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Biology

토양 샘플에서 엔토모병원성 곰팡이를 분리하는 방법의 비교

Published: January 06, 2022
doi:
10.3791/63353
, , , , ,
1Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Instituto de Veterinária,Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, 2Laboratório de Taxonomia Bioquímica e Bioprospecção de Fungos/Coleção de Cultura de Fungos Filamentosos, Instituto Oswaldo Cruz,Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), 3Departamento de Parasitologia Animal, Instituto de Veterinária,Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro

Summary

엔토모병원성 진균 콜로니는 테네브리오 미끼, 갤러리아 미끼 및 선택적 인공 배지, 즉 클로람페니콜, 티아벤다졸 및 시클로헥시미드(CTC 배지)로 보충된 효모 추출물이 풍부한 감자 덱스트로스 한천을 사용하여 열대 토양 샘플로부터 분리된다.

Abstract

본 연구의 목표는 토양 샘플로부터 엔토모병원성 진균(EPF)을 분리하기 위한 곤충 미끼 대 인공 선택적 배지 사용의 효과를 비교하는 것이다. 토양은 절지 동물 해충을 조절할 수있는 Metarhizium 및 Beauveria 속에 특히 속하는 EPF를 포함한 미생물의 풍부한 서식지입니다. 곰팡이를 기본으로하는 생물학적 제품은 주로 농업 절지 동물 해충 방제를 위해 시장에서 구입할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 높은 고유 생물 다양성에도 불구하고, 단지 몇 가지 균주만이 전 세계적으로 상업적 바이오 제품에 사용된다. 본 연구에서, 524개의 토양 샘플을 클로람페니콜, 티아벤다졸 및 시클로헥시미드(CTC 배지)로 보충된 효모 추출물이 풍부한 감자 덱스트로스 한천에서 배양하였다. 진균 콜로니의 성장은 3주 동안 관찰되었다. 모든 Metarhizium 및 Beauveria EPF는 속 수준에서 형태학적으로 확인되었습니다. 추가적으로, 일부 단리물은 종 수준에서 분자적으로 확인되었다. 이 524 개의 토양 샘플 중 스물 네 개는 곤충 미끼 방법 (갤러리아 멜로 넬라 및 테네브리오 몰리터)을 사용하여 EPF 발생에 대해 조사되었습니다. 총 51개의 EPF 균주(41개의 메타리지움 spp. 및 10개의 보베리아 spp.)를 524개의 토양 샘플로부터 분리하였다. 모든 곰팡이 균주는 농경지 또는 초원에서 분리되었습니다. 비교를 위해 선택된 24개의 샘플 중 91.7%는 갤러리아 미끼를 사용한 EPF에 대해 양성이었고, 62.5%는 테네브리오 미끼를 사용했으며, 41.7%는 CTC를 사용하여 양성이었다. 우리의 결과는 곤충 미끼를 사용하여 토양에서 EPF를 분리하는 것이 CTC 배지를 사용하는 것보다 더 효율적이라는 것을 시사했습니다. EPF의 식별 및 보존 외에도 분리 방법의 비교는 생물 다양성에 대한 지식에 긍정적 인 영향을 미칩니다. EPF 컬렉션의 개선은 과학 발전과 기술 혁신을 지원합니다.

Introduction

토양은 엔토모병원성 진균(EPF)을 포함한 여러 미생물의 공급원입니다. 이 특정 곰팡이 그룹은 절지 동물 숙주, 특히 곤충을 식민지화하고 종종 죽일 수있는 능력에 의해 인식됩니다1. 분리, 특성화, 독성 균주의 선택 및 등록 후, EPF는 절지 동물 해충 방제를 위해 대량 생산되며, 이는 경제적 관련성2을 지원합니다. 따라서, EPF의 분리는 생물농약의 개발을 위한 첫 번째 단계로 간주된다. Beauveria spp. (Hypocreales : Cordycipitaceae)와 Metarhizium spp. (Hypocreales : Clavicipitaceae)는 절지 동물 해충 방제에 사용되는 가장 일반적인 곰팡이입니다3. EPF는 토양, 눈에 보이는 진균증을 가진 절지 동물, 식민지화 된 식물 및 식물 근권 4,5에서 성공적으로 분리되었습니다.

EPF의 분리는 또한이 특정 그룹의 다양성, 분포 및 생태학을 연구하는 데 유용 할 수 있습니다. 최근 문헌들은 EPF의 사용이 과소평가되고 있으며, 식물 생장을 개선하고4, 토양으로부터 독성 오염물질을 제거하고, 약6에서 사용될 수 있는 능력과 같은 EPF의 몇몇 비전통적 응용을 인용하고 있다. 본 연구는 곤충 미끼를 사용하여 토양에서 EPF를 분리하는 효율과 인공 배양 배지 7,8,9를 비교하는 것을 목표로합니다. EPF 격리의 맥락에서 곤충 미끼로 갤러리아 멜로 넬라 L. (Lepidoptera : Phyralidae)의 사용은 잘 받아 들여졌습니다. 이 유충은 전 세계적으로 과학계에서 숙주 – 병원체 상호 작용10,11을 연구하기위한 실험 모델로 사용됩니다. Tenebrio molitor L. (Coleoptera : Tenebrionidae) 유충은 독성과 관련된 연구 및 EPF의 격리를위한 또 다른 곤충 모델로 간주됩니다.이 곤충은 저렴한 비용으로 실험실에서 희귀하기 쉽기 때문에 7,12.

다양한 PCR 기술을 사용하는 것과 같은 배양-독립적인 방법은 토양13,14를 포함하는 그들의 기질 상의 EPF를 검출하고 정량화하는데 적용될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 이들 진균 콜로니를 적절하게 단리하기 위해, 이들의 기질은 선택적인 인공 배지(9) 상에서 배양되어야 하거나, 샘플에 존재하는 진균은 민감한 곤충(15)을 사용하여 미끼화될 수 있다. 한편, CTC는 클로람페니콜, 티아벤다졸 및 시클로헥시미드로 보충된 효모 추출물이 풍부한 감자 덱스트로스 한천으로 구성된 도딘이 없는 인공 배지입니다. 이 배지는 Fernandes et al.에 의해 개발되었다. 9 토양에서 자연적으로 발생하는 Beauveria spp. 및 Metarhizium spp.의 회수를 극대화합니다. 한편, G. mellonella 및 T. molitor 유충은 또한 토양으로부터 EPF 분리 물을 얻기 위한 미끼로서 성공적으로 사용될 수 있다. 그럼에도 불구하고 Sharma et al.15에 따르면,이 두 미끼 곤충의 병용 사용과 비교를보고하는 연구는 거의 없습니다. 포르투갈 포도원 토양은 Metarhizium robertsii (Metscn)의 상당한 회복을 나타냈다. T를 사용하는 소로킨. G. 멜로넬라 유충과 비교하여 몰리터 유충; 대조적으로, Beauveria bassiana (Bals. -Criv.) Vuill 격리는 G. mellonella 미끼15의 사용과 관련이 있습니다. 따라서, 어떤 EPF 분리 방법(즉, G. mellonella-bait, T. molitor-bait 또는 CTC 배지)을 사용할지에 대한 결정은 연구의 목표 및 실험실 인프라에 따라 고려되어야 한다. 본 연구의 목표는 토양 샘플로부터 EPF를 분리하기 위한 곤충 미끼 대 인공 선택 배지 사용의 효과를 비교하는 것이다.

Protocol

본 연구가 브라질 유전 유산에 접근함에 따라이 연구는 AA47CB6 코드로 유전 유산 및 관련 전통 지식 관리 (Sisgen)를위한 국가 시스템에 등록되었습니다. 1. 토양 샘플링 작은 삽을 사용하여 800g의 토양 (입사 보조 식물 뿌리 유무에 관계없이)을 10cm 깊이로 수집하십시오. 실험이 시작될 때까지 실온에서 폴리프로필렌 백에 보관하십시오.참고 : EPF가 근권 능?…

Representative Results

브라질 리우데자네이루 주에서 2015년부터 2018년까지 가축 목초지(165개 샘플), 토착 열대 우림(90개 샘플), 호숫가(42개 샘플), 경작/농경지(227개 샘플)와 같은 총 524개의 토양 샘플이 초원에서 수집되었습니다. EPF에 대해 양성인 샘플의 지리적 좌표에 대한 세부사항은 보충 표 1에 제시되어 있다. 524개의 토양 샘플 중 500개의 샘플은 CTC 배지를 통해서만 분석되었으며,…

Discussion

자연 및 농업 토양 서식지는 EPF22 및 우수한 자연 저수지의 전형적인 환경입니다. 본 연구에서, 곤충 미끼 대 선택적 배지를 사용하는 EPF 분리의 두 가지 방법이 다루어졌다. 격리를위한 첫 번째 단계는 토양 샘플의 수집입니다. 토양 샘플의 적절한 저장 및 확인이 중요합니다. 위도, 경도, 토양 유형 및 생물 군계에 대한 정보는 역학, 모델링 및 지리 공간 과목23,24</su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 브라질의 Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Financial code 001, Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (프로젝트 번호 E-26/010.001993/2015) 및 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) 브라질에서 자금을 조달했습니다.

