Comparaison des méthodes d’isolement des champignons entomopathogènes à partir d’échantillons de sol
Summary
Les colonies fongiques entomopathogènes sont isolées à partir d’échantillons de sol tropical à l’aide d’appâts Tenebrio , d’appâts Galleria , ainsi que de milieux artificiels sélectifs, c’est-à-dire de gélose de dextrose de pomme de terre enrichie en extrait de levure complété par du chloramphénicol, du thiabendazole et du cycloheximide (milieu CTC).
Abstract
L’objectif de la présente étude est de comparer l’efficacité de l’utilisation d’appâts à insectes par rapport à un milieu sélectif artificiel pour isoler les champignons entomopathogènes (EPF) à partir d’échantillons de sol. Le sol est un habitat riche pour les micro-organismes, y compris l’EPF appartenant en particulier aux genres Metarhizium et Beauveria, qui peuvent réguler les arthropodes nuisibles. Les produits biologiques à base de champignons sont disponibles sur le marché principalement pour la lutte antiparasitaire des arthropodes agricoles. Néanmoins, malgré la grande biodiversité endémique, seules quelques souches sont utilisées dans les bioproduits commerciaux dans le monde entier. Dans la présente étude, 524 échantillons de sol ont été cultivés sur de la gélose de dextrose de pomme de terre enrichie d’extrait de levure complété par du chloramphénicol, du thiabendazole et du cycloheximide (milieu CTC). La croissance des colonies fongiques a été observée pendant 3 semaines. Tous les Metarhizium et Beauveria EPF ont été identifiés morphologiquement au niveau du genre. De plus, certains isolats ont été identifiés moléculairement au niveau de l’espèce. Vingt-quatre de ces 524 échantillons de sol ont également été étudiés pour la présence de FPE à l’aide de la méthode des appâts à insectes (Galleria mellonella et Tenebrio molitor). Au total, 51 souches d’EPF ont été isolées (41 Metarhizium spp. et 10 Beauveria spp.) à partir des 524 échantillons de sol. Toutes les souches fongiques ont été isolées dans des terres cultivées ou des prairies. Sur les 24 échantillons sélectionnés à des fins de comparaison, 91,7 % étaient positifs pour l’EPF utilisant l’appât Galleria , 62,5 % utilisant l’appât Tenebrio et 41,7 % utilisant le CTC. Nos résultats suggèrent que l’utilisation d’appâts à insectes pour isoler le FPE du sol est plus efficace que l’utilisation du milieu CTC. La comparaison des méthodes d’isolement en plus de l’identification et de la conservation du FPE a un impact positif sur les connaissances sur la biodiversité. L’amélioration de la collecte du FPE soutient le développement scientifique et l’innovation technologique.
Introduction
Le sol est la source de plusieurs micro-organismes, dont les champignons entomopathogènes (EPF). Ce groupe particulier de champignons est reconnu par leur capacité à coloniser et souvent à tuer les hôtes arthropodes, en particulier les insectes1. Après isolement, caractérisation, sélection de souches virulentes et enregistrement, les EPF sont produits en masse pour la lutte contre les arthropodes nuisibles, ce qui confirme leur pertinence économique2. En conséquence, l’isolement du FPE est considéré comme la première étape du développement d’un biopesticide. Beauveria spp. (Hypocreales: Cordycipitaceae) et Metarhizium spp. (Hypocreales: Clavicipitaceae) sont les champignons les plus couramment utilisés pour la lutte contre les arthropodesnuisibles 3. Les EPF ont été isolés avec succès du sol, des arthropodes présentant une mycose visible, des plantes colonisées et de la rhizosphère végétale 4,5.
L’isolement de l’EPF peut également être utile pour étudier la diversité, la distribution et l’écologie de ce groupe particulier. La littérature récente a rapporté que l’utilisation de l’EPF est sous-estimée, citant plusieurs applications non conventionnelles de l’EPF telles que leur capacité à améliorer la croissance des plantes4, à éliminer les contaminants toxiques du sol et à être utilisée en médecine6. La présente étude vise à comparer l’efficacité de l’isolement de l’EPF du sol à l’aide d’appâts à insectes par rapport au milieu de culture artificiel 7,8,9. L’utilisation de Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Phyralidae) comme appât pour insectes dans le contexte de l’isolement de la FPE a été bien acceptée. Ces larves sont utilisées dans le monde entier par la communauté scientifique comme modèle expérimental pour étudier les interactions hôte-pathogène10,11. La larve de Tenebrio molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae) est considérée comme un autre modèle d’insecte pour les études impliquant la virulence et pour l’isolement de l’EPF puisque cet insecte est facile à rarer en laboratoire à faible coût 7,12.
