Vergelijking van methoden voor het isoleren van entomopathogene schimmels uit bodemmonsters
Summary
Entomopathogene schimmelkolonies worden geïsoleerd uit tropische bodemmonsters met tenebrio-aas , Galleria-aas en selectief kunstmatig medium, d.w.z. aardappeldextrose-agar verrijkt met gistextract aangevuld met chlooramfenicol, thiabendazool en cycloheximide (CTC-medium).
Abstract
Het doel van deze studie is om de effectiviteit van het gebruik van insectenaas te vergelijken met kunstmatig selectief medium voor het isoleren van entomopathogene schimmels (EPF) uit bodemmonsters. De bodem is een rijke habitat voor micro-organismen, waaronder EPF, met name behorend tot de geslachten Metarhizium en Beauveria, die geleedpotige plagen kunnen reguleren. Biologische producten op basis van schimmels zijn voornamelijk beschikbaar op de markt voor de bestrijding van geleedpotigen in de landbouw. Ondanks de hoge endemische biodiversiteit worden wereldwijd slechts enkele stammen gebruikt in commerciële bioproducten. In de huidige studie werden 524 bodemmonsters gekweekt op aardappel dextrose agar verrijkt met gistextract aangevuld met chlooramfenicol, thiabendazool en cycloheximide (CTC-medium). De groei van schimmelkolonies werd gedurende 3 weken waargenomen. Alle Metarhizium en Beauveria EPF werden morfologisch geïdentificeerd op geslachtsniveau. Bovendien werden sommige isolaten moleculair geïdentificeerd op soortniveau. Vierentwintig van deze 524 bodemmonsters werden ook onderzocht op EPF-voorkomen met behulp van de insectenaasmethode (Galleria mellonella en Tenebrio molitor). In totaal werden 51 EPF-stammen geïsoleerd (41 Metarhizium spp. en 10 Beauveria spp.) uit de 524 bodemmonsters. Alle schimmelstammen werden geïsoleerd uit akkerland of graslanden. Van de 24 monsters die ter vergelijking werden geselecteerd, was 91,7% positief voor EPF met Galleria-aas , 62,5% met Tenebrio-aas en 41,7% met CTC. Onze resultaten suggereerden dat het gebruik van insectenaas om de EPF uit de grond te isoleren efficiënter is dan het gebruik van het CTC-medium. De vergelijking van isolatiemethoden naast de identificatie en conservering van EPF heeft een positieve invloed op de kennis over biodiversiteit. De verbetering van de EPF-collectie ondersteunt wetenschappelijke ontwikkeling en technologische innovatie.
Introduction
De bodem is de bron van verschillende micro-organismen, waaronder entomopathogene schimmels (EPF). Deze specifieke groep schimmels wordt herkend aan hun vermogen om geleedpotige gastheren, vooral insecten, te koloniseren en vaak te doden1. Na isolatie, karakterisering, selectie van virulente stammen en registratie worden EPF massaal geproduceerd voor geleedpotige plaagbestrijding, wat hun economische relevantie ondersteunt2. Dienovereenkomstig wordt de isolatie van EPF beschouwd als de eerste stap naar de ontwikkeling van een biopesticide. Beauveria spp. (Hypocreales: Cordycipitaceae) en Metarhizium spp. (Hypocreales: Clavicipitaceae) zijn de meest voorkomende schimmels die worden gebruikt voor geleedpotige plaagbestrijding3. EPF is met succes geïsoleerd uit de bodem, geleedpotigen met zichtbare mycose, gekoloniseerde planten en planten rhizosfeer 4,5.
