Sammenligning av metoder for å isolere entomopathogene sopp fra jordprøver
Summary
Entomopathogene soppkolonier er isolert fra tropiske jordprøver ved hjelp av Tenebrio agn, Galleria agn, samt selektivt kunstig medium, det vil si potetdekstrose agar beriket med gjærekstrakt supplert med kloramfenikol, tiabendazol og cycloheximid (CTC-medium).
Abstract
Målet med den nåværende studien er å sammenligne effektiviteten av å bruke insekt baits versus kunstig selektivt medium for å isolere entomopathogene sopp (EPF) fra jordprøver. Jorden er et rikt habitat for mikroorganismer, inkludert EPF som spesielt tilhører slekten Metarhizium og Beauveria, som kan regulere leddyr. Biologiske produkter basert på sopp er tilgjengelige i markedet hovedsakelig for landbruks leddyr skadedyrsbekjempelse. Likevel, til tross for det høye endemiske biologiske mangfoldet, brukes bare noen få stammer i kommersielle bioprodukter over hele verden. I den nåværende studien ble 524 jordprøver dyrket på potetdekstrose agar beriket med gjærekstrakt supplert med kloramfenikol, tiabendazol og cycloheximid (CTC-medium). Veksten av soppkolonier ble observert i 3 uker. Alle Metarhizium og Beauveria EPF ble morfologisk identifisert på slektsnivå. I tillegg ble noen isolasjoner molekylært identifisert på artsnivå. 24 av disse 524 jordprøvene ble også kartlagt for EPF-forekomst ved hjelp av insektets agnmetode (Galleria mellonella og Tenebrio molitor). Totalt 51 EPF-stammer ble isolert (41 Metarhizium spp. og 10 Beauveria spp.) fra de 524 jordprøvene. Alle soppstammer ble isolert enten fra jordbruksområder eller gressletter. Av de 24 utvalgene som ble valgt for sammenligning, var 91,7% positive for EPF ved hjelp av Galleria agn, 62,5% ved hjelp av Tenebrio agn og 41,7% ved hjelp av CTC. Våre resultater antydet at bruk av insektagn for å isolere EPF fra jorda er mer effektivt enn å bruke CTC-mediet. Sammenligningen av isolasjonsmetoder i tillegg til identifisering og bevaring av EPF har en positiv innvirkning på kunnskapen om biologisk mangfold. Forbedringen av EPF-samlingen støtter vitenskapelig utvikling og teknologisk innovasjon.
Introduction
Jord er kilden til flere mikroorganismer, inkludert entomopathogene sopp (EPF). Denne spesielle gruppen sopp er anerkjent av deres evne til å kolonisere og ofte drepe leddyr verter, spesielt insekter1. Etter isolasjon, karakterisering, utvalg av virulente stammer og registrering er EPF masseprodusert for leddyr-skadedyrskontroll, som støtter deres økonomiske relevans2. Følgelig anses isolasjonen av EPF som det første skrittet til utviklingen av et biopesticide. Beauveria spp. (Hypocreales: Cordycipitaceae) og Metarhizium spp. (Hypocreales: Clavicipitaceae) er de vanligste soppene som brukes til leddyr-skadedyrskontroll3. EPF har blitt vellykket isolert fra jord, leddyr med synlig mykose, koloniserte planter og plante rhizosphere 4,5.
Isolering av EPF kan også være nyttig for å studere mangfoldet, fordelingen og økologien til denne gruppen. Nyere litteratur rapporterte at bruken av EPF er undervurdert, med henvisning til flere ukonvensjonelle anvendelser av EPF som deres evne til å forbedre planteveksten4, for å fjerne giftige forurensninger fra jorda, og som skal brukes i medisin6. Den nåværende studien tar sikte på å sammenligne effektiviteten ved å isolere EPF fra jord ved hjelp av insekt baits versus kunstig kultur medium 7,8,9. Bruken av Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Phyralidae) som insekt agn i sammenheng med EPF-isolasjon har blitt godt akseptert. Disse larvene brukes over hele verden av det vitenskapelige samfunnet som en eksperimentell modell for å studere vertspatogeninteraksjoner10,11. Tenebrio molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae) larve regnes som en annen insektmodell for studier som involverer virulens og for isolasjon av EPF siden dette insektet er lett å sjelden i laboratoriet til en lav pris 7,12.
