Comparação de métodos para isolar fungos entomopatômicos de amostras de solo
Summary
Colônias fúngicas entomopatômicas são isoladas de amostras de solo tropical usando isca tenebrio , isca de Galleria , bem como meio artificial seletivo, ou seja, ágar de dextrose de batata enriquecido com extrato de levedura suplementado com clorofenicol, tiaabzolendae e ciclohexmida (meio CTC).
Abstract
O objetivo do presente estudo é comparar a eficácia do uso de iscas de insetos versus meio seletivo artificial para isolar fungos entomopatogênicos (EPF) a partir de amostras de solo. O solo é um rico habitat para microrganismos, incluindo o EPF particularmente pertencente aos gêneros Metarhizium e Beauveria, que podem regular pragas de artrópodes. Produtos biológicos à base de fungos estão disponíveis no mercado principalmente para controle de pragas de artrópodes agrícolas. No entanto, apesar da alta biodiversidade endêmica, apenas algumas cepas são usadas em bioprodutos comerciais em todo o mundo. No presente estudo, 524 amostras de solo foram cultivadas em ágar de dextrose de batata enriquecido com extrato de levedura suplementado com clorofenicol, thiabendazol e cicloheximida (meio CTC). O crescimento das colônias fúngicas foi observado durante 3 semanas. Todos os Metarhizium e Beauveria EPF foram morfologicamente identificados no nível do gênero. Além disso, alguns isolados foram identificados molecularmente no nível da espécie. Vinte e quatro dessas 524 amostras de solo também foram pesquisadas para ocorrência de EPF utilizando o método de isca de insetos (Galleria mellonella e Tenebrio molitor). Foram isoladas 51 cepas de EPF (41 Metarhizium spp. e 10 Beauveria spp.) das 524 amostras de solo. Todas as cepas fúngicas foram isoladas de plantações ou pastagens. Das 24 amostras selecionadas para comparação, 91,7% foram positivas para ePF usando isca galleria , 62,5% usando isca Tenebrio e 41,7% utilizando CTC. Nossos resultados sugeriram que o uso de iscas de insetos para isolar o EPF do solo é mais eficiente do que usar o meio CTC. A comparação de métodos de isolamento, além da identificação e conservação da EPF, tem impacto positivo no conhecimento sobre biodiversidade. O aprimoramento da coleção EPF apoia o desenvolvimento científico e a inovação tecnológica.
Introduction
O solo é a fonte de vários microrganismos, incluindo fungos entomopatômicos (EPF). Este grupo particular de fungos é reconhecido por sua capacidade de colonizar e muitas vezes matar hospedeiros artrópodes, especialmente insetos1. Após isolamento, caracterização, seleção de cepas virulentas e registro, a EPF é produzida em massa para o controle artrópode-praga, que sustenta sua relevância econômica2. Assim, o isolamento da EPF é considerado o primeiro passo para o desenvolvimento de um biopesticida. Beauveria spp. (Hipocreales: Cordycipitaceae) e Metarhizium spp. (Hipocreales: Clavicipitaceae) são os fungos mais comuns usados para o controle artrópode-praga3. A EPF foi isolada com sucesso do solo, artrópodes com micose visível, plantas colonizadas e rizosfera vegetal 4,5.
O isolamento da EPF também pode ser útil para estudar a diversidade, distribuição e ecologia desse grupo em particular. A literatura recente relatou que o uso de EPF é subestimado, citando diversas aplicações não convencionais de EPF, como sua capacidade de melhorar o crescimento das plantas4, remover contaminantes tóxicos do solo e ser utilizado na medicina6. O presente estudo tem como objetivo comparar a eficiência da isolação do EPF do solo usando iscas de insetos versus cultura artificial 7,8,9. O uso da Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Phyralidae) como isca de inseto no contexto do isolamento da EPF tem sido bem aceito. Essas larvas são usadas em todo o mundo pela comunidade científica como modelo experimental para estudar interações hospedeiro-patógeno10,11. A larva tenebrio molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae) é considerada outro modelo de inseto para estudos envolvendo virulência e isolamento da EPF, uma vez que este inseto é fácil de raro em laboratório a um baixo custo 7,12.
Métodos independentes da cultura, como o uso de uma variedade de técnicas de PCR, podem ser aplicados para detectar e quantificar o EPF em seus substratos, incluindo o solo13,14. No entanto, para isolar adequadamente essas colônias fúngicas, seu substrato deve ser cultivado em um meio artificial seletivo9, ou os fungos presentes nas amostras podem ser iscas usando insetos sensíveis15. Por um lado, o CTC é um meio artificial sem dodine que consiste em ágar de dextrose de batata enriquecido com extrato de levedura suplementado com clorofenicol, thiabendazol e cicloheximida. Este meio foi desenvolvido por Fernandes et al. 9 para maximizar a recuperação de Beauveria spp. e Metarhizium spp. do solo. Por outro lado, as larvas G. mellonella e T. molitor também podem ser usadas com sucesso como iscas para obter isolados de EPF do solo. No entanto, de acordo com Sharma et al.15, menos estudos relataram o uso concomitante e a comparação desses dois insetos iscas. Os solos de vinhedos portugueses apresentaram recuperações significativas de Metarhizium robertsii (Metscn.) Sorokin usando T. larvas molitor em comparação com as larvas G. mellonella; em contraste, Beauveria bassiana (Bals. -Criv.) O isolamento vuill estava ligado ao uso das iscas de G. mellonella 15. Portanto, a decisão sobre qual método de isolamento da EPF utilizar (ou seja, G. mellonella-isca, T. molitor-isca ou meio CTC) deve ser considerada de acordo com o objetivo do estudo e a infraestrutura laboratorial. O objetivo do presente estudo é comparar a eficácia do uso de iscas de insetos versus meio seletivo artificial para isolar o EPF a partir de amostras de solo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Habitats naturais e agrícolas do solo são ambientes típicos da EPF22 e um excelente reservatório natural. No presente estudo, foram abordados dois métodos de isolamento da EPF utilizando iscas de insetos versus meio seletivo. O primeiro passo para o isolamento é a coleta das amostras de solo. O armazenamento adequado e a identificação das amostras do solo são cruciais. Informações sobre a latitude, longitude, tipo de solo e bioma são essenciais para estudos envolvendo epidemiológicos,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi financiado em parte pela Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) do Brasil, pelo Código Financeiro 001, Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (número do projeto E-26/010.001993/2015) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) do Brasil.
Materials
| Autoclave | Phoenix Luferco | 9451 | |
| Biosafety cabinet | Airstream ESCO | AC2-4E3 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Climate chambers | Eletrolab | EL212/3 | |
| Coverslip | RBR | 3871 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Drigalski spatula | Marienfeld | 1800024 | |
| GPS app | Geolocation app | 2.1.2005 | |
| Lactophenol blue solution | Sigma-Aldrich | 61335 | |
| Microscope | Zeiss Axio star plus | 1169 149 | |
| Microscope camera | Zeiss Axiocam 105 color | 426555-0000-000 | |
| Microscope softwere | Zen lite Zeiss 3.0 | ||
| Microscope slide | Olen | k5-7105-1 | |
| Microtube | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Petri plates | Kasvi | K30-6015 | |
| Pipette tip | Vatten | VT-230-200C/VT-230-1000C | |
| Pippette | HTL – Labmatepro | LMP 200 / LMP 1000 | |
| Plastic pots | Prafesta descartáveis | 8314 | |
| Polypropylene bags | Extrusa | 38034273/5561 | |
| Potato dextrose agar | Kasvi | K25-1022 | |
| Prism software 9.1.2 | Graph Pad | ||
| Shovel | Tramontina | 77907009 | |
| Tenebrio mollitor | Safari | QP98DLZ36 | |
| Thiabendazole | Sigma-Aldrich | T8904 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 | |
| Vortex | Biomixer | QL-901 | |
| Yeast extract | Kasvi | K25-1702 |
References
- Roberts, D. W., St. Leger, R. J. Metarhizium spp., cosmopolitan insect-pathogenic fungi: Mycological aspects. Advances in Applied Microbiology. 54, 1-70 (2004).
- do Nascimento Silva, J., et al. New cost-effective bioconversion process of palm kernel cake into bioinsecticides based on Beauveria bassiana and Isaria javanica. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (6), 2595-2606 (2018).
- Faria, M. R., Wraight, S. P. Mycoinsecticides and Mycoacaricides: A comprehensive list with worldwide coverage and international classification of formulation types. Biological Control. 43 (3), 237-256 (2007).
- Vega, F. V. The use of fungal entomopathogens as endophytes in biological control: a review. Applied Mycology. 110 (1), 4-30 (2018).
- Sharma, L., et al. Advances in entomopathogen isolation: A case of bacteria and fungi. Microorganisms. 9 (1), 1-28 (2021).
- Litwin, A., Nowak, M., Różalska, S. Entomopathogenic fungi: unconventional applications. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 19, 23-42 (2020).
- Kim, J. C., et al. Tenebrio molitor-mediated entomopathogenic fungal library construction for pest management. Journal of Asia-Pacific Entomology. 21 (1), 196-204 (2018).
- Meyling, N., Eilenberg, J. Ocurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, Ecosystems and Environment. 113 (1), 336-341 (2006).
- Fernandes, E. K. K., Keyser, C. A., Rangel, D. E. N., Foster, R. N., Roberts, D. W. CTC medium: A novel dodine-free selective medium for isolating entomopathogenic fungi, especially Metarhizium acridum, from soil. Biological Control. 54 (3), 197-205 (2010).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Molecular genetics of Beuveria bassiana infection of insects. Advantages in Genetics. 94, 165-249 (2016).
- Pereira, M. F., Rossi, C. C., Silva, G. C., Rosa, J. N., Bazzolli, M. S. Galleria mellonella as infection model: an in depth look at why it works and practical considerations for successful application. Pathogens and Disease. 78 (8), (2020).
- Souza, P. C., et al. Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae) as an alternative host to study fungal infections. Journal of Microbiological Methods. 118, 182-186 (2015).
- Canfora, L., et al. Development of a method for detection and quantification of B. brongniartii and B. bassiana in soil. Scientific Reports. 6, 22933 (2016).
- Garrido-Jurado, I., et al. Transient endophytic colonization of melon plants by entomopathogenic fungi after foliar application for the control of Bemisia tabaci Gennadius (Hemiptera: Aleyrodidae). Journal of Pest Science. 90, 319-330 (2016).
- Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: suggesting a ‘Galleria-Tenebrio-bait method’ as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana). MycoKeys. 38, 1-23 (2018).
- Riddell, R. W. Permanent stained mycological preparations obtained by slide culture. Mycologia. 42 (2), 265-270 (1950).
- Bischoff, J., Rehner, S. A., Humber, R. A. A multilocus phylogeny of the Metarhizium anisopliae lineage. Mycologia. 101 (4), 512-530 (2009).
- Rehner, S. A., et al. Phylogeny and systematics of the anamorphic, entomopathogenic genus Beauveria. Mycologia. 103 (5), 1055-1073 (2011).
- Seifert, K. A., Gams, W., Seifert, K. A., Morgan-Jones, G., Gams, W., Kendrick, B. Anamorphs of Clavicipitaceae, Cordycipitaceae and Ophiocordycipitaceae. The Genera of Hyphomycetes. CBS Biodiversity Series. CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre. 9, 903-906 (2011).
- Humber, R. A., Lacey, L. A. Identification of entomopathogenic fungi. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology., 2nd ed. , 151-187 (2012).
- Mesquita, E., et al. Efficacy of a native isolate of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae against larval tick outbreaks under semifield conditions. BioControl. 65 (3), 353-362 (2020).
- St Leger, R. J. Studies on adaptations of Metarhizium anisopliae to life in the soil. Journal of Invertebrate Pathology. 98 (3), 271-276 (2008).
- Mar, T. T., Suwannarach, N., Lumyong, S. Isolation of entomopathogenic fungi from Nortern Thailand and their production in cereal grains. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28 (12), 3281-3291 (2012).
- Rocha, L. F. N., Inglis, P. W., Humber, R. A., Kipnis, A., Luz, C. Occurrence of Metarhizium spp. in central Brazilian soils. Journal of Basic Microbiology. 53 (3), 251-259 (2013).
- Quesada-Moraga, E., Navas-Cortés, J. A., Maranhao, E. A. A., Ortiz-Urquiza, A., Santiago-Álvarez, C. Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils. Mycological Research. 111 (8), 947-966 (2007).
- Mora, M. A. E., Rouws, J. R. C., Fraga, M. E. Occurrence of entomopathogenic fungi in atlantic forest soils. Microbiology Discovery. 4 (1), 1-7 (2016).
- Goble, T. A., Dames, J. F., Hill, M. P., Moore, S. D.The effects of farming system, habitat type and bait type on the isolation of entomopathogenic fungi from citrus soils in the Eastern Cape Province, South Africa. BioControl. 55 (3), 399-412 (2010).
- Medo, J., Cagáň, L. Factors affecting the occurrence of entomopathogenic fungi in soils of Slovakia as revealed using two methods. Biological Control. 59 (2), 200-208 (2011).
- Chase, A. R., Osborne, L. S., Ferguson, V. M. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. 69, 285-292 (1986).
- Liu, Z. Y., Milner, R. J., McRae, C. F., Lutton, G. G. The use of dodine in selective media for the isolation of Metarhizium spp. from soil. Journal of Invertebrate Pathology. 62, 248-251 (1993).
- Rangel, D. E. N., Dettenmaier, S. J., Fernandes, E. K. K., Roberts, D. W. Susceptibility of Metarhizium spp. and other entomopathogenic fungi to dodine-based selective media. Biocontrol Science and Technology. 20 (4), 375-389 (2010).
- Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae. BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).
- Enkerli, J., Widmer, F., Keller, S. Long-term field persistence of Beauveria brongniartii strains applied as biocontrol agents against European cockchafer larvae in Switzerland. Biological Control. 29 (1), 115-123 (2004).
- Imoulan, A., Alaoui, A., El Meziane, A. Natural occurrence of soil-borne entomopathogenic fungi in the Moroccan endemic forest of Argania spinosa and their pathogenicity to Ceratitis capitata. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (11), 2619-2628 (2011).
- Keyser, C. A., De Fine Licht, H. H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark. BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).
