Kontrollerte halvautomatiske laserinduserte skader for å studere ryggmargsregenerering i sebrafisk larver
Summary
Den nåværende protokollen beskriver en metode for å indusere vevsspesifikke og svært reproduserbare skader i sebrafisk larver ved hjelp av et laserlesjonssystem kombinert med en automatisert mikrofluidisk plattform for larvehåndtering.
Abstract
Sebrafisk larver har et fullt funksjonelt sentralnervesystem (CNS) med høy regenerativ kapasitet bare noen få dager etter befruktning. Dette gjør denne dyremodellen veldig nyttig for å studere ryggmargsskade og regenerering. Standardprotokollen for å indusere slike lesjoner er å transektere den dorsale delen av stammen manuelt. Denne teknikken krever imidlertid omfattende trening og skader ekstra vev. En protokoll ble utviklet for laserinduserte lesjoner for å omgå disse begrensningene, noe som muliggjør høy reproduserbarhet og fullstendig ryggmargstranseksjon over mange dyr og mellom forskjellige økter, selv for en utrent operatør. Videre er vevsskade hovedsakelig begrenset til selve ryggmargen, noe som reduserer forvirrende effekter fra å skade forskjellige vev, for eksempel hud, muskler og CNS. Videre er hemi-lesjoner i ryggmargen mulig. Forbedret bevaring av vevsintegritet etter laserskade letter ytterligere disseksjoner som trengs for ytterligere analyser, for eksempel elektrofysiologi. Derfor gir denne metoden presis kontroll over skadeutbredelsen som ikke kan oppnås manuelt. Dette gir mulighet for nye eksperimentelle paradigmer i denne kraftige modellen i fremtiden.
Introduction
I motsetning til pattedyr kan sebrafisk (Danio rerio) reparere sentralnervesystemet (CNS) etter skade1. Bruken av sebrafisk larver som modell for ryggmargsregenerering er relativt nylig. Det har vist seg verdifullt å undersøke de cellulære og molekylære mekanismene som ligger til grunn for reparasjon2. Dette skyldes enkel manipulering, den korte eksperimentelle syklusen (nye larver hver uke), vevets optiske gjennomsiktighet og larvenes lille størrelse, ideelt egnet for in vivo fluorescensmikroskopi.
Ved regenerering av ryggmargen er to ekstra fordeler ved å bruke larver hastigheten på utvinning, noen dager sammenlignet med noen uker for voksne, og den enkle å indusere skader ved hjelp av manuelle teknikker. Dette har blitt brukt i mange studier3,4,5, inkludert nyere undersøkelser6,7. Totalt sett fører dette til økt meningsfull dataproduksjon, høy tilpasningsevne av eksperimentelle protokoller og reduserte eksperimentelle kostnader. Bruken av larver yngre enn 5 dager etter befruktning reduserer også bruken av dyr etter 3R-prinsippene i dyreforskning8.
Etter en ryggmargsskade i sebrafisk larver, forekommer mange biologiske prosesser, inkludert inflammatorisk respons, celleproliferasjon, nevrogenese, migrasjon av overlevende eller nylig genererte celler, reformasjon av funksjonelle aksoner og en global ombygging av nevrale prosesser kretser og ryggvev6,7,9,10 . For å lykkes orkestrert, innebærer disse prosessene en finregulert interaksjon mellom en rekke celletyper, ekstracellulære matrisekomponenter og biokjemiske signaler11,12. Unraveling detaljene i denne betydelige omorganiseringen av et komplekst vev som ryggmargen krever bruk og utvikling av presise og kontrollerte eksperimentelle tilnærminger.
Det primære eksperimentelle paradigmet som brukes til å studere ryggmargsregenerering i sebrafisk er å bruke kirurgiske midler for å indusere vevsskader ved reseksjon, stabbing eller kryoinjury3,13. Disse tilnærmingene har ulempen med å kreve spesifikk opplæring i mikrokirurgiferdigheter, noe som er tidkrevende for enhver ny operatør og kan forhindre bruk i kortsiktige prosjekter. Videre fremkaller de vanligvis skade på det omkringliggende vevet, noe som kan påvirke regenerering.
En annen tilnærming er å indusere celleskade kjemisk14 eller ved genetiske manipulasjoner15. Sistnevnte gir svært målrettet skade. En slik teknikk krever imidlertid langt forberedende arbeid for å generere ny transgen fisk før du gjør noe eksperiment, fornyet hver gang en unik celletype er målrettet.