Kulturuavhengige metoder som bruk av en rekke PCR-teknikker kan brukes til å oppdage og kvantifisere EPF på deres substrater, inkludert jord13,14. Likevel, for å isolere disse soppkoloniene riktig, bør deres substrat dyrkes på et selektivt kunstig medium9, eller soppene som er tilstede i prøvene, kan baited ved hjelp av følsomme insekter15. På den ene siden er CTC et dodinefritt kunstig medium som består av potetdekstrose agar beriket med gjærekstrakt supplert med kloramfenikol, tiabendazol og cycloheximid. Dette mediet ble utviklet av Fernandes et al. 9 for å maksimere utvinningen av naturlig forekommende Beauveria spp. og Metarhizium spp. fra jorda. På den annen side kan G. mellonella og T. molitor larver også med hell brukes som agn for å få EPF-isolasjoner fra jorda. Likevel, ifølge Sharma et al.15, rapporterte færre studier samtidig bruk og sammenligning av disse to agninsektene. Portugisiske vingårder jord viste betydelige utvinninger av Metarhizium robertsii (Metscn.) Sorokin bruker T. molitor larver i forhold til G. mellonella larver; I kontrast, Beauveria bassiana (Bals. -Criv.) Vuillisolasjon var knyttet til bruk av G. mellonella agn15. Derfor bør beslutningen om hvilken EPF-isolasjonsmetode som skal brukes (dvs. G. mellonella-agn, T. molitor-agn eller CTC-medium) vurderes i henhold til studiens mål og laboratorieinfrastrukturen. Målet med den nåværende studien er å sammenligne effektiviteten av å bruke insekt baits versus kunstig selektivt medium for å isolere EPF fra jordprøver.
Protocol
Representative Results
Discussion
Naturlige og landbruksjord habitater er typiske miljøer for EPF22 og et utmerket naturlig reservoar. I den nåværende studien ble to metoder for EPF-isolasjon ved hjelp av insektagn kontra selektivt medium adressert. Det første trinnet for isolasjon er samlingen av jordprøvene. Riktig lagring og identifisering av jordprøver er avgjørende. Informasjon om breddegrad, lengdegrad, jordtype og biome er avgjørende for studier som involverer epidemiologiske, modellerings- og geospatiale fag<sup cl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble delvis finansiert av Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) fra Brasil, finanskode 001, Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (prosjektnummer E-26/010.001993/2015) og Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) fra Brasil.
Materials
| Autoclave | Phoenix Luferco | 9451 | |
| Biosafety cabinet | Airstream ESCO | AC2-4E3 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Climate chambers | Eletrolab | EL212/3 | |
| Coverslip | RBR | 3871 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Drigalski spatula | Marienfeld | 1800024 | |
| GPS app | Geolocation app | 2.1.2005 | |
| Lactophenol blue solution | Sigma-Aldrich | 61335 | |
| Microscope | Zeiss Axio star plus | 1169 149 | |
| Microscope camera | Zeiss Axiocam 105 color | 426555-0000-000 | |
| Microscope softwere | Zen lite Zeiss 3.0 | ||
| Microscope slide | Olen | k5-7105-1 | |
| Microtube | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Petri plates | Kasvi | K30-6015 | |
| Pipette tip | Vatten | VT-230-200C/VT-230-1000C | |
| Pippette | HTL – Labmatepro | LMP 200 / LMP 1000 | |
| Plastic pots | Prafesta descartáveis | 8314 | |
| Polypropylene bags | Extrusa | 38034273/5561 | |
| Potato dextrose agar | Kasvi | K25-1022 | |
| Prism software 9.1.2 | Graph Pad | ||
| Shovel | Tramontina | 77907009 | |
| Tenebrio mollitor | Safari | QP98DLZ36 | |
| Thiabendazole | Sigma-Aldrich | T8904 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 | |
| Vortex | Biomixer | QL-901 | |
| Yeast extract | Kasvi | K25-1702 |
References
- Roberts, D. W., St. Leger, R. J. Metarhizium spp., cosmopolitan insect-pathogenic fungi: Mycological aspects. Advances in Applied Microbiology. 54, 1-70 (2004).
- do Nascimento Silva, J., et al. New cost-effective bioconversion process of palm kernel cake into bioinsecticides based on Beauveria bassiana and Isaria javanica. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (6), 2595-2606 (2018).
- Faria, M. R., Wraight, S. P. Mycoinsecticides and Mycoacaricides: A comprehensive list with worldwide coverage and international classification of formulation types. Biological Control. 43 (3), 237-256 (2007).
- Vega, F. V. The use of fungal entomopathogens as endophytes in biological control: a review. Applied Mycology. 110 (1), 4-30 (2018).
- Sharma, L., et al. Advances in entomopathogen isolation: A case of bacteria and fungi. Microorganisms. 9 (1), 1-28 (2021).
- Litwin, A., Nowak, M., Różalska, S. Entomopathogenic fungi: unconventional applications. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 19, 23-42 (2020).
- Kim, J. C., et al. Tenebrio molitor-mediated entomopathogenic fungal library construction for pest management. Journal of Asia-Pacific Entomology. 21 (1), 196-204 (2018).
- Meyling, N., Eilenberg, J. Ocurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, Ecosystems and Environment. 113 (1), 336-341 (2006).
- Fernandes, E. K. K., Keyser, C. A., Rangel, D. E. N., Foster, R. N., Roberts, D. W. CTC medium: A novel dodine-free selective medium for isolating entomopathogenic fungi, especially Metarhizium acridum, from soil. Biological Control. 54 (3), 197-205 (2010).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Molecular genetics of Beuveria bassiana infection of insects. Advantages in Genetics. 94, 165-249 (2016).
