Энтомопатогенные грибковые колонии выделяют из образцов тропической почвы с помощью приманки Tenebrio , приманки Galleria , а также селективной искусственной среды, т. е. агара декстрозы картофеля, обогащенного дрожжевым экстрактом, дополненным хлорамфениколом, тиабендазолом и циклогексимидом (среда CTC).
Целью настоящего исследования является сравнение эффективности использования приманок от насекомых с искусственной селективной средой для выделения энтомопатогенных грибов (EPF) из образцов почвы. Почва является богатой средой обитания для микроорганизмов, в том числе EPF, особенно принадлежащих к родам Metarhizium и Beauveria, которые могут регулировать вредителей членистоногих. Биопрепараты на основе грибов доступны на рынке в основном для борьбы с вредителями сельскохозяйственных членистоногих. Тем не менее, несмотря на высокое эндемичное биоразнообразие, лишь немногие штаммы используются в коммерческих биопродуктах во всем мире. В настоящем исследовании 524 образца почвы были выращены на агаре декстрозы картофеля, обогащенном дрожжевым экстрактом, дополненным хлорамфениколом, тиабендазолом и циклогексимидом (среда CTC). Рост колоний грибов наблюдался в течение 3 недель. Все Metarhizium и Beauveria EPF были морфологически идентифицированы на уровне рода. Кроме того, некоторые изоляты были молекулярно идентифицированы на уровне видов. Двадцать четыре из этих 524 образцов почвы были также исследованы на предмет появления EPF с использованием метода приманки для насекомых (Galleria mellonella и Tenebrio molitor). В общей сложности 51 штамм EPF был выделен (41 Metarhizium spp. и 10 Beauveria spp.) из 524 образцов почвы. Все грибковые штаммы были выделены либо из пахотных земель, либо из лугов. Из 24 образцов, отобранных для сравнения, 91,7% были положительными на EPF с использованием приманки Galleria , 62,5% с использованием приманки Tenebrio и 41,7% с использованием CTC. Наши результаты показали, что использование приманок для насекомых для изоляции EPF от почвы более эффективно, чем использование среды CTC. Сравнение методов изоляции в дополнение к идентификации и сохранению EPF оказывает положительное влияние на знания о биоразнообразии. Улучшение коллекции EPF поддерживает научное развитие и технологические инновации.
Почва является источником нескольких микроорганизмов, в том числе энтомопатогенных грибов (EPF). Эта конкретная группа грибов признана по их способности колонизировать и часто убивать членистоногих хозяев, особенно насекомых1. После выделения, характеризации, отбора вирулентных штаммов и регистрации EPF массово производятся для борьбы с членистоногими вредителями, что подтверждает их экономическую значимость2. Соответственно, выделение EPF считается первым шагом к разработке биопестицида. Beauveria spp. (Hypocreales: Cordycipitaceae) и Metarhizium spp. (Hypocreales: Clavicipitaceae) являются наиболее распространенными грибами, используемыми для борьбы с членистоногими и вредителями3. EPF были успешно выделены из почвы, членистоногих с видимым микозом, колонизированных растений и растительной ризосферы 4,5.
Выделение EPF также может быть полезно для изучения разнообразия, распространения и экологии этой конкретной группы. В недавней литературе сообщалось, что использование EPF недооценивается, ссылаясь на несколько нетрадиционных применений EPF, таких как их способность улучшать рост растений4, удалять токсичные загрязняющие вещества из почвы и использоваться в медицине6. Настоящее исследование направлено на сравнение эффективности выделения EPF из почвы с использованием приманок насекомых с искусственной питательной средой 7,8,9. Использование Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Phyralidae) в качестве приманки для насекомых в контексте изоляции EPF было хорошо принято. Эти личинки используются во всем мире научным сообществом в качестве экспериментальной модели для изучения взаимодействий хозяин-патоген10,11. Личинка Tenebrio molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae) считается еще одной моделью насекомого для исследований, связанных с вирулентностью и выделением EPF, поскольку это насекомое легко редко встречается в лаборатории при низкой стоимости 7,12.
Независимые от культуры методы, такие как использование различных методов ПЦР, могут быть применены для обнаружения и количественной оценки EPF на их субстратах, включая почву13,14. Тем не менее, чтобы правильно изолировать эти колонии грибов, их субстрат следует культивировать на селективной искусственной среде9, или грибы, присутствующие в образцах, могут быть приманены с использованием чувствительных насекомых15. С одной стороны, CTC представляет собой искусственную среду без додина, которая состоит из агара декстрозы картофеля, обогащенного дрожжевым экстрактом, дополненным хлорамфениколом, тиабендазолом и циклогексимидом. Эта среда была разработана Fernandes et al. 9 для максимального извлечения естественных Beauveria spp. и Metarhizium spp. из почвы. С другой стороны, личинки G. mellonella и T. molitor также могут быть успешно использованы в качестве приманок для получения изолятов EPF из почвы. Тем не менее, согласно Sharma et al.15, в меньшем количестве исследований сообщалось о сопутствующем использовании и сравнении этих двух насекомых-приманок. На почвах португальских виноградников наблюдалось значительное восстановление Metarhizium robertsii (Metscn.) Сорокин с использованием Т. личинки молитора по сравнению с личинками G. mellonella; напротив, Beauveria bassiana (Балс. -Крив.) Изоляция Vuill была связана с использованием приманок G. mellonella 15. Поэтому решение о том, какой метод изоляции EPF использовать (например, G. mellonella-bait, T. molitor-bait или CTC medium), следует рассматривать в соответствии с целью исследования и лабораторной инфраструктурой. Целью настоящего исследования является сравнение эффективности использования приманок от насекомых с искусственной селективной средой для выделения EPF из образцов почвы.
Естественные и сельскохозяйственные почвенные среды обитания являются типичными средами для EPF22 и отличным природным резервуаром. В настоящем исследовании рассматривались два метода изоляции EPF с использованием приманок от насекомых по сравнению с селективной средой. П?…
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было частично профинансировано Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) из Бразилии, финансовый код 001, Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (номер проекта E-26/010.001993/2015), и Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) из Бразилии.
Autoclave | Phoenix Luferco | 9451 | |
Biosafety cabinet | Airstream ESCO | AC2-4E3 | |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
Climate chambers | Eletrolab | EL212/3 | |
Coverslip | RBR | 3871 | |
Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
Drigalski spatula | Marienfeld | 1800024 | |
GPS app | Geolocation app | 2.1.2005 | |
Lactophenol blue solution | Sigma-Aldrich | 61335 | |
Microscope | Zeiss Axio star plus | 1169 149 | |
Microscope camera | Zeiss Axiocam 105 color | 426555-0000-000 | |
Microscope softwere | Zen lite Zeiss 3.0 | ||
Microscope slide | Olen | k5-7105-1 | |
Microtube | BRAND | Z336769-1PAK | |
Petri plates | Kasvi | K30-6015 | |
Pipette tip | Vatten | VT-230-200C/VT-230-1000C | |
Pippette | HTL – Labmatepro | LMP 200 / LMP 1000 | |
Plastic pots | Prafesta descartáveis | 8314 | |
Polypropylene bags | Extrusa | 38034273/5561 | |
Potato dextrose agar | Kasvi | K25-1022 | |
Prism software 9.1.2 | Graph Pad | ||
Shovel | Tramontina | 77907009 | |
Tenebrio mollitor | Safari | QP98DLZ36 | |
Thiabendazole | Sigma-Aldrich | T8904 | |
Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 | |
Vortex | Biomixer | QL-901 | |
Yeast extract | Kasvi | K25-1702 |