die Bildgebung und Laserläsion platziert wird. Nach Läsionen werden Larven zur Sammlung und weiteren Experimenten auf eine neue 96-Well-Platte entladen. Auf der Oberseite, Transmissions- und Fluoreszenzbilder von tg(Xla.Tubb:DsRed) 3 dpf Larven vor und nach der Laserläsion (Skalenbalken = 50 μm). Larven sind rostral links und dorsal nach oben orientiert (für alle Figuren). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Software-Inbetriebnahme für das halbautomatische Zebrafischlarven-Bildgebungssystem und Lasersteuerungssystem. (A) VAST-Software bei der Inbetriebnahme. (B) Das Hauptfenster der VAST-Software zeigt die leere Kapillare. (C) LP Sampler-Fenster mit einer leeren Plattenschablone. (D) Die Ansicht der Python-IDE, in der das Watch_for_ROIs_py3.py Skript ausgeführt wird. Das orangefarbene Rechteck zeigt auf die Terminallasche mit Meldungen, die während der Initialisierung des Laserdämpfers angezeigt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Beispiel für eine Laserläsionssequenz auf tg(Xla.Tubb:DsRed) 3 dpf-Larven. (A) Der erste Schritt der Laserläsion mit einer 20-μm-Linie nach Auswahl des Linien-ROI-Tools aus der ImageJ-Symbolleiste. (B) Zweiter Schritt mit einer 80-μm-Leitung zur vollständigen Durchtrennung des Rückenmarks. (C) Ansicht des Skripts, das zur Steuerung des Lasers von ImageJ verwendet wird. (D) Die Abfolge der Bilder während Laserläsionen. Oben: vor der Läsion; Mitte: unmittelbar nach dem ersten Schritt; Unten: unmittelbar nach dem zweiten Schritt (Maßstabsleiste = 50 μm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Acetylierte Tubulin-Immunfärbung (A-C) und Calcium-Bildgebung (D,E) deuten darauf hin, dass die Laserläsion die Kontinuität des Wirbelsäulengewebes vollständig stört. (A) Intaktes Rückenmark. (B) Vollständige Transsektion der Wirbelsäule, die eine vollständige Störung des Rückenmarksgewebes sowohl entlang der dorsal-ventralen als auch der medial-lateralen Achse zeigt. (C) Unvollständige Transsektion. (Skalenleiste = 50 μm). (D) Transected spinal cord on a tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) 3 dpf larva. Die Rechtecke zeigen die ROIs, die zur Quantifizierung der Fluoreszenzintensität auf der rostralen (blauen) und kaudalen (orange) Seite der Läsion verwendet werden. (E) Diagramm der Fluoreszenzintensitätsänderungen im Laufe der Zeit in den ROIs der Rostral- und Schwanzanalyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Eine Laserverletzung löst eine Immunantwort aus und führt zu einer erfolgreichen anatomischen und funktionellen Erholung. (A-D) Die maximale Intensität Projektionsfluoreszenzbilder einer tg(Xla.Tubb:DsRed) 3dpf Larve vor (A) und zu verschiedenen Zeiten nach der Laserläsion: nach 3 h (B), nach 24 h (C) und nach 48 h (D). (E-G) Die Verwendung von Calcium-Bildgebung zur Beurteilung der Funktionswiederherstellung. (E) Läsionierte tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) Larve mit Analyse-ROIs. (F) Diagramm der Fluoreszenzintensitätsänderungen im Laufe der Zeit in den ROIs der Rostral- und Schwanzanalyse. (G) Quantifizierung des Verhältnisses zwischen kaudalen und rostralen Spike-Amplituden (Connectivity Restoration Index) bei 3, 24, 48 h nach der Läsion (N = 3). (H-I) Charakterisierung der Immunantwort nach Läsion. (H) Fluoreszenzbilder von entläsionierten (links) und läsionierten (rechts) tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) 3 dfp-Larven, die die Ansammlung von Makrophagen (MPEG1+ Zelle, grün) bei 6 HPI zeigen. (I) Quantifizierung der Anzahl der Makrophagen bei 6 h nach der Läsion bei verletzten und intakten Larven (N = 3) (Skalenbalken = 50 μm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 6
Abbildung 6: Die läsionsinduzierte Erzeugung von Motoneuronen ist vergleichbar zwischen Laser- und manueller Läsion. (A-C) Bilder aus dem ApoTome-Mikroskop von tg(mnx1:gfp) 5 dpf-Larven mit EdU-Färbung, unter Laserläsionen (A), manuellen Läsionen (B) und unersionierten (C) Bedingungen. Pfeilspitzen kennzeichnen Zellen, die für beide Marker doppelt beschriftet sind. Maßstabsleiste = 100 μm. (A'-C') Höhere Vergrößerung von doppelt markierten Zellen, die durch weiße Kästchen gekennzeichnet sind. (D) Quantifizierung der Zellzahlen für die Anzahl der kolokalisierten Zellen in jeder Larve. 50-μm-Fenster wurden auf beiden Seiten der Verletzungsstelle platziert, und kolokalisierte Zellen wurden in allen Z-Stack-Bildern gezählt. Die Einweg-ANOVA wurde mit Tukeys Post-hoc-Test27 durchgeführt. Kein signifikanter Unterschied zwischen Laser- und manuellen Läsionen (p = 0,909). Signifikant weniger mnx1:gfp+/EdU+-Zellen in unbelasteten Kontrollen im Vergleich zu Laserläsionen (2,4-fache Veränderung, p = 0,011) und manuellen Läsionen (2,3-fache Veränderung, p = 0,018). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 7
Abbildung 7: Die Laserläsion verursacht weniger Muskel- und Hautschäden als die manuelle Läsion. (A-B) Einzelne Z-Stack-Bilder von tg(beta-actin:utrophin-mCherry) 3 dpf Larven unter den unlässen, manuellen Läsions- und Laserläsionsbedingungen, aufgenommen am konfokalen Mikroskop bei 20-facher Vergrößerung. Weiße Pfeile kennzeichnen die Verletzungsstelle. Skalenbalken = 50 μm. (A) bezeichnet Z-Stapel, bei denen Rückenmark und Notochord sichtbar sind. SC kennzeichnet das Rückenmark und NC das Notochord. (B) bezeichnet Z-Stacks, bei denen die Muskelfasern sichtbar sind. (C) Die Bilder wurden auf dem Stereomikroskop von 3 dpf-Larven unter den Bedingungen der unesionierten, manuellen Läsion und Laserläsion aufgenommen. Larven wurden mit Wolframdrahtstiften (sichtbar im Laserläsionsbild) an eine Plattform gepinnt. Die Blackbox kennzeichnet die Läsionsstelle. Maßstabsleiste = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzende Datei 1: Die experimentellen Details des Protokolls. Die Erzeugung der transgenen Zebrafischlinien, manuelle Rückenmarksverletzungen, Acetyliert-Tubulin-Immunhistochemie, Hb9/EdU-Färbung, Bildgebung sowie Bildverarbeitung und -analyse werden beschrieben. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Es besteht ein dringender Bedarf an einem tieferen Verständnis der Prozesse, die während der Regeneration in Zebrafischen ablaufen. Dieses Tiermodell bietet viele Vorteile für die biomedizinische Forschung, insbesondere für Rückenmarksverletzungen1. Die meisten Studien beinhalten manuelle Läsionen, die einen gut ausgebildeten Bediener erfordern und Multigewebeschäden verursachen. Hier wird ein Laserläsionsprotokoll vorgestellt, das die Kontrolle über die Läsionseigenschaften und die Verringerung der Schädigung des umgebenden Gewebes ermöglicht. Darüber hinaus ist diese Technik einfach genug, um von relativ ungeschulten Experimentatoren erfolgreich angewendet zu werden.