- Pereira, M. F., Rossi, C. C., Silva, G. C., Rosa, J. N., Bazzolli, M. S. Galleria mellonella as infection model: an in depth look at why it works and practical considerations for successful application. Pathogens and Disease. 78 (8), (2020).
- Souza, P. C., et al. Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae) as an alternative host to study fungal infections. Journal of Microbiological Methods. 118, 182-186 (2015).
- Canfora, L., et al. Development of a method for detection and quantification of B. brongniartii and B. bassiana in soil. Scientific Reports. 6, 22933 (2016).
- Garrido-Jurado, I., et al. Transient endophytic colonization of melon plants by entomopathogenic fungi after foliar application for the control of Bemisia tabaci Gennadius (Hemiptera: Aleyrodidae). Journal of Pest Science. 90, 319-330 (2016).
- Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: suggesting a ‘Galleria-Tenebrio-bait method’ as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana). MycoKeys. 38, 1-23 (2018).
- Riddell, R. W. Permanent stained mycological preparations obtained by slide culture. Mycologia. 42 (2), 265-270 (1950).
- Bischoff, J., Rehner, S. A., Humber, R. A. A multilocus phylogeny of the Metarhizium anisopliae lineage. Mycologia. 101 (4), 512-530 (2009).
- Rehner, S. A., et al. Phylogeny and systematics of the anamorphic, entomopathogenic genus Beauveria. Mycologia. 103 (5), 1055-1073 (2011).
- Seifert, K. A., Gams, W., Seifert, K. A., Morgan-Jones, G., Gams, W., Kendrick, B. Anamorphs of Clavicipitaceae, Cordycipitaceae and Ophiocordycipitaceae. The Genera of Hyphomycetes. CBS Biodiversity Series. CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre. 9, 903-906 (2011).
- Humber, R. A., Lacey, L. A. Identification of entomopathogenic fungi. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology., 2nd ed. , 151-187 (2012).
- Mesquita, E., et al. Efficacy of a native isolate of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae against larval tick outbreaks under semifield conditions. BioControl. 65 (3), 353-362 (2020).
- St Leger, R. J. Studies on adaptations of Metarhizium anisopliae to life in the soil. Journal of Invertebrate Pathology. 98 (3), 271-276 (2008).
- Mar, T. T., Suwannarach, N., Lumyong, S. Isolation of entomopathogenic fungi from Nortern Thailand and their production in cereal grains. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28 (12), 3281-3291 (2012).
- Rocha, L. F. N., Inglis, P. W., Humber, R. A., Kipnis, A., Luz, C. Occurrence of Metarhizium spp. in central Brazilian soils. Journal of Basic Microbiology. 53 (3), 251-259 (2013).
- Quesada-Moraga, E., Navas-Cortés, J. A., Maranhao, E. A. A., Ortiz-Urquiza, A., Santiago-Álvarez, C. Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils. Mycological Research. 111 (8), 947-966 (2007).
- Mora, M. A. E., Rouws, J. R. C., Fraga, M. E. Occurrence of entomopathogenic fungi in atlantic forest soils. Microbiology Discovery. 4 (1), 1-7 (2016).
- Goble, T. A., Dames, J. F., Hill, M. P., Moore, S. D.The effects of farming system, habitat type and bait type on the isolation of entomopathogenic fungi from citrus soils in the Eastern Cape Province, South Africa. BioControl. 55 (3), 399-412 (2010).
- Medo, J., Cagáň, L. Factors affecting the occurrence of entomopathogenic fungi in soils of Slovakia as revealed using two methods. Biological Control. 59 (2), 200-208 (2011).
- Chase, A. R., Osborne, L. S., Ferguson, V. M. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. 69, 285-292 (1986).
- Liu, Z. Y., Milner, R. J., McRae, C. F., Lutton, G. G. The use of dodine in selective media for the isolation of Metarhizium spp. from soil. Journal of Invertebrate Pathology. 62, 248-251 (1993).
- Rangel, D. E. N., Dettenmaier, S. J., Fernandes, E. K. K., Roberts, D. W. Susceptibility of Metarhizium spp. and other entomopathogenic fungi to dodine-based selective media. Biocontrol Science and Technology. 20 (4), 375-389 (2010).
- Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae. BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).
- Enkerli, J., Widmer, F., Keller, S. Long-term field persistence of Beauveria brongniartii strains applied as biocontrol agents against European cockchafer larvae in Switzerland. Biological Control. 29 (1), 115-123 (2004).
- Imoulan, A., Alaoui, A., El Meziane, A. Natural occurrence of soil-borne entomopathogenic fungi in the Moroccan endemic forest of Argania spinosa and their pathogenicity to Ceratitis capitata. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (11), 2619-2628 (2011).
- Keyser, C. A., De Fine Licht, H. H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark. BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).
