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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Un enfoque de segmentación sin etiquetas para imágenes intravitales del microambiente tumoral mamario

Published: May 24, 2022 doi: 10.3791/63413
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1, 1,3
1Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Pathology, University of Wisconsin-Madison, 3Carbone Cancer Center, University of Wisconsin-Madison

Summary

El método de imágenes intravitales descrito aquí utiliza la segunda generación armónica de colágeno y la fluorescencia endógena del cofactor metabólico NAD(P)H para segmentar de forma no invasiva un microambiente tumoral no etiquetado en compartimentos tumorales, estromales y vasculares para un análisis en profundidad de imágenes intravitales 4D.

Abstract

La capacidad de visualizar interacciones fisiológicas complejas y dinámicas entre numerosos tipos de células y la matriz extracelular (ECM) dentro de un microambiente tumoral vivo es un paso importante hacia la comprensión de los mecanismos que regulan la progresión del tumor. Si bien esto se puede lograr a través de las técnicas actuales de imágenes intravitales, sigue siendo un desafío debido a la naturaleza heterogénea de los tejidos y la necesidad de contexto espacial dentro de la observación experimental. Con este fin, hemos desarrollado un flujo de trabajo de imágenes intravitales que combina imágenes de segunda generación armónica de colágeno, fluorescencia endógena del cofactor metabólico NAD(P)H y microscopía de imágenes de por vida de fluorescencia (FLIM) como un medio para compartimentar no invasivamente el microambiente tumoral en dominios básicos del nido tumoral, el estroma circundante o ECM, y la vasculatura. Este protocolo no invasivo detalla el proceso paso a paso que va desde la adquisición de imágenes de lapso de tiempo de modelos de tumores mamarios hasta el análisis de posprocesamiento y la segmentación de imágenes. La principal ventaja de este flujo de trabajo es que explota las firmas metabólicas para contextualizar el microambiente tumoral vivo que cambia dinámicamente sin el uso de etiquetas fluorescentes exógenas, lo que lo hace ventajoso para los modelos de xenoinjerto derivado de pacientes humanos (PDX) y el uso clínico futuro donde los fluoróforos extrínsecos no son fácilmente aplicables.

Introduction

Se sabe que la matriz extracelular (ECM) en el microambiente tumoral se deposita y remodela dinámicamente por múltiples tipos de células para facilitar aún más la progresión de la enfermedad 1,2,3. Estas alteraciones de la matriz proporcionan señales mecánicas y biológicas que alteran el comportamiento celular y, a menudo, resultan en un ciclo continuo de remodelación de la matriz4. La investigación sobre la interacción dinámica y recíproca entre las células tumorales y la matriz extracelular a menudo se lleva a cabo utilizando sistemas tridimensionales (3D) de cultivo in vitro o microfluídicos. Si bien estos enfoques de abajo hacia arriba han demostrado mecanismos de remodelación de la ECM 5,6,7, aumento de la proliferación 8, transición epitelial a mesenquimal 9,10,11,12 y migración e invasión de células tumorales 7,13,14,15,16 , su enfoque se ha centrado principalmente en unos pocos tipos de células (por ejemplo, células tumorales o fibroblastos) dentro de una matriz 3D homogénea en comparación con la diversidad y heterogeneidad de las interacciones presentes dentro de un tejido fisiológico. Además de los sistemas in vitro, la histología tumoral ex vivo también puede proporcionar cierta información sobre estas interacciones célula-célula y célula-ECM17. La inmunohistoquímica tiene la ventaja de poder analizar múltiples tipos de células con respecto a la composición espacialmente heterogénea y la arquitectura de la ECM, pero los puntos finales estáticos del tejido fijo no capturan la naturaleza dinámica de las interacciones entre las células y el microambiente. Las imágenes intravitales han abierto la puerta a interrogar interacciones diversas y dinámicas dentro del contexto fisiológico del microambiente tumoral nativo.