Isolatie van EPF kan ook nuttig zijn om de diversiteit, verspreiding en ecologie van deze specifieke groep te bestuderen. Recente literatuur meldde dat het gebruik van EPF wordt onderschat, onder verwijzing naar verschillende onconventionele toepassingen van EPF, zoals hun vermogen om de plantengroei te verbeteren4, om giftige verontreinigingen uit de bodem te verwijderen en om te worden gebruikt in de geneeskunde6. Deze studie heeft tot doel de efficiëntie van het isoleren van EPF uit de bodem met behulp van insectenaas te vergelijken met kunstmatig kweekmedium 7,8,9. Het gebruik van Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Phyralidae) als insectenaas in de context van EPF-isolatie is goed geaccepteerd. Deze larven worden wereldwijd door de wetenschappelijke gemeenschap gebruikt als een experimenteel model om gastheer-pathogeen interactieste bestuderen 10,11. Tenebrio molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae) larve wordt beschouwd als een ander insectenmodel voor studies met virulentie en voor isolatie van EPF, omdat dit insect gemakkelijk te zeldzaam is in het laboratorium tegen lage kosten 7,12.
Cultuuronafhankelijke methoden zoals het gebruik van verschillende PCR-technieken kunnen worden toegepast om EPF op hun substraten, waaronder bodem13,14, te detecteren en te kwantificeren. Niettemin, om deze schimmelkolonies goed te isoleren, moet hun substraat worden gekweekt op een selectief kunstmatig medium9, of de schimmels die in de monsters aanwezig zijn, kunnen worden gelokt met behulp van gevoelige insecten15. Aan de ene kant is CTC een dodinevrij kunstmatig medium dat bestaat uit aardappel dextrose agar verrijkt met gistextract aangevuld met chlooramfenicol, thiabendazool en cycloheximide. Dit medium is ontwikkeld door Fernandes et al. 9 om het herstel van natuurlijk voorkomende Beauveria spp. en Metarhizium spp. uit de bodem te maximaliseren. Aan de andere kant kunnen G. mellonella en T. molitorlarven ook met succes worden gebruikt als aas om EPF-isolaten uit de bodem te verkrijgen. Niettemin, volgens Sharma et al.15, rapporteerden minder studies het gelijktijdige gebruik en de vergelijking van deze twee aasinsecten. Portugese wijngaarden bodems vertoonden aanzienlijke herstel van Metarhizium robertsii (Metscn.) Sorokin met behulp van T. molitorlarven in vergelijking met G. mellonella-larven; daarentegen Beauveria bassiana (Bals. -Criv.) Vuill isolatie werd in verband gebracht met het gebruik van G. mellonella aas15. Daarom moet de beslissing welke EPF-isolatiemethode moet worden gebruikt (d.w.z. G. mellonella-bait, T. molitor-bait of CTC-medium) worden overwogen op basis van het doel van de studie en de laboratoriuminfrastructuur. Het doel van deze studie is om de effectiviteit van het gebruik van insectenaas te vergelijken met kunstmatig selectief medium voor het isoleren van EPF uit bodemmonsters.
Protocol
Representative Results
Discussion
Natuurlijke en agrarische bodemhabitats zijn typische omgevingen voor EPF22 en een uitstekend natuurlijk reservoir. In de huidige studie werden twee methoden van EPF-isolatie met behulp van insectenaas versus selectief medium behandeld. De eerste stap voor isolatie is het verzamelen van de bodemmonsters. Een goede opslag en identificatie van bodemmonsters zijn cruciaal. Informatie over de breedtegraad, lengtegraad, bodemtype en bioom is essentieel voor studies met epidemiologische, modellerings- e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd gedeeltelijk gefinancierd door de Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) uit Brazilië, financieringscode 001, Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (projectnummer E-26/010.001993/2015), en Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) uit Brazilië.
Materials
| Autoclave | Phoenix Luferco | 9451 | |
| Biosafety cabinet | Airstream ESCO | AC2-4E3 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Climate chambers | Eletrolab | EL212/3 | |
| Coverslip | RBR | 3871 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Drigalski spatula | Marienfeld | 1800024 | |
| GPS app | Geolocation app | 2.1.2005 | |
| Lactophenol blue solution | Sigma-Aldrich | 61335 | |
| Microscope | Zeiss Axio star plus | 1169 149 | |
| Microscope camera | Zeiss Axiocam 105 color | 426555-0000-000 | |
| Microscope softwere | Zen lite Zeiss 3.0 | ||
| Microscope slide | Olen | k5-7105-1 | |
| Microtube | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Petri plates | Kasvi | K30-6015 | |
| Pipette tip | Vatten | VT-230-200C/VT-230-1000C | |
| Pippette | HTL – Labmatepro | LMP 200 / LMP 1000 | |
| Plastic pots | Prafesta descartáveis | 8314 | |
| Polypropylene bags | Extrusa | 38034273/5561 | |
| Potato dextrose agar | Kasvi | K25-1022 | |
| Prism software 9.1.2 | Graph Pad | ||
| Shovel | Tramontina | 77907009 | |
| Tenebrio mollitor | Safari | QP98DLZ36 | |
| Thiabendazole | Sigma-Aldrich | T8904 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 | |
| Vortex | Biomixer | QL-901 | |
| Yeast extract | Kasvi | K25-1702 |
References
- Roberts, D. W., St. Leger, R. J. Metarhizium spp., cosmopolitan insect-pathogenic fungi: Mycological aspects. Advances in Applied Microbiology. 54, 1-70 (2004).
- do Nascimento Silva, J., et al. New cost-effective bioconversion process of palm kernel cake into bioinsecticides based on Beauveria bassiana and Isaria javanica. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (6), 2595-2606 (2018).
- Faria, M. R., Wraight, S. P. Mycoinsecticides and Mycoacaricides: A comprehensive list with worldwide coverage and international classification of formulation types. Biological Control. 43 (3), 237-256 (2007).
- Vega, F. V. The use of fungal entomopathogens as endophytes in biological control: a review. Applied Mycology. 110 (1), 4-30 (2018).
- Sharma, L., et al. Advances in entomopathogen isolation: A case of bacteria and fungi. Microorganisms. 9 (1), 1-28 (2021).
- Litwin, A., Nowak, M., Różalska, S. Entomopathogenic fungi: unconventional applications. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 19, 23-42 (2020).
- Kim, J. C., et al. Tenebrio molitor-mediated entomopathogenic fungal library construction for pest management. Journal of Asia-Pacific Entomology. 21 (1), 196-204 (2018).
- Meyling, N., Eilenberg, J. Ocurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, Ecosystems and Environment. 113 (1), 336-341 (2006).
- Fernandes, E. K. K., Keyser, C. A., Rangel, D. E. N., Foster, R. N., Roberts, D. W. CTC medium: A novel dodine-free selective medium for isolating entomopathogenic fungi, especially Metarhizium acridum, from soil. Biological Control. 54 (3), 197-205 (2010).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Molecular genetics of Beuveria bassiana infection of insects. Advantages in Genetics. 94, 165-249 (2016).
- Pereira, M. F., Rossi, C. C., Silva, G. C., Rosa, J. N., Bazzolli, M. S. Galleria mellonella as infection model: an in depth look at why it works and practical considerations for successful application. Pathogens and Disease. 78 (8), (2020).
- Souza, P. C., et al. Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae) as an alternative host to study fungal infections. Journal of Microbiological Methods. 118, 182-186 (2015).
- Canfora, L., et al. Development of a method for detection and quantification of B. brongniartii and B. bassiana in soil. Scientific Reports. 6, 22933 (2016).
- Garrido-Jurado, I., et al. Transient endophytic colonization of melon plants by entomopathogenic fungi after foliar application for the control of Bemisia tabaci Gennadius (Hemiptera: Aleyrodidae). Journal of Pest Science. 90, 319-330 (2016).
- Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: suggesting a ‘Galleria-Tenebrio-bait method’ as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana). MycoKeys. 38, 1-23 (2018).
- Riddell, R. W. Permanent stained mycological preparations obtained by slide culture. Mycologia. 42 (2), 265-270 (1950).
- Bischoff, J., Rehner, S. A., Humber, R. A. A multilocus phylogeny of the Metarhizium anisopliae lineage. Mycologia. 101 (4), 512-530 (2009).
- Rehner, S. A., et al. Phylogeny and systematics of the anamorphic, entomopathogenic genus Beauveria. Mycologia. 103 (5), 1055-1073 (2011).
- Seifert, K. A., Gams, W., Seifert, K. A., Morgan-Jones, G., Gams, W., Kendrick, B. Anamorphs of Clavicipitaceae, Cordycipitaceae and Ophiocordycipitaceae. The Genera of Hyphomycetes. CBS Biodiversity Series. CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre. 9, 903-906 (2011).
- Humber, R. A., Lacey, L. A. Identification of entomopathogenic fungi. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology., 2nd ed. , 151-187 (2012).
- Mesquita, E., et al. Efficacy of a native isolate of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae against larval tick outbreaks under semifield conditions. BioControl. 65 (3), 353-362 (2020).
- St Leger, R. J. Studies on adaptations of Metarhizium anisopliae to life in the soil. Journal of Invertebrate Pathology. 98 (3), 271-276 (2008).
- Mar, T. T., Suwannarach, N., Lumyong, S. Isolation of entomopathogenic fungi from Nortern Thailand and their production in cereal grains. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28 (12), 3281-3291 (2012).
- Rocha, L. F. N., Inglis, P. W., Humber, R. A., Kipnis, A., Luz, C. Occurrence of Metarhizium spp. in central Brazilian soils. Journal of Basic Microbiology. 53 (3), 251-259 (2013).
- Quesada-Moraga, E., Navas-Cortés, J. A., Maranhao, E. A. A., Ortiz-Urquiza, A., Santiago-Álvarez, C. Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils. Mycological Research. 111 (8), 947-966 (2007).
- Mora, M. A. E., Rouws, J. R. C., Fraga, M. E. Occurrence of entomopathogenic fungi in atlantic forest soils. Microbiology Discovery. 4 (1), 1-7 (2016).
- Goble, T. A., Dames, J. F., Hill, M. P., Moore, S. D.The effects of farming system, habitat type and bait type on the isolation of entomopathogenic fungi from citrus soils in the Eastern Cape Province, South Africa. BioControl. 55 (3), 399-412 (2010).
- Medo, J., Cagáň, L. Factors affecting the occurrence of entomopathogenic fungi in soils of Slovakia as revealed using two methods. Biological Control. 59 (2), 200-208 (2011).
- Chase, A. R., Osborne, L. S., Ferguson, V. M. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. 69, 285-292 (1986).
- Liu, Z. Y., Milner, R. J., McRae, C. F., Lutton, G. G. The use of dodine in selective media for the isolation of Metarhizium spp. from soil. Journal of Invertebrate Pathology. 62, 248-251 (1993).
- Rangel, D. E. N., Dettenmaier, S. J., Fernandes, E. K. K., Roberts, D. W. Susceptibility of Metarhizium spp. and other entomopathogenic fungi to dodine-based selective media. Biocontrol Science and Technology. 20 (4), 375-389 (2010).
- Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae. BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).
- Enkerli, J., Widmer, F., Keller, S. Long-term field persistence of Beauveria brongniartii strains applied as biocontrol agents against European cockchafer larvae in Switzerland. Biological Control. 29 (1), 115-123 (2004).
- Imoulan, A., Alaoui, A., El Meziane, A. Natural occurrence of soil-borne entomopathogenic fungi in the Moroccan endemic forest of Argania spinosa and their pathogenicity to Ceratitis capitata. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (11), 2619-2628 (2011).
- Keyser, C. A., De Fine Licht, H. H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark. BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).
