Lesioni indotte da laser semi-automatizzate controllate per lo studio della rigenerazione del midollo spinale nelle larve di zebrafish
Summary
Il presente protocollo descrive un metodo per indurre lesioni tessuto-specifiche e altamente riproducibili nelle larve di zebrafish utilizzando un sistema di lesione laser combinato con una piattaforma microfluidica automatizzata per la manipolazione delle larve.
Abstract
Le larve di zebrafish possiedono un sistema nervoso centrale (SNC) completamente funzionale con un’elevata capacità rigenerativa solo pochi giorni dopo la fecondazione. Questo rende questo modello animale molto utile per studiare le lesioni e la rigenerazione del midollo spinale. Il protocollo standard per indurre tali lesioni è quello di transettare manualmente la parte dorsale del tronco. Tuttavia, questa tecnica richiede un ampio allenamento e danneggia i tessuti aggiuntivi. È stato sviluppato un protocollo per le lesioni indotte dal laser per aggirare queste limitazioni, consentendo un’elevata riproducibilità e completezza della transezione del midollo spinale su molti animali e tra diverse sessioni, anche per un operatore non addestrato. Inoltre, il danno tissutale è principalmente limitato al midollo spinale stesso, riducendo gli effetti confondenti derivanti dalla lesione di diversi tessuti, ad esempio pelle, muscoli e SNC. Inoltre, sono possibili emi-lesioni del midollo spinale. Una migliore conservazione dell’integrità dei tessuti dopo una lesione laser facilita ulteriori dissezioni necessarie per ulteriori analisi, come l’elettrofisiologia. Quindi, questo metodo offre un controllo preciso dell’entità della lesione che è irraggiungibile manualmente. Ciò consente nuovi paradigmi sperimentali in questo potente modello in futuro.
Introduction
A differenza dei mammiferi, il pesce zebra (Danio rerio) può riparare il loro sistema nervoso centrale (SNC) dopo un infortunio1. L’uso di larve di zebrafish come modello per la rigenerazione del midollo spinale è relativamente recente. Si è dimostrato utile studiare i meccanismi cellulari e molecolari alla base della riparazione2. Ciò è dovuto alla facilità di manipolazione, al breve ciclo sperimentale (nuove larve ogni settimana), alla trasparenza ottica dei tessuti e alle piccole dimensioni delle larve, ideali per la microscopia a fluorescenza in vivo .
Nel caso della rigenerazione del midollo spinale, due ulteriori vantaggi dell’utilizzo delle larve sono la velocità di recupero, pochi giorni rispetto a poche settimane per gli adulti, e la facilità di indurre lesioni utilizzando tecniche manuali. Questo è stato utilizzato con successo in molti studi3,4,5, comprese recenti indagini6,7. Nel complesso, ciò porta a una maggiore produzione di dati significativi, un’elevata adattabilità dei protocolli sperimentali e una diminuzione dei costi sperimentali. L’uso di larve di età inferiore ai 5 giorni dopo la fecondazione riduce anche l’uso di animali seguendo i principi 3R nella ricerca sugli animali8.
Dopo una lesione del midollo spinale nelle larve di zebrafish, si verificano molti processi biologici, tra cui la risposta infiammatoria, la proliferazione cellulare, la neurogenesi, la migrazione delle cellule sopravvissute o di nuova generazione, la riforma degli assoni funzionali e un rimodellamento globale dei circuiti dei processi neurali e dei tessuti della colonna vertebrale6,7,9,10 . Per essere orchestrati con successo, questi processi comportano un’interazione finemente regolata tra una gamma di tipi di cellule, componenti della matrice extracellulare e segnali biochimici11,12. Svelare i dettagli di questa significativa riorganizzazione di un tessuto complesso come il midollo spinale richiede l’uso e lo sviluppo di approcci sperimentali precisi e controllati.
Il paradigma sperimentale primario utilizzato per studiare la rigenerazione del midollo spinale nel pesce zebra è quello di utilizzare mezzi chirurgici per indurre danni ai tessuti mediante resezione, pugnalata o crioigiura3,13. Questi approcci hanno lo svantaggio di richiedere una formazione specifica nelle competenze di microchirurgia, che richiede tempo per qualsiasi nuovo operatore e può impedirne l’uso in progetti a breve termine. Inoltre, di solito inducono danni ai tessuti circostanti, che possono influenzare la rigenerazione.
Un altro approccio consiste nell’indurre danni cellulari chimicamente14 o mediante manipolazioni genetiche15. Quest’ultimo consente danni altamente mirati. Tuttavia, tale tecnica richiede un lungo lavoro preparatorio per generare nuovi pesci transgenici prima di fare qualsiasi esperimento, rinnovato ogni volta che viene preso di mira un tipo di cellula unico.