Las capacidades de las imágenes tumorales intravitales están avanzando rápidamente. Las mejoras en el diseño de ventanas de imágenes y las técnicas quirúrgicas para implantar las ventanas han permitido la obtención de imágenes tumorales longitudinales a largo plazo en una variedad de ubicaciones anatómicas (es decir, tumor primario, ganglios linfáticos, sitios metastásicos 18,19,20). Además, la capacidad de la instrumentación óptica para visualizar y recopilar datos en múltiples dimensiones (es decir, espectral, intensidad de fluorescencia espacial y vida útil), y a alta resolución y velocidad (velocidad de video) se está volviendo ampliamente accesible. La tecnología mejorada brinda la oportunidad de explorar cambios rápidos en la señalización celular y la dinámica fenotípica dentro de un entorno fisiológico. Por último, la expansión de las herramientas optogenéticas y la amplia gama de construcciones fluorescentes genéticas permiten el etiquetado de tipos celulares específicos para capturar la migración celular en el microambiente tumoral o el rastreo del linaje celular durante el desarrollo o la progresión de la enfermedad21,22. El uso de estas herramientas en combinación con la tecnología CRISPR / Cas9 brinda a los investigadores la oportunidad de generar modelos animales únicos de manera oportuna.

Si bien todos estos avances hacen que las imágenes intravitales sean un método cada vez más poderoso para explorar las interacciones celulares dinámicas y fisiológicas, todavía existe una necesidad importante de desarrollar estrategias que proporcionen un contexto espacial, temporal y estructural a nivel tisular a estas interacciones biológicas. Actualmente, muchos estudios de imágenes intravitales compensan la falta de puntos de referencia visuales, como los vasos sanguíneos, inyectando tintes fluorescentes en la vasculatura o empleando modelos de ratón que expresan exógenamente proteínas fluorescentes para delinear las características físicas. Los colorantes inyectables y los sustratos como el dextrans fluorescente se utilizan ampliamente para etiquetar con éxito la vasculatura en colecciones intravitales19, 23, 24. Sin embargo, este enfoque no está exento de limitaciones. Por un lado, requiere manipulaciones adicionales del ratón y su utilidad se limita a experimentos a corto plazo. Para estudios longitudinales, el dextrano fluorescente puede ser problemático ya que observamos la acumulación de dextrano en las células fagocíticas o la difusión en el tejido circundante a lo largo del tiempo25. La incorporación de proteína fluorescente exógena en el modelo de ratón se ha presentado como una alternativa al dextrans fluorescente pero presenta limitaciones propias. La disponibilidad y diversidad de fluoróforos exógenos dentro de los modelos de ratón siguen siendo limitadas y costosas de crear. Además, en modelos específicos, como los modelos PDX, las manipulaciones genéticas no son deseables ni posibles. También se ha demostrado que la presencia de proteínas fluorescentes o bioluminiscentes dentro de las células se reconocen como extrañas dentro del ratón, y dentro de los modelos de ratón inmunocompetentes, esto reduce la cantidad de metástasis debido a la respuesta del sistema inmune huésped26,27. Por último, las proteínas fluorescentes exógenas o los colorantes fluorescentes utilizados para el contexto espacial o para segmentar datos posteriores a menudo ocupan rangos primos del espectro de luz que de otro modo podrían usarse para investigar las interacciones fisiológicas de interés.

El uso de la señal intrínseca de la ECM o fluorescencia endógena de las células dentro del tejido representa un medio potencial universal sin etiquetas para segmentar los datos intravitales para un análisis celular y espacial más profundo. La segunda generación armónica (SHG) se ha utilizado durante mucho tiempo para visualizar el ECM28. Con el posterior desarrollo de herramientas importantes para ayudar en la caracterización de la organización de la fibra 29,30,31, es posible caracterizar el comportamiento celular en relación con la estructura local de ECM. Además, la autofluorescencia del metabolito endógeno, NAD(P)H, proporciona otra herramienta sin etiquetas para compartimentar el microambiente tumoral in vivo. NAD(P)H fluorescencia intensamente en las células tumorales y se puede utilizar para discriminar los límites del nido tumoral en crecimiento de su estroma circundante21,32. Por último, la vasculatura es una estructura fisiológica importante en el microambiente tumoral y el sitio de interacciones clave específicas del tipo celular 33,34,35. La excitación de los glóbulos rojos (RBC) o plasma sanguíneo se ha utilizado para visualizar la vasculatura tumoral, y utilizando la excitación de dos o tres fotones (2P; 3P) se ha demostrado que la medición de las tasas de flujo sanguíneo es posible36. Sin embargo, mientras que los vasos sanguíneos más grandes son fácilmente identificables por sus firmas de fluorescencia endógena, la identificación de vasos sanguíneos pequeños sutiles, variables y menos fluorescentes requiere más experiencia. Estas dificultades inherentes dificultan la segmentación óptima de la imagen. Afortunadamente, estas fuentes de fluorescencia endógena (es decir, glóbulos rojos y plasma sanguíneo) también se pueden medir mediante imágenes de fluorescencia de por vida37, que capitalizan las propiedades fotofísicas únicas de la vasculatura y representan una adición útil a la creciente caja de herramientas intravital.