Det er dermed behovet for en metode som tillater målrettede, men allsidige lesjoner som passer til en rekke studier i regenerering. En løsning er å bruke en laser for å indusere lokalisert skade i vev av interesse16,17,18,19,20. Faktisk presenterer bruken av laserindusert vevsskade en robust tilnærming for å generere ryggmargslesjoner med mange fordeler. Mikroskopene utstyrt med slike lasermanipuleringsmoduler gjør det mulig å spesifisere et tilpasset formet område der celleablasjon vil oppstå, med den ekstra fordelen av temporal kontroll. Lesjonens størrelse og posisjon kan dermed tilpasses for å ta opp eventuelle spørsmål.
Den manglende egenskapen til de fleste laserlesjonssystemer er muligheten til å indusere skader på en svært reproduserbar måte for en rekke larver. Her beskrives en original protokoll ved hjelp av en UV-laser for å indusere halvautomatiske presise og kontrollerte lesjoner i sebrafisklarver basert på en mikrofluidisk plattform designet for automatisert larvehåndtering21. Videre, i systemet som presenteres her, settes larver inn i en glasskapillær, noe som tillater fri rotasjon av dyret rundt rostrocaudalaksen. Brukeren kan velge hvilken side av larven som skal presenteres for laseren, samtidig som fluorescensavbildningen kan målrette laserstrålen nøyaktig og vurdere skaden etter lesjonen.
Protokollen beskrevet her brukes med et halvautomatisk sebrafisk larver bildebehandlingssystem kombinert med en spinnende disk utstyrt med en UV-laser (utpekt heretter som VAST-systemet). Imidlertid er hovedpunktene i protokollen og de fleste påstandene om teknikken gyldige for ethvert system utstyrt med en laser som er i stand til celleablasjon, inkludert to-foton laserskanningsmikroskoper, spinneskivemikroskoper utstyrt med en UV-laser (FRAP-modul) eller videomikroskoper med en lasermodul for fotomanipulering. En av de viktigste forskjellene mellom VAST-systemet og konvensjonell prøvehåndtering vil være at for sistnevnte vil monteringslarver i lavsmeltende punkt agarose på glassdeksler / glassbunn Petri-retter i stedet for å laste dem i en 96-brønns tallerken være nødvendig.
Fordelene ved denne metoden åpner muligheter for innovativ forskning på cellulære og molekylære mekanismer under regenereringsprosessen. Videre åpner den høye datakvaliteten for kvantitative undersøkelser i en tverrfaglig sammenheng.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det er et presserende behov for en dypere forståelse av prosessene som spilles under regenerering i sebrafisk. Denne dyremodellen gir mange fordeler for biomedisinsk forskning, spesielt for ryggmargsskader1. De fleste studiene involverer manuelle lesjoner som krever en godt trent operatør og induserer multivevsskader. En laserlesjonsprotokoll presenteres her, slik at kontroll over lesjonsegenskapene og redusert skade på det omkringliggende vevet. Videre er denne teknikken lett nok til å kunne …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av BBSRC (BB/S0001778/1). CR er finansiert av Princess Royal TENOVUS Scotland Medical Research Scholarship Programme. Vi takker David Greenald (CRH, University of Edinburgh) og Katy Reid (CDBS, University of Edinburgh) for den slags gave av transgen fisk (Se Supplementary File). Vi takker Daniel Soong (CRH, University of Edinburgh) for den vennlige tilgangen til 3i spinning-disk confocal.
Materials
| Software | |||
| Microscope software Zen Blue 2.0 | Carl Zeiss | ||
| ImageJ/FIJI | Open-Source | ||
| Visual Studio Code | Microsoft | ||
| Microscope and accessories | |||
| ApoTome microscope | Carl Zeiss | ||
| C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens | Carl Zeiss | ||
| dual AxioCam 506 m CCD cameras | Carl Zeiss | ||
| Laser scanning confocal microscope LSM880 | Carl Zeiss | ||
| Spinning-disk module CSU-X1 | Yokogawa | ||
| Upright microscopeAxio Examiner D1 | Carl Zeiss | ||
| UV laser | Micropoint | ||
| VAST BioImager | Union Biometrica | ||
| Labware | |||
| 90 mm Petri dish | Thermo-Fisher | 101R20 | |
| 96-well plate | Corning | 3841 | |
| Chemicals | |||
| Click-It EdU Imaging Kit | Invitrogen | C10637 | |
| aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Antibodies | |||
| Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488 | Jackson | 703-545-155 | |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Jackson | 715-165-150 | |
| Mouse anti-GFP | Abcam | AB13970 | |
| Mouse anti-tubulin acetylated antibody | Sigma | T6793 | |
| Transgenic zebrafish lines | |||
| Tg(beta-actin:utrophin-mCherry) | N/A | Established by David Greenhald, University of Edinburgh | |
| Tg(mnx1:gfp) | N/A | First described in [Flanagan-Steet et al. 2005] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed) | N/A | First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) | N/A | Established by Katy Reid, University of Edinburgh | |
| Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) | N/A | Established by David Greenhald, University of Edinburgh |
References
- Becker, C. G., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
- Ohnmacht, J., et al. Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish. Development. 143 (9), 1464-1474 (2016).