C’è, quindi, la necessità di un metodo che consenta lesioni mirate ma versatili adatte a una varietà di studi sulla rigenerazione. Una soluzione consiste nell’utilizzare un laser per indurre danni localizzati nel tessuto di interesse16,17,18,19,20. In effetti, l’uso del danno tissutale indotto dal laser presenta un approccio robusto per generare lesioni del midollo spinale con molti vantaggi. I microscopi dotati di tali moduli di manipolazione laser consentono di specificare un’area sagomata personalizzata in cui si verificherà l’ablazione cellulare, con l’ulteriore vantaggio del controllo temporale. La dimensione e la posizione della lesione possono quindi essere adattate per rispondere a qualsiasi domanda.
La caratteristica mancante della maggior parte dei sistemi di lesioni laser è la possibilità di indurre lesioni in modo altamente riproducibile per una serie di larve. Qui viene descritto un protocollo originale che utilizza un laser UV per indurre lesioni semi-automatizzate precise e controllate nelle larve di zebrafish basate su una piattaforma microfluidica progettata per la manipolazione automatizzata delle larve21. Inoltre, nel sistema qui presentato, le larve sono inserite in un capillare di vetro, che consente la libera rotazione dell’animale attorno al suo asse rostrocaudale. L’utente può scegliere quale lato della larva presentare al laser, consentendo al contempo l’imaging a fluorescenza per indirizzare con precisione il raggio laser e valutare il danno dopo la lesione.
Il protocollo qui descritto viene utilizzato con un sistema di imaging semi-automatizzato delle larve di zebrafish combinato con un disco rotante dotato di un laser UV (designato di seguito come sistema VAST). Tuttavia, i punti principali del protocollo e la maggior parte delle affermazioni della tecnica sono validi per qualsiasi sistema dotato di un laser in grado di ablazione cellulare, compresi microscopi a scansione laser a due fotoni, microscopi a disco rotante dotati di un laser UV (modulo FRAP) o videomicroscopi con un modulo laser per la manipolazione fotografica. Una delle principali differenze tra il sistema VAST e la gestione convenzionale dei campioni sarà che per quest’ultimo sarà necessario montare larve in agarosio a basso punto di fusione su coperture di vetro / piastre di Petri con fondo di vetro invece di caricarle in una piastra a 96 pozzetti.
I benefici offerti da questo metodo aprono opportunità di ricerca innovativa sui meccanismi cellulari e molecolari durante il processo di rigenerazione. Inoltre, l’elevata qualità dei dati consente indagini quantitative in un contesto multidisciplinare.
Protocol
Representative Results
Discussion
C’è un urgente bisogno di una comprensione più profonda dei processi in gioco durante la rigenerazione nel pesce zebra. Questo modello animale offre molti vantaggi per la ricerca biomedica, in particolare per le lesioni del midollo spinale1. La maggior parte degli studi riguarda lesioni manuali che richiedono un operatore ben addestrato e inducono danni multi-tessuto. Qui viene presentato un protocollo di lesione laser, che consente il controllo delle caratteristiche della lesione e la riduzione…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato supportato dal BBSRC (BB/S0001778/1). CR è finanziato dal Princess Royal TENOVUS Scotland Medical Research Scholarship Programme. Ringraziamo David Greenald (CRH, Università di Edimburgo) e Katy Reid (CDBS, Università di Edimburgo) per il gentile dono del pesce transgenico (Vedi file supplementare). Ringraziamo Daniel Soong (CRH, Università di Edimburgo) per il gentile accesso alla confocale a disco rotante 3i.
Materials
| Software | |||
| Microscope software Zen Blue 2.0 | Carl Zeiss | ||
| ImageJ/FIJI | Open-Source | ||
| Visual Studio Code | Microsoft | ||
| Microscope and accessories | |||
| ApoTome microscope | Carl Zeiss | ||
| C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens | Carl Zeiss | ||
| dual AxioCam 506 m CCD cameras | Carl Zeiss | ||
| Laser scanning confocal microscope LSM880 | Carl Zeiss | ||
| Spinning-disk module CSU-X1 | Yokogawa | ||
| Upright microscopeAxio Examiner D1 | Carl Zeiss | ||
| UV laser | Micropoint | ||
| VAST BioImager | Union Biometrica | ||
| Labware | |||
| 90 mm Petri dish | Thermo-Fisher | 101R20 | |
| 96-well plate | Corning | 3841 | |
| Chemicals | |||
| Click-It EdU Imaging Kit | Invitrogen | C10637 | |
| aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Antibodies | |||
| Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488 | Jackson | 703-545-155 | |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Jackson | 715-165-150 | |
| Mouse anti-GFP | Abcam | AB13970 | |
| Mouse anti-tubulin acetylated antibody | Sigma | T6793 | |
| Transgenic zebrafish lines | |||
| Tg(beta-actin:utrophin-mCherry) | N/A | Established by David Greenhald, University of Edinburgh | |
| Tg(mnx1:gfp) | N/A | First described in [Flanagan-Steet et al. 2005] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed) | N/A | First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) | N/A | Established by Katy Reid, University of Edinburgh | |
| Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) | N/A | Established by David Greenhald, University of Edinburgh |
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