En este protocolo, se describe un flujo de trabajo para la segmentación de imágenes intravitales de cuatro dimensiones (4D) utilizando explícitamente señales intrínsecas como la fluorescencia endógena y SHG desde la adquisición hasta el análisis. Este protocolo es particularmente pertinente para estudios longitudinales a través de una ventana de imágenes mamarias donde la fluorescencia exógena puede no ser práctica o posible, como es el caso de los modelos PDX. Los principios de segmentación descritos aquí, sin embargo, son ampliamente aplicables a los usuarios intravitales que investigan la biología tumoral, el desarrollo de tejidos o incluso la fisiología normal de los tejidos. El conjunto de enfoques de análisis reportado permitirá a los usuarios diferenciar el comportamiento celular entre regiones de configuraciones de fibra de colágeno alineadas o aleatorias, comparar números o comportamientos de células que residen en regiones específicas del microambiente tumoral y mapear la vasculatura al microambiente tumoral utilizando solo señal intrínseco o sin etiquetas. Juntos, estos métodos crean un marco operativo para maximizar la profundidad de la información obtenida de las imágenes intravitales 4D de la glándula mamaria al tiempo que minimizan la necesidad de etiquetas exógenas adicionales.

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Protocol

Todos los experimentos descritos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Wisconsin-Madison. El bienestar y el manejo del dolor en todos los experimentos con animales es primordial. Por lo tanto, se hace todo lo posible para asegurarse de que el animal esté cómodo y bien cuidado en cada paso del procedimiento.

1. Generación de la ventana de imagen mamaria (MIW)

  1. Para construir la ventana de imágenes mamarias, fabrique un anillo de 14 mm de acero inoxidable de grado quirúrgico.
  2. Limpie el marco de la ventana mecanizada con una solución caliente de detergente de limpieza al 5%, enjuague durante 10 minutos con agua desionizada (DI) corriente, sumérjase en etanol al 100% durante 10 minutos y luego séquelo bajo una lámpara de calor. Autoclave el marco MIW seco y guárdelo para su uso posterior.
  3. Prepare el vidrio de la cubierta MIW de la siguiente manera: Remoje el vidrio de la cubierta redonda # 1.5 de 12 mm en etanol al 100% durante 10 minutos, seque bajo una lámpara de calor y luego asegúrelo al marco MIW de metal con adhesivo de cianoacrilato. Curar el adhesivo durante la noche.
  4. Limpie el MIW ensamblado del exceso de adhesivo con un hisopo empapado de acetona y límpielo sumergiéndolo en etanol al 70% durante 10 minutos. Deje que la ventana limpia se seque. Prepare el MIW con anticipación y guárdelo en una placa de Petri estéril antes de la implantación quirúrgica.