Materials

Autoclave Phoenix Luferco 9451
Biosafety cabinet Airstream ESCO AC2-4E3
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
Climate chambers Eletrolab EL212/3
Coverslip RBR 3871
Cycloheximide Sigma-Aldrich C7698
Drigalski spatula Marienfeld 1800024
GPS app Geolocation app 2.1.2005
Lactophenol blue solution Sigma-Aldrich 61335
Microscope Zeiss Axio star plus 1169 149
Microscope camera Zeiss Axiocam 105 color 426555-0000-000
Microscope softwere Zen lite Zeiss 3.0
Microscope slide Olen k5-7105-1
Microtube BRAND Z336769-1PAK
Petri plates Kasvi K30-6015
Pipette tip Vatten VT-230-200C/VT-230-1000C
Pippette HTL – Labmatepro LMP 200 / LMP 1000
Plastic pots Prafesta descartáveis 8314
Polypropylene bags Extrusa 38034273/5561
Potato dextrose agar Kasvi K25-1022
Prism software 9.1.2 Graph Pad
Shovel Tramontina 77907009
Tenebrio mollitor Safari QP98DLZ36
Thiabendazole Sigma-Aldrich T8904
Tween 80 Vetec 60REAVET003662
Vortex Biomixer QL-901
Yeast extract Kasvi K25-1702
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References

  1. Roberts, D. W., St. Leger, R. J. Metarhizium spp., cosmopolitan insect-pathogenic fungi: Mycological aspects. Advances in Applied Microbiology. 54, 1-70 (2004).
  2. do Nascimento Silva, J., et al. New cost-effective bioconversion process of palm kernel cake into bioinsecticides based on Beauveria bassiana and Isaria javanica. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (6), 2595-2606 (2018).
  3. Faria, M. R., Wraight, S. P. Mycoinsecticides and Mycoacaricides: A comprehensive list with worldwide coverage and international classification of formulation types. Biological Control. 43 (3), 237-256 (2007).
  4. Vega, F. V. The use of fungal entomopathogens as endophytes in biological control: a review. Applied Mycology. 110 (1), 4-30 (2018).
  5. Sharma, L., et al. Advances in entomopathogen isolation: A case of bacteria and fungi. Microorganisms. 9 (1), 1-28 (2021).
  6. Litwin, A., Nowak, M., Różalska, S. Entomopathogenic fungi: unconventional applications. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 19, 23-42 (2020).
  7. Kim, J. C., et al. Tenebrio molitor-mediated entomopathogenic fungal library construction for pest management. Journal of Asia-Pacific Entomology. 21 (1), 196-204 (2018).
  8. Meyling, N., Eilenberg, J. Ocurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, Ecosystems and Environment. 113 (1), 336-341 (2006).
  9. Fernandes, E. K. K., Keyser, C. A., Rangel, D. E. N., Foster, R. N., Roberts, D. W. CTC medium: A novel dodine-free selective medium for isolating entomopathogenic fungi, especially Metarhizium acridum, from soil. Biological Control. 54 (3), 197-205 (2010).
  10. Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Molecular genetics of Beuveria bassiana infection of insects. Advantages in Genetics. 94, 165-249 (2016).
  11. Pereira, M. F., Rossi, C. C., Silva, G. C., Rosa, J. N., Bazzolli, M. S. Galleria mellonella as infection model: an in depth look at why it works and practical considerations for successful application. Pathogens and Disease. 78 (8), (2020).
  12. Souza, P. C., et al. Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae) as an alternative host to study fungal infections. Journal of Microbiological Methods. 118, 182-186 (2015).
  13. Canfora, L., et al. Development of a method for detection and quantification of B. brongniartii and B. bassiana in soil. Scientific Reports. 6, 22933 (2016).
  14. Garrido-Jurado, I., et al. Transient endophytic colonization of melon plants by entomopathogenic fungi after foliar application for the control of Bemisia tabaci Gennadius (Hemiptera: Aleyrodidae). Journal of Pest Science. 90, 319-330 (2016).
  15. Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: suggesting a ‘Galleria-Tenebrio-bait method’ as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana). MycoKeys. 38, 1-23 (2018).
  16. Riddell, R. W. Permanent stained mycological preparations obtained by slide culture. Mycologia. 42 (2), 265-270 (1950).
  17. Bischoff, J., Rehner, S. A., Humber, R. A. A multilocus phylogeny of the Metarhizium anisopliae lineage. Mycologia. 101 (4), 512-530 (2009).
  18. Rehner, S. A., et al. Phylogeny and systematics of the anamorphic, entomopathogenic genus Beauveria. Mycologia. 103 (5), 1055-1073 (2011).
  19. Seifert, K. A., Gams, W., Seifert, K. A., Morgan-Jones, G., Gams, W., Kendrick, B. Anamorphs of Clavicipitaceae, Cordycipitaceae and Ophiocordycipitaceae. The Genera of Hyphomycetes. CBS Biodiversity Series. CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre. 9, 903-906 (2011).
  20. Humber, R. A., Lacey, L. A. Identification of entomopathogenic fungi. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology., 2nd ed. , 151-187 (2012).
  21. Mesquita, E., et al. Efficacy of a native isolate of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae against larval tick outbreaks under semifield conditions. BioControl. 65 (3), 353-362 (2020).
  22. St Leger, R. J. Studies on adaptations of Metarhizium anisopliae to life in the soil. Journal of Invertebrate Pathology. 98 (3), 271-276 (2008).
  23. Mar, T. T., Suwannarach, N., Lumyong, S. Isolation of entomopathogenic fungi from Nortern Thailand and their production in cereal grains. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28 (12), 3281-3291 (2012).
  24. Rocha, L. F. N., Inglis, P. W., Humber, R. A., Kipnis, A., Luz, C. Occurrence of Metarhizium spp. in central Brazilian soils. Journal of Basic Microbiology. 53 (3), 251-259 (2013).
  25. Quesada-Moraga, E., Navas-Cortés, J. A., Maranhao, E. A. A., Ortiz-Urquiza, A., Santiago-Álvarez, C. Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils. Mycological Research. 111 (8), 947-966 (2007).
  26. Mora, M. A. E., Rouws, J. R. C., Fraga, M. E. Occurrence of entomopathogenic fungi in atlantic forest soils. Microbiology Discovery. 4 (1), 1-7 (2016).
  27. Goble, T. A., Dames, J. F., Hill, M. P., Moore, S. D.The effects of farming system, habitat type and bait type on the isolation of entomopathogenic fungi from citrus soils in the Eastern Cape Province, South Africa. BioControl. 55 (3), 399-412 (2010).
  28. Medo, J., Cagáň, L. Factors affecting the occurrence of entomopathogenic fungi in soils of Slovakia as revealed using two methods. Biological Control. 59 (2), 200-208 (2011).
  29. Chase, A. R., Osborne, L. S., Ferguson, V. M. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. 69, 285-292 (1986).
  30. Liu, Z. Y., Milner, R. J., McRae, C. F., Lutton, G. G. The use of dodine in selective media for the isolation of Metarhizium spp. from soil. Journal of Invertebrate Pathology. 62, 248-251 (1993).
  31. Rangel, D. E. N., Dettenmaier, S. J., Fernandes, E. K. K., Roberts, D. W. Susceptibility of Metarhizium spp. and other entomopathogenic fungi to dodine-based selective media. Biocontrol Science and Technology. 20 (4), 375-389 (2010).
  32. Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae. BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).
  33. Enkerli, J., Widmer, F., Keller, S. Long-term field persistence of Beauveria brongniartii strains applied as biocontrol agents against European cockchafer larvae in Switzerland. Biological Control. 29 (1), 115-123 (2004).
  34. Imoulan, A., Alaoui, A., El Meziane, A. Natural occurrence of soil-borne entomopathogenic fungi in the Moroccan endemic forest of Argania spinosa and their pathogenicity to Ceratitis capitata. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (11), 2619-2628 (2011).
  35. Keyser, C. A., De Fine Licht, H. H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark. BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).

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Keywords: Entomopathogenic FungiSoil SamplesIsolation MethodsChloramphenicolThiabendazoleCycloheximideCTC MediumGalleria MellonellaTenebrio MolitorInsect BaitsBiopesticideDiversityDistributionEcologyRhizosphere CompetenceSoil CollectionIncubationFungal Colony Growth
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Correa, T. A., Santos, F. S., Camargo, M. G., Quinelato, S., Bittencourt, V. R. E. P., Golo, P. S. Comparison of Methods for Isolating Entomopathogenic Fungi from Soil Samples. J. Vis. Exp. (179), e63353, doi:10.3791/63353 (2022).
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