Des méthodes indépendantes de la culture, telles que l’utilisation de diverses techniques de PCR, peuvent être appliquées pour détecter et quantifier l’EPF sur leurs substrats, y compris le sol13,14. Néanmoins, pour isoler correctement ces colonies fongiques, leur substrat doit être cultivé sur un milieu artificiel sélectif9, ou les champignons présents dans les échantillons peuvent être appâtés à l’aide d’insectes sensibles15. D’une part, le CTC est un milieu artificiel sans dodine qui se compose de gélose au dextrose de pomme de terre enrichie en extrait de levure complété par du chloramphénicol, du thiabendazole et du cycloheximide. Ce médium a été développé par Fernandes et al. 9 pour maximiser la récupération de Beauveria spp. et Metarhizium spp. naturels du sol. D’autre part, les larves de G. mellonella et de T. molitor peuvent également être utilisées avec succès comme appâts pour obtenir des isolats d’EPF du sol. Néanmoins, selon Sharma et al.15, moins d’études ont rapporté l’utilisation concomitante et la comparaison de ces deux insectes appâts. Les sols des vignobles portugais ont montré des récupérations importantes de Metarhizium robertsii (Metscn.) Sorokin utilisant T. larves de molitor par rapport aux larves de G. mellonella; en revanche, Beauveria bassiana (Bals. -Criv.) L’isolement de Vuill était lié à l’utilisation d’appâts G. mellonella 15. Par conséquent, la décision sur la méthode d’isolement EPF à utiliser (c.-à-d. G. mellonella-appât, T. molitor-appât ou milieu CTC) devrait être envisagée en fonction de l’objectif de l’étude et de l’infrastructure du laboratoire. L’objectif de la présente étude est de comparer l’efficacité de l’utilisation d’appâts à insectes par rapport à un milieu sélectif artificiel pour isoler le FPE à partir d’échantillons de sol.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les habitats naturels et agricoles des sols sont des environnements typiques de l’EPF22 et constituent un excellent réservoir naturel. Dans la présente étude, deux méthodes d’isolement de la FPE à l’aide d’appâts à insectes par rapport à un milieu sélectif ont été abordées. La première étape de l’isolement est la collecte des échantillons de sol. Un stockage et une identification appropriés des échantillons de sol sont essentiels. L’information sur la latitude, la long…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée en partie par la Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) du Brésil, code financier 001, fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (numéro de projet E-26/010.001993/2015), et Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) du Brésil.
Materials
| Autoclave | Phoenix Luferco | 9451 | |
| Biosafety cabinet | Airstream ESCO | AC2-4E3 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Climate chambers | Eletrolab | EL212/3 | |
| Coverslip | RBR | 3871 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Drigalski spatula | Marienfeld | 1800024 | |
| GPS app | Geolocation app | 2.1.2005 | |
| Lactophenol blue solution | Sigma-Aldrich | 61335 | |
| Microscope | Zeiss Axio star plus | 1169 149 | |
| Microscope camera | Zeiss Axiocam 105 color | 426555-0000-000 | |
| Microscope softwere | Zen lite Zeiss 3.0 | ||
| Microscope slide | Olen | k5-7105-1 | |
| Microtube | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Petri plates | Kasvi | K30-6015 | |
| Pipette tip | Vatten | VT-230-200C/VT-230-1000C | |
| Pippette | HTL – Labmatepro | LMP 200 / LMP 1000 | |
| Plastic pots | Prafesta descartáveis | 8314 | |
| Polypropylene bags | Extrusa | 38034273/5561 | |
| Potato dextrose agar | Kasvi | K25-1022 | |
| Prism software 9.1.2 | Graph Pad | ||
| Shovel | Tramontina | 77907009 | |
| Tenebrio mollitor | Safari | QP98DLZ36 | |
| Thiabendazole | Sigma-Aldrich | T8904 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 | |
| Vortex | Biomixer | QL-901 | |
| Yeast extract | Kasvi | K25-1702 |
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