Confronto dei metodi per isolare i funghi entomopatogeni da campioni di suolo
Summary
Le colonie fungine entomopatogene sono isolate da campioni di terreno tropicale utilizzando l’esca Tenebrio , l’esca Galleria e il mezzo artificiale selettivo, cioè l’agar destrosio di patate arricchito con estratto di lievito integrato con cloramfenicolo, tiabendazolo e cicloeximide (mezzo CTC).
Abstract
L’obiettivo del presente studio è quello di confrontare l’efficacia dell’uso di esche per insetti rispetto al mezzo selettivo artificiale per isolare i funghi entomopatogeni (EPF) dai campioni di suolo. Il suolo è un ricco habitat per microrganismi, tra cui ePF in particolare appartenenti ai generi Metarhizium e Beauveria, che possono regolare i parassiti artropodi. I prodotti biologici a base di funghi sono disponibili sul mercato principalmente per il controllo dei parassiti degli artropodi agricoli. Tuttavia, nonostante l’elevata biodiversità endemica, solo pochi ceppi sono utilizzati nei bioprodotti commerciali in tutto il mondo. Nel presente studio, 524 campioni di terreno sono stati coltivati su agar destrosio di patate arricchito con estratto di lievito integrato con cloramfenicolo, tiabendazolo e cicloeximide (mezzo CTC). La crescita delle colonie fungine è stata osservata per 3 settimane. Tutti i Metarhizium e Beauveria EPF sono stati morfologicamente identificati a livello di genere. Inoltre, alcuni isolati sono stati identificati molecolarmente a livello di specie. Ventiquattro di questi 524 campioni di suolo sono stati anche esaminati per l’insorgenza di EPF utilizzando il metodo dell’esca per insetti (Galleria mellonella e Tenebrio molitor). Un totale di 51 ceppi di EPF sono stati isolati (41 Metarhizium spp. e 10 Beauveria spp.) dai 524 campioni di suolo. Tutti i ceppi fungini sono stati isolati da terreni coltivati o praterie. Dei 24 campioni selezionati per il confronto, il 91,7% era positivo per EPF con Esca Galleria , il 62,5% con esca Tenebrio e il 41,7% con CTC. I nostri risultati hanno suggerito che l’uso di esche per insetti per isolare l’EPF dal suolo è più efficiente rispetto all’uso del mezzo CTC. Il confronto dei metodi di isolamento oltre all’identificazione e alla conservazione dell’EPF ha un impatto positivo sulla conoscenza della biodiversità. Il miglioramento della collezione EPF supporta lo sviluppo scientifico e l’innovazione tecnologica.
Introduction
Il suolo è la fonte di diversi microrganismi, tra cui funghi entomopatogeni (EPF). Questo particolare gruppo di funghi è riconosciuto dalla loro capacità di colonizzare e spesso uccidere gli ospiti degli artropodi, in particolare gli insetti1. Dopo l’isolamento, la caratterizzazione, la selezione dei ceppi virulenti e la registrazione, gli EPF sono prodotti in serie per il controllo dei parassiti degli artropodi, il che supporta la loro rilevanza economica2. Di conseguenza, l’isolamento dell’EPF è considerato il primo passo verso lo sviluppo di un biopesticida. Beauveria spp. (Hypocreales: Cordycipitaceae) e Metarhizium spp. (Hypocreales: Clavicipitaceae) sono i funghi più comuni utilizzati per il controllo dei parassiti degli artropodi3. L’EPF è stato isolato con successo dal suolo, dagli artropodi con micosi visibile, dalle piante colonizzate e dalla rizosfera vegetale 4,5.
L’isolamento dell’EPF può anche essere utile per studiare la diversità, la distribuzione e l’ecologia di questo particolare gruppo. La letteratura recente ha riportato che l’uso di EPF è sottovalutato, citando diverse applicazioni non convenzionali di EPF come la loro capacità di migliorare la crescita delle piante4, di rimuovere contaminanti tossici dal suolo e di essere utilizzati in medicina6. Il presente studio mira a confrontare l’efficienza dell’isolamento dell’EPF dal suolo utilizzando esche per insetti rispetto al terreno di coltura artificiale 7,8,9. L’uso della Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Phyralidae) come esca per insetti nel contesto dell’isolamento dell’EPF è stato ben accettato. Queste larve sono utilizzate in tutto il mondo dalla comunità scientifica come modello sperimentale per studiare le interazioni ospite-patogeno10,11. Tenebrio molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae) larva è considerato un altro modello di insetto per studi che coinvolgono la virulenza e per l’isolamento di EPF poiché questo insetto è facile da raro in laboratorio ad un basso costo 7,12.