Kritische Schritte im Protokoll sind die Kalibrierung des Lasers und die Definition von ROIs. In der Praxis ist die Kalibrierung sehr stabil (auch für Monate), und sobald die richtige Größe und Position des ROI bestimmt wurde, ist die Verwendung dieser Technik unkompliziert. Obwohl das Protokoll beschrieb, wie die Läsionen auf bestimmten Geräten durchgeführt werden, sind die meisten Vorteile von Laserläsionen für verschiedene Systeme verfügbar, z. B. ein Spinnscheibenmikroskop.

Die Haupteinschränkungen dieses Protokolls sind die Notwendigkeit, einen Fluoreszenzreporter des Rückenmarks zu verwenden und die Zeit, die benötigt wird, um die Läsionen durchzuführen (~ 5 min / Fisch). Letzteres wird durch eine hohe Reproduzierbarkeit kompensiert, die weniger Tiere erfordert. Manuelle Läsionen sind jedoch immer noch für Anwendungen wie Drogentests geeignet, bei denen viele läsionierte Tiere benötigt werden. Wie hier gezeigt, ist das Ausmaß der läsionsinduzierten Neurogenese zwischen Laser- und manuellen Läsionen vergleichbar.

Laserverletzungen haben jedoch ein enormes Anwendungspotenzial, von denen einige mit den einzigartigen Vorteilen zusammenhängen. Zum Beispiel ermöglicht eine rotierende Kapillare die kontrollierte Durchführung von Läsionen in einer Vielzahl von Positionen. Zum Beispiel könnte es verwendet werden, um die Axotomie einzelner Neuronen in Mauthner-Zellen zu induzieren (Daten nicht gezeigt), wie auch in der Arbeit von Bhatt et al.15 gezeigt wurde. Dies wäre mit manuellen Läsionen nicht möglich.

Die Ergebnisse zeigen auch, dass die Schädigung hauptsächlich auf das Rückenmark beschränkt ist, mit minimaler Schädigung des umgebenden Gewebes. Dies könnte bedeuten, dass zelluläre Reaktionen, die nach einer Laserläsion beobachtet werden, eher dem Rückenmark zugeschrieben werden als Signale von anderen beschädigten Geweben. Es könnte auch bedeuten, dass laserläsionierte Larven eher in der Lage sind, weiteren Vorbereitungen für Experimente standzuhalten. Zum Beispiel beinhaltet die Dissektion für die Elektrophysiologie das Entfernen der Rumpfhaut mit einer Pinzette 28,29,30, was zu einem hohen mechanischen Druck auf die bereits empfindliche Verletzungsstelle führen und die Gefahr bergen würde, dass axonale Verbindungen wieder unterbrochen werden. Die Integrität von Haut und Muskelgewebe, die in laserläsionierten Larven beobachtet wird, könnte die Läsionsstelle vor weiteren Schäden schützen und zu einer genaueren Darstellung des erreichten Regenerationsgrades führen.

Darüber hinaus begrenzt die verbesserte Lokalisierung von Schäden nach Laserverletzungen die Ausweitung der Kopplung zwischen verschiedenen Regenerationsprozessen, was subtilere Prozesse bei der Verwendung manueller Läsionen maskieren kann. Der hier beschriebene Ansatz zur experimentellen Verletzung in den Larvenzebrafischen könnte eine Reihe neuer Untersuchungen im Kontext der quantitativen Biologie, der biologischen Physik und der computergestützten Biologie eröffnen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgments

Diese Studie wurde vom BBSRC unterstützt (BB/S0001778/1). CR wird vom Princess Royal TENOVUS Scotland Medical Research Scholarship Programme finanziert. Wir danken David Greenald (CRH, University of Edinburgh) und Katy Reid (CDBS, University of Edinburgh) für das freundliche Geschenk transgener Fische (siehe Supplementary File). Wir danken Daniel Soong (CRH, University of Edinburgh) für den freundlichen Zugang zum 3i Spinning-Disk Konfokal.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Software
Microscope software Zen Blue 2.0 Carl Zeiss
ImageJ/FIJI Open-Source
Visual Studio Code Microsoft
Microscope and accessories
ApoTome microscope Carl Zeiss
C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens Carl Zeiss
dual AxioCam 506 m CCD cameras Carl Zeiss
Laser scanning confocal microscope LSM880 Carl Zeiss
Spinning-disk module CSU-X1 Yokogawa
Upright microscopeAxio Examiner D1 Carl Zeiss
UV laser Micropoint
VAST BioImager Union Biometrica
Labware
90 mm Petri dish Thermo-Fisher 101R20
96-well plate Corning 3841
Chemicals
Click-It EdU Imaging Kit Invitrogen C10637
aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222) Sigma-Aldrich A5040
phenylthiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629
Antibodies
Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488 Jackson 703-545-155
Donkey anti-mouse Cy3 Jackson 715-165-150
Mouse anti-GFP Abcam AB13970
Mouse anti-tubulin acetylated antibody Sigma T6793
Transgenic zebrafish lines
Tg(beta-actin:utrophin-mCherry) N/A Established by David Greenhald, University of Edinburgh
Tg(mnx1:gfp) N/A First described in [Flanagan-Steet et al. 2005]
Tg(Xla.Tubb:DsRed) N/A First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008]
Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) N/A Established by Katy Reid, University of Edinburgh
Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) N/A Established by David Greenhald, University of Edinburgh

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References

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Medizin Ausgabe 177

Erratum

Formal Correction: Erratum:Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
Posted by JoVE Editors on 04/07/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae. The title was updated.

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Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

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Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

Kontrollierte halbautomatische laserinduzierte Verletzungen zur Untersuchung der Rückenmarksregeneration bei Zebrafischlarven
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El-Daher, F., Early, J. J.,… More

El-Daher, F., Early, J. J., Richmond, C. E., Jamieson, R., Becker, T., Becker, C. G. Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (177), e63259, doi:10.3791/63259 (2021).

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