2. Implantación quirúrgica del MIW

  1. Herramientas quirúrgicas en autoclave y desinfecte las superficies con etanol al 70% antes de comenzar la cirugía para la implantación de la ventana.
  2. Realice la cirugía en una mesa desinfectada con una manta de calentamiento cubierta con un campo estéril. Coloque la manta de calentamiento de tal manera que la temperatura medida en la parte superior del campo estéril sea de 40 ° C.
  3. Use iluminación fría auxiliar para ayudar a prevenir el secado de los tejidos. Use lupas para facilitar el procedimiento quirúrgico. Use EPP que consista en una bata de laboratorio estéril de un solo uso, mangas quirúrgicas, guantes, protección ocular y máscara facial según lo recomendado por las mejores prácticas quirúrgicas.
  4. Anestesiar al ratón utilizando una máquina vaporizadora de anestesia con un ajuste de isoflurano de 2.0% y un caudal de oxígeno de 2.0 L/min. Administrar analgésico (10 mg/kg de meloxicam) mediante inyección subcutánea.
    NOTA: Proporcione dosis adicionales dentro de las primeras 24 h, preferiblemente cada 8-12 h durante los primeros 2 días después de la cirugía.
  5. Una vez anestesiado (confirmado por la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie), aplique un gel hidratante para los ojos para evitar el secado de los ojos. Use una crema depilatoria para eliminar el pelaje en el sitio de la cirugía (4ª glándula mamaria inguinal) seguido de enjuague con una gasa estéril empapada en agua.
  6. Prepare el sitio quirúrgico depilado para la cirugía desinfectando la superficie de la piel con 3 exfoliantes alternativos de betadina y etanol.
  7. Para comenzar la cirugía, levante suavemente la piel sobre la 4ª glándula mamaria número 4 con fórceps. Una vez que la piel se aleje de la pared del cuerpo, retire una sección de ~ 1 mm de la capa dérmica en la punta de los fórceps con microcijeras quirúrgicas. Si se produce sangrado, aplique una presión suave con una gasa estéril hasta que el sangrado se detenga.
    NOTA: En general, los tumores más grandes tienen un mayor potencial de sangrado que los tumores más pequeños o los tejidos normales.
  8. Separe la glándula mamaria de la capa dérmica con movimientos suaves de los fórceps en la abertura quirúrgica para evitar cortar la glándula subyacente.
  9. Cree una incisión de 10 mm y libere la glándula mamaria de la capa dérmica en la periferia para que las suturas se puedan colocar sin penetrar en la glándula mamaria. Agregue PBS para cubrir la glándula/tumor expuesto y para evitar el secado.
  10. Cree una sutura de cuerda de bolso a lo largo de la periferia de la abertura usando una sutura trenzada de seda 5-0. Inserte un borde del MIW para que la capa dérmica se enganche en la muesca receptora del MIW.
  11. Estire suavemente el epitelio en el lado opuesto del MIW y empuje el MIW metálico en su lugar de tal manera que la capa dérmica enganche completamente la muesca receptora alrededor de toda la circunferencia miW. Apriete la cuerda del bolso para dibujar la capa dérmica en la muesca y átela para asegurar completamente el MIW.
  12. Agregue un antibiótico tópico a la capa dérmica en el MIW y monitoree continuamente al ratón hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la reclinación esternal. Coloque el ratón implantado por MIW por separado en una cama blanda con un iglú colocado en la jaula y permita que el ratón se recupere durante 48 horas antes de la toma de imágenes.

3. Posicionamiento y mantenimiento del ratón en la etapa del microscopio para la obtención de imágenes

  1. Configure la cámara de calentamiento en el escenario del microscopio. Utilice un sistema de aire forzado ajustado a 30 °C o cualquier otro sistema similar. Use un calentador objetivo para evitar la deriva en el enfoque z. Permita que el sistema llegue al equilibrio durante al menos 1 h antes de la toma de imágenes.
    NOTA: Los ratones anestesiados son incapaces de mantener adecuadamente su temperatura corporal y, por lo tanto, es necesario tener un ambiente calentado para cualquier adquisición de lapso de tiempo. El calentador objetivo ayuda a combatir los efectos de la expansión térmica, un fenómeno que causa la deriva en el enfoque z a medida que la lente objetivo y el tejido que se visualiza llegan al equilibrio térmico.
  2. Una vez que la cámara de calentamiento del microscopio se haya estabilizado a 30 °C, anestesiar al ratón receptor con ajustes de la máquina de anestesia de 2% de isoflurano y un caudal de oxígeno de 2 L/min.
  3. Después de sedar al ratón (confirmado por la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie), limpie el exterior del vidrio MIW con un aplicador de algodón y un limpiador de vidrio, agregue ungüento para los ojos para evitar el secado e inserte un catéter de vena de la cola si es necesario.
  4. Para mantener una hidratación adecuada, administre una inyección inicial de 0,5 ml de PBS por vía subcutánea o 100 μL a través del catéter de la vena de la cola. Repetir cada 2 h durante la duración de la sesión de imagen.
  5. Una vez que el ratón se haya preparado correctamente, configure el microscopio para obtener imágenes. Para reducir la evaporación durante las mediciones de lapso de tiempo, use un gel a base de agua en lugar de agua para el medio de inmersión. Esto debe hacerse antes de colocar el mouse en el escenario. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles de los componentes ópticos.
  6. Coloque el ratón en el escenario del microscopio, ajuste la manguera de isoflurano y presione el collar del MIW en un orificio de recepción de 14 mm en el inserto del escenario para estabilizar las imágenes. Enfoque el campo de imágenes utilizando los oculares del microscopio y use iluminación de campo brillante para observar la vasculatura con el flujo sanguíneo.
  7. Compruebe la estabilidad del campo de visión. Si hay artefactos de movimiento respiratorio, aplique una compresión suave en la parte posterior de la glándula con un pequeño bloque de espuma y un trozo de cinta adhesiva similar a una cintura. Después de aplicar la compresión, verifique que el flujo sanguíneo se mantenga en todo el campo de visión.
  8. Ajuste periódicamