Abstract
内皮是一种动态的综合结构,在血管生成、止血、炎症和体内平衡等许多生理功能中起重要作用。内皮在动脉粥样硬化、高血压和糖尿病等病理生理学中也起着重要作用。内皮细胞形成血液和淋巴管的内层,在结构和功能上表现出异质性。各种小组已经评估了来源于人外周血的内皮细胞的功能,重点是来源于造血干细胞或成熟血液生长内皮细胞(或内皮集落形成细胞)的内皮祖细胞。这些细胞为治疗和疾病建模提供了自体资源。异种细胞可以提供另一种治疗来源,因为它们的可用性和同质性通过使用在类似条件下饲养的遗传相似的动物来实现。因此,已经提出了一种从猪外周血中分离和扩增高度增殖的血液生长内皮细胞的稳健方案。这些细胞可用于多种应用,如心血管组织工程、细胞治疗、疾病建模、药物筛选、研究内皮细胞生物学以及 体外 共培养,以研究异种移植中的炎症和凝血反应。
Introduction
内皮是一种高度复杂的动态结构,是血管壁的重要组成部分。它排列在血管的内表面,在循环血液和周围组织之间提供物理界面。已知这种异质结构执行各种功能,例如血管生成,炎症,血管调节和止血1,2,3,4。人脐静脉内皮细胞是一种被广泛研究的细胞类型,用于评估内皮细胞的功能。然而,患者特异性批次变异性、表型不一致和最小分裂效率表明需要确定可以改善所有这些特征的细胞来源5。
获得原代内皮细胞的均质群体在技术上可能具有挑战性,并且原代内皮细胞不具有高增殖能力6。因此,为了研究血管再生和评估病理生理过程,各个小组试图获得和评估来自外周血的不同类型的内皮细胞,例如内皮祖细胞(EPC)或血液生长内皮细胞(BOEC)6,7,8,9.纺锤形的早期EPC起源于造血干细胞(HSC),具有有限的生长效力和有限的血管生成能力,无法产生成熟的内皮细胞。此外,它们与炎性单核细胞非常相似。此外,它们进一步分化成功能性、增殖、成熟的内皮细胞的能力仍有争议6,7,9,10。外周血单核细胞 (PBMC) 的连续培养可产生称为晚期生长 EPC、BOEC 或内皮集落形成细胞 (ECFC) 的二次细胞群6,7,9,10。Medina等人在2018年承认EPC的局限性,其命名的模糊性,以及与EPC11下连续分组的许多不同细胞类型普遍缺乏一致性。相比之下,BOEC因其在血管修复,健康和疾病以及细胞治疗中的作用而得到认可。这些细胞的进一步研究和治疗使用将依赖于方案,以一致地从循环祖细胞中获取这些细胞类型。
BOEC等原代细胞可用作替代细胞,以获得高度增殖的成熟内皮细胞6。BOEC在表型上与早期EPC不同,并表现出典型的内皮特征,例如鹅卵石形态以及粘附连接和洞穴的表达12。Hebbel等人的基因分析13,14,15发现BOEC或ECFC是真正的内皮细胞,因为它们促进微血管和大血管的形成。因此,BOEC可以用作评估病理生理过程和遗传变异的工具16。它们也被认为是血管再生细胞疗法的极好细胞来源17。因此,一个标准化的方案来持续获得这些高度增殖的细胞是必不可少的。
虽然BOEC为研究人类病理生理和遗传变异提供了强大的工具,但更同质的BOEC来源可能会提供更强大和可靠的实验和治疗结果。通过使用来自在相似条件下饲养的遗传相似动物的异种细胞源,可以实现卓越的同质性18。虽然异种细胞来源容易引发宿主免疫反应,但正在开发免疫调节策略,目的是产生免疫相容的动物和动物产品,包括细胞。特别是猪,是外周血的丰富来源,由于与人类的解剖和生理相似性,通常用于研究医疗设备和其他疗法。因此,本研究完善了从猪外周血中分离和扩增高度增殖的BOEC的方案。下面详述的方案是一种从相对少量的血液中获取大量 BOEC 的简单可靠的方法。培养物可以通过多次传代扩增,以从单个血液样本中产生数百万个细胞。
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Protocol
所有动物研究均由威斯康星医学院和妙佑医疗国际各自的机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 批准。
注意:在这项研究中,使用了约克郡/兰德雷斯/杜洛克杂交家猪(Sus homeus),雄性和雌性,40-80公斤,3-6个月大。
1.猪外周血采集
- 准备材料。
- 在无菌盐水中将肝素溶液稀释至100U / mL。
- 向两个 50 mL 锥形管和两个 60 mL 注射器中各加入 3-4 mL 肝素溶液。
- 将未稀释的肝素溶液 (1,000 U/mL) 吸入延长管中。
- 将 19 G 针头连接到充满肝素的延长管的一端,将含肝素的 60 mL 注射器连接到另一端。
- 根据机构政策麻醉猪
- 肌内注射阿托品(0.05 mg/kg)、替他明/唑拉西泮(2-5 mg/kg)和甲苯噻嗪(2 mg/kg)以诱导麻醉。
注意:一旦动物失去知觉并且下颌肌肉不僵硬,就可以实现充分的麻醉。 - 将动物仰卧,并在两侧放置卷起的毛巾以提供稳定性。
- 在眼睛上涂抹眼药膏以防止麻醉时干燥。
- 麻醉期间提供热支持,包括毯子、加热垫和/或加热手术台。
- 肌内注射阿托品(0.05 mg/kg)、替他明/唑拉西泮(2-5 mg/kg)和甲苯噻嗪(2 mg/kg)以诱导麻醉。
- 用甜菜碱磨砂液清洁股骨腹股沟区域。
- 用 19 G 针刺穿股静脉或动脉,缓慢 (~1-2 mL/s) 将 50 mL 血液吸入注射器。
注意:绘制太快会损坏单元格。 - 将针头留在原位,立即扭结延长管并断开 60 mL 注射器
- 将血液缓慢转移到含肝素的 50 mL 锥形管中。
- 盖紧 50 mL 锥形管,轻轻倒置几次以混合,然后放在冰上。
- 将剩余的含肝素的 60 mL 注射器连接到延长管,解开延长管,然后慢慢将另外 50 mL 的血液吸入注射器。
- 立即从动脉或静脉中取出针头,并将延长管中的剩余血液缓慢抽入注射器。
- 断开 60 mL 注射器与延长管的连接,然后将血液缓慢转移到剩余的含肝素的 50 mL 锥形管中。
- 盖紧 50 mL 锥形管,轻轻倒置几次以混合,然后放在冰上。
- 对猪的股骨腹股沟区域施加压力止血。
- 根据机构政策回收猪。持续监测动物,直到它恢复足够的意识以维持胸骨卧位并返回常规的住房/狗窝区域。
2. 单核细胞的分离
- 在四个 50 mL 锥形管中用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 以 1:1 的比例稀释血液。
注意:这项工作需要使用无菌技术在细胞培养罩中进行,以避免污染细胞培养物。 - 将 25 mL 室温即用型密度梯度溶液加入 8 个 50 mL 锥形管中。
- 通过保持管与移液器尖端的锐角,沿着含有 50 mL 锥形管的每个密度梯度溶液的内部非常缓慢地移取 25 mL 血液/盐水溶液。
注意:血液溶液应轻轻地分层在密度梯度溶液的顶部,并保持明确的界面。 - 在560× g 和室温(RT)下离心管30分钟。
注意:为获得最佳效果,请尽可能禁用离心机制动器。 - 使用细移液管小心地从每个试管中收集血沉棕黄层(密度梯度溶液上方和透明血浆下方的单核细胞浑浊层),并均匀分布到两个新的 50 mL 锥形管中。丢弃含有管的密度梯度溶液。
注意:收集尽可能多的血沉棕黄层,同时尽可能少地收集密度梯度溶液和等离子体。
3. 细胞的洗涤和电镀
- 用纤连蛋白涂覆 6 孔板。
- 通过在无菌水中将其稀释至1mg / mL来制备人血浆纤连蛋白的储备溶液。将等分试样储存在-20°C。
- 通过将 600 μL 纤连蛋白储备溶液稀释在 3 mL PBS 中,制备 3.6 mL 纤连蛋白工作溶液。
- 将 600 μL 纤连蛋白工作溶液转移到 6 孔板的每个孔中,轻轻摇动直至均匀涂覆。
- 等待30分钟,让纤连蛋白涂覆孔,然后轻轻地从每个孔中吸出溶液。
- 在等待纤连蛋白包被的同时,清洗单核细胞
- 在试管中加入多达 45 mL 的 PBS
- 在560× g 和4°C下用低制动器离心5分钟。从两个管中吸出上清液。
- 将每个细胞沉淀重悬于 25 mL PBS 中。
- 重复第二次洗涤。
- 将每个细胞沉淀重悬于 5 mL PBS 中,并向每个试管中加入 15 mL 0.8% 氯化铵溶液。
注意:此步骤是裂解剩余的红细胞。 - 在冰上孵育10分钟。
- 像以前一样用PBS加满试管并在560× g 和4°C下用低制动器离心5分钟。从两个管中吸出上清液。
- 将每个细胞沉淀重悬于25 mL PBS中,并重复洗涤第二次。
- 将每个细胞沉淀重悬于 6 mL EGM-2 培养基中,该培养基补充有 10% 胎牛血清 (FBS) 和 1x 抗生素/抗真菌溶液,其中含有 10,000 U/mL 青霉素、10 mg/mL 链霉素和 25 μg/mL 两性霉素。
注意:EGM-2培养基由补充有200μL氢化可的松的EBM-2培养基,2mL人成纤维细胞生长因子(hFGF-B),500μL血管内皮生长因子(VEGF),500μL胰岛素样生长因子重组类似物(R3 IGF-1),500μL抗坏血酸,500μL人表皮生长因子(hEGF), 每 500 mL 500 μL 庆大霉素/两性霉素和 500 μL 肝素。 - 轻轻地将 2 mL 的细胞悬液转移到纤连蛋白包被的 6 孔板的每个孔中,轻轻摇动直至均匀包被。
注意:目标是接种尽可能多的细胞,以最大限度地增加将形成的内皮集落的数量。
4. 细胞培养
- 将细胞在37°C,5%CO2和100%湿度下孵育。
- 第二天,向每个孔中轻轻加入 1 mL 新鲜培养基。
注意:重要的是要温和,不要干扰松散粘附在纤连蛋白涂层上的细胞。 - 第二天,通过从每个孔中轻轻吸出 1.5 mL 培养基并用 1.5 mL 新鲜培养基替换来进行半培养基更换。
- 在接下来的5天中的每一天,轻轻地对每个孔进行完整的培养基更换(每孔2 mL新鲜培养基)。
- 之后,每周轻轻更换培养基三次。
- 在低功率(4倍物镜)光学显微镜下定期观察细胞培养物。
注意:贴壁血液生长内皮细胞(BOEC)集落将在接种后7-10天开始出现在孔中。非贴壁细胞类型将随着培养基的变化而被丢弃,其他贴壁细胞类型将随着BOEC菌落的生长而逐渐消散。 - 当~70%-80%汇合时,将BOEC传入纤连蛋白包被的T-75烧瓶中,并继续每周更换培养基三次。
注意:接种密度可以通过将菌落传代到T25烧瓶中来控制。后续传代不需要纤连蛋白包衣,培养基更换次数可减少到每周两次。 - 来自传代1-3的细胞可用于实验或转移到冷冻培养基中并储存在液氮中以备将来使用。
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Representative Results
从培养开始到观察到BOEC菌落,观察培养细胞的形态(图1)。较小的贴壁细胞群开始附着在培养皿上并生长,而非贴壁细胞随着培养基的变化而被移除(图1B)。菌落在第6天首次出现,作为从中心点向外放射状增殖的内皮样细胞的集合(图1D)。随着培养的进行,细胞集落变得更加致密,并显示出类似于成熟内皮细胞的鹅卵石形态(图1F)。典型的内皮鹅卵石形态学提供了使用光学显微镜轻松初步鉴定BOEC的方法。
内皮细胞集落通常在培养 10-14 天时准备好传代。此时,6孔板通常会产生~100万个细胞,活力百分比为93%-98%。在第一次传代期间,内皮细胞将扩增以在T75烧瓶中产生~6-10百万个细胞。
为了评估BOEC的形态发生,将基底膜基质(例如基质胶)以10μL /孔的速度接种在15孔血管生成板上,并在37°C下孵育30分钟以允许聚合。将传代2细胞接种在基底膜基质包被的平板上,并在14小时和24小时时间点成像。每孔约3,500个细胞的密度能够形成网络和管状结构。血清游离培养基(EGM-2与补充剂,FBS除外)在14小时内注意到管形成,完全生长培养基(EGM-2与包括FBS在内的补充剂)在24小时内注意到管形成。添加FBS可能会稀释内皮细胞特异性生长因子(例如VEGF)并引入其他信号因子,导致管形成过程的延迟。2D相差显微镜用于对无血清培养基(图2A,B)和完全生长培养基(图2C,D)中的管形成成像。两种培养基条件下的细胞都经历了形态分化,并迅速组织成广泛的毛细管状结构网络。这些结构由类似于体内毛细血管网络的有组织的细胞索组成。此外,20倍放大的显微照片详细说明了内皮细胞的复杂多细胞组织及其形态分化。在培养基条件之间没有观察到形态差异。广泛的毛细管状结构网络强烈表明培养细胞分化为成熟和功能性内皮细胞。
BOEC进一步表征成熟内皮细胞标志物CD31或血小板内皮细胞粘附分子-1(PECAM1)的表达(图3A,B)。BOEC表现出CD31的均匀表达。此外,流式细胞术分析证实不存在EPC,因为与PBMC的阳性对照组相比,单核细胞标志物CD14染色为阴性(图3C,D)。
图 1:表型光学显微镜图像。 在第一次传代后(A)第0天,(B)第2天,(C)第4天,(D)第6天,(E)第8天和(F)以10倍放大倍率观察到培养的BOEC的光学显微镜图像。比例尺:200 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 2:第 2 代 BOEC 的形态分化和组织。在无血清培养基14 h内和完全生长培养基24 h内观察到第2代BOEC形成毛细管状结构的形态分化和组织。(A)4x的无血清培养基,(B)20x的无血清培养基,(C)4x的完全生长培养基,以及(D)20x的完全生长培养基。比例尺:200 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 3:使用 CD31 和 CD14 表征 BOEC。 (A) 使用绿色和 (B) 相应的相差显微镜图像中的抗 CD31-FITC 抗体对第 2-3 代 BOEC 进行 PECAM1 染色。将细胞染色为悬浮液,并将悬浮液在显微镜载玻片上成像。比例尺:200 μm。 (C)具有CD14-AF700抗体的BOEC与(D)阳性对照外周血单核细胞(PBMC)的流式细胞术分析。CD14 染色阳性显示为蓝色,未染色细胞显示为红色。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
BOEC是一种强大的工具,可用于各种科学和治疗方法7,8,16。BOEC已被用于分析EC基因表达,以阐明导致血管疾病和癌症发展的关键因素5,19,20,21。BOEC还被用于治疗应用,如血管再生和基因传递22,23,24。转基因BOEC以其抗血管生成肿瘤的治疗能力而闻名25,26。此外,BOEC的血管生成潜力使其成为旨在血管化和新生血管化的细胞疗法的优秀候选者17,27。尽管有几项研究描述了如何从人外周血中获得BOECs6,7,8,9,但由于潜在的病理生理和遗传变异而导致的人类细胞来源的变异性表明迫切需要从健康的异种来源获得BOECs9,13,18。
已经提出了从猪外周血单核细胞中有效获取BOEC的详细方案。关键步骤包括尽快处理血液样本,并在密度梯度离心后有效收获血沉棕黄层,以最大限度地提高进入培养物的活PBMC的数量。细胞的初始接种密度和及时传代是获得这些细胞类型一致分离的重要考虑因素。起始血容量为 100 mL 可为单个六孔板提供适当数量的 PBMC。应该注意的是,可以从猪身上安全收集的最大血液量会随着动物体重而变化。建议猪安全的一次性最大血容量采集为每公斤体重 8 mL。此外,及时将初始菌落从第0代传代到第1代也很重要。如果接种密度非常低或细胞达到汇合,细胞就会停止增殖。随着细胞汇合,它们开始转变为细长的间充质形态和表型。接种密度也可以通过将菌落传入T25烧瓶而不是T75烧瓶来控制。需要仔细考虑在初始培养基更换期间不要丢失贴壁细胞类型,因为在丢弃非贴壁EPC的同时捕获尽可能多的贴壁细胞非常重要。该协议在大约 1 周内产生生长细胞集落。
该协议具有高度可重复性和可靠性。估计90%-95%的培养物实现了内皮细胞集落的扩大。失败通常是由于缺乏内皮细胞集落的形成,这意味着如果至少形成一个内皮细胞集落,它们几乎总是会在培养中扩增。失败的来源包括随机变异性、采血过程中细胞过度剪切、培养物中的微生物污染以及处理步骤中单核细胞的高损失。在培养不成功后,第二次培养通常会成功,这表明动物之间的差异不是主要因素。该方案甚至在安乐死后立即采集血液时也很成功,这表明洗涤步骤有效地将安乐死剂降低到无害水平。
无论循环血细胞群的异质性如何,都获得了与EPC非常不同的BOEC。BOEC来源于一小部分缺乏CD14表达的贴壁性PBMC。没有CD14染色证实了这一点(图3C,D)。早期传代中BOEC培养物中单核细胞EPC的清除可以通过细胞死亡或非依从性来解释。BOEC的鹅卵石形态(图1E,F)表明具有明显的内皮表型。此外,表面标志物CD31的均匀表达(图3A)意味着成熟内皮细胞的均匀群。此外,BOEC在无血清(图2A,B)和完全生长培养基(图2C,D)中的毛细血管形态发生显示出其固有的血管生成能力6,8。先前对使用该协议产生的猪BOEC的分析表明,这些细胞对血管性血友病因子表达和凝集素结合28也呈阳性。
循环血液中大量的PBMCs,从中产生BOECs,支持了一种稳健的方法的可行性,可以从动物来源获得几乎无限的治疗性BOEC供应。一旦掌握了该技术,BOEC可用于多种应用,包括血管修复和再生,疾病建模,药物筛选和内皮细胞生物学研究。需要正在进行的研究来证实猪BOEC的同质性及其作为人类治疗来源的相容性。
该方案的一个局限性是扩大内皮细胞集落无法产生的风险。失败率估计为 5%-10%,在这些情况下,需要第二次尝试。当保证成功很重要时,可以收集两倍的血液量,并且可以并行遵循该方案以产生两种独立的培养物。此外,我们的经验仅限于健康的约克郡/地方品种/杜洛克杂交家猪(Sus homeus),雄性和雌性,40-80公斤,3-6个月大。其他品种、年龄和实验条件的成功率未知。
该协议的另一个限制是不存在BOEC表型的明确标记。在这里和以前的工作28中,从该协议生成的猪BOEC已经针对几种BOEC标志物进行了表征,但是对BOEC表型的理解仍在不断发展。BOEC在2-3通道也有特征,更高通道的表型是未知的。与人类相比,猪BOEC的一个优势是猪血的现成供应,这允许产生更频繁的培养物和稳定的低传代细胞供应。
在治疗方法中使用猪细胞的主要限制之一是宿主免疫反应29。正在研究几种免疫调节策略,以减轻用于人类移植的异种细胞的免疫原性,例如抗炎剂和CRISPR / Cas基因操作30,31,32。最近的研究提出了人互补调节蛋白(hCRPs)的表达33和引入α1,3-半乳糖基转移酶缺失(GTKO)32,34猪。这些进展为异种细胞(包括猪BOEC)的治疗应用带来了希望。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者希望感谢NIH / NHLBI R00 HL129068的资助。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
19 G needle | Covidien | 1188818112 | |
50 mL conical tubes | Corning | 352098 | |
6 well plate | BD Falcon | 353046 | |
60 mL syringes | Covidien | 8881560125 | |
Ammonium chloride solution (0.8%) | Stemcell Technologies | 07850 | |
Antibiotic/antimycotic solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
Centrifuge | Thermo Scientific | 75-253-839 | |
EGM-2 culture medium | Lonza Walkersville | CC-3162 | |
Extension tube | Hanna Pharmaceutical Supply Co. | 03382C6227 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
Ficoll-Paque 1077 | Cytiva | 17144003 | Density gradient solution |
Heparin sodium injection (1,000 units/mL) | Pfizer | 00069-0058-01 | |
Human plasma fibronectin | Gibco | 33016-015 | |
Ice | N/A | N/A | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
Pipette set | Eppendorf | 2231300004 | |
Sterile water | Gibco | 15230-162 | |
Thin pipette | Celltreat Scientific | 229280 |
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