Metodi indipendenti dalla coltura come l’utilizzo di una varietà di tecniche di PCR possono essere applicati per rilevare e quantificare l’EPF sui loro substrati, incluso il suolo13,14. Tuttavia, per isolare correttamente queste colonie fungine, il loro substrato deve essere coltivato su un mezzo artificiale selettivo9, oppure i funghi presenti nei campioni possono essere innescati usando insetti sensibili15. Da un lato, CTC è un mezzo artificiale privo di dodine costituito da agar destrosio di patate arricchito con estratto di lievito integrato con cloramfenicolo, tiabendazolo e cicloeximide. Questo mezzo è stato sviluppato da Fernandes et al. 9 per massimizzare il recupero di Beauveria spp. e Metarhizium spp. presenti in natura dal suolo. D’altra parte, le larve di G. mellonella e T. molitor possono anche essere utilizzate con successo come esche per ottenere isolati di EPF dal terreno. Tuttavia, secondo Sharma et al.15, meno studi hanno riportato l’uso concomitante e il confronto di questi due insetti esca. I terreni dei vigneti portoghesi hanno mostrato significativi recuperi di Metarhizium robertsii (Metscn.) Sorokin usando T. larve molitor rispetto alle larve di G. mellonella; al contrario, Beauveria bassiana (Bals. -Criv.) L’isolamento di Vuill è stato collegato all’uso di esche G. mellonella 15. Pertanto, la decisione su quale metodo di isolamento EPF utilizzare (ad esempio, G. mellonella-bait, T. molitor-bait o CTC medium) deve essere presa in considerazione in base all’obiettivo dello studio e all’infrastruttura di laboratorio. L’obiettivo del presente studio è quello di confrontare l’efficacia dell’uso di esche per insetti rispetto al mezzo selettivo artificiale per isolare l’EPF dai campioni di suolo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gli habitat naturali e agricoli del suolo sono ambienti tipici dell’EPF22 e un eccellente serbatoio naturale. Nel presente studio, sono stati affrontati due metodi di isolamento dell’EPF utilizzando esche per insetti rispetto al mezzo selettivo. Il primo passo per l’isolamento è la raccolta dei campioni di terreno. La corretta conservazione e identificazione dei campioni di terreno sono fondamentali. Le informazioni su latitudine, longitudine, tipo di suolo e bioma sono essenziali per gli studi c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato finanziato in parte dal Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) dal Brasile, codice finanziario 001, Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (numero di progetto E-26/010.001993/2015) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) dal Brasile.
Materials
| Autoclave | Phoenix Luferco | 9451 | |
| Biosafety cabinet | Airstream ESCO | AC2-4E3 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Climate chambers | Eletrolab | EL212/3 | |
| Coverslip | RBR | 3871 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Drigalski spatula | Marienfeld | 1800024 | |
| GPS app | Geolocation app | 2.1.2005 | |
| Lactophenol blue solution | Sigma-Aldrich | 61335 | |
| Microscope | Zeiss Axio star plus | 1169 149 | |
| Microscope camera | Zeiss Axiocam 105 color | 426555-0000-000 | |
| Microscope softwere | Zen lite Zeiss 3.0 | ||
| Microscope slide | Olen | k5-7105-1 | |
| Microtube | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Petri plates | Kasvi | K30-6015 | |
| Pipette tip | Vatten | VT-230-200C/VT-230-1000C | |
| Pippette | HTL – Labmatepro | LMP 200 / LMP 1000 | |
| Plastic pots | Prafesta descartáveis | 8314 | |
| Polypropylene bags | Extrusa | 38034273/5561 | |
| Potato dextrose agar | Kasvi | K25-1022 | |
| Prism software 9.1.2 | Graph Pad | ||
| Shovel | Tramontina | 77907009 | |
| Tenebrio mollitor | Safari | QP98DLZ36 | |
| Thiabendazole | Sigma-Aldrich | T8904 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 | |
| Vortex | Biomixer | QL-901 | |
| Yeast extract | Kasvi | K25-1702 |
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