- Anguita-Salinas, C., et al. Cellular dynamics during spinal cord regeneration in larval zebrafish. Developmental Neuroscience. 41 (1-2), 112-122 (2019).
- Chapela, D., et al. A zebrafish drug screening platform boosts the discovery of novel therapeutics for spinal cord injury in mammals. Scientific Reports. 9, 1-12 (2019).
- Schlüßler, R., et al. Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging. Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).
- Cavone, L., et al. A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord. Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).
- Keatinge, M., et al. CRISPR gRNA phenotypic screening in zebrafish reveals pro-regenerative genes in spinal cord injury. PLoS Genetics. 17 (4), 1-21 (2021).
- . National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research Available from: https://nc3rs.org.uk (2021)
- Hui, S. P., et al. Genome wide expression profiling during spinal cord regeneration identifies comprehensive cellular responses in Zebrafish. PLOS ONE. 9 (1), 1-23 (2014).
- Vasudevan, D., et al. Regenerated interneurons integrate into locomotor circuitry following spinal cord injury. Experimental Neurology. 342, 1-10 (2021).
- Becker, T., Becker, C. G. Dynamic cell interactions allow spinal cord regeneration in zebrafish. Current Opinion in Physiology. 14, 64-69 (2020).
- Wehner, D., et al. Wnt signaling controls pro-regenerative Collagen XII in functional spinal cord regeneration in zebrafish. Nature Communications. 8 (126), 1-16 (2017).
- Briona, L. K., Dorsky, R. I. Spinal cord transection in the larval Zebrafish. Journal of Visualised Experiments: JoVE. (87), (2014).
- Kamei, C. N., Liu, Y., Drummond, I. A. Kidney regeneration in adult Zebrafish by gentamicin induced injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), (2015).
- Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits. Science. 305 (5681), 254-258 (2004).
- Xu, Y., Chen, M., Hu, B., Huang, R., Hu, B. In vivo imaging of mitochondrial transport in single-axon regeneration of zebrafish mauthner cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11 (4), 1-12 (2017).
- Nichols, E. L., Smith, C. J. Functional regeneration of the sensory root via axonal invasion. Cell Reports. 30 (1), 9-17 (2020).
- Ellström, I. D., et al. Spinal cord injury in zebrafish induced by near-infrared femtosecond laser pulses. Journal of Neuroscience Methods. 311, 259-266 (2016).
- Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. Microglia exit the CNS in spinal root avulsion. PLOS Biology. 17 (2), 1-30 (2019).
- Early, J. J., et al. An automated high-resolution in vivo screen in zebrafish to identify chemical regulators of myelination. eLife. , 1-31 (2018).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- . AndOr Micropoint Manual Available from: https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual (2021)
- Knafo, S., et al. Mechanosensory neurons control the timing of spinal microcircuit selection during locomotion. eLife. 6, 25260 (2017).
- Tsarouchas, T. M., et al. Dynamic control of proinflammatory cytokines Il-1β and Tnf-α by macrophages in zebrafish spinal cord regeneration. Nature Communications. 9, (2018).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Howell, D. . Statistical methods for psychology. , 324-325 (2002).
- Tukey, J. Comparing individual means in the analysis of variance. Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).
- Song, M., Mohamad, O., Chen, D., Yu, S. P. Coordinated development of voltage-gated Na+ and K+ currents regulates functional maturation of forebrain neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (10), 1551-1563 (2013).
- Hong, S., Lee, P., Baraban, S., Lee, L. P. A novel long-term, multi-channel and non-invasive electrophysiology platform for Zebrafish. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
- Menelaou, E., McLean, D. L. Hierarchical control of locomotion by distinct types of spinal V2a interneurons in zebrafish. Nature Communications. 10, 1-12 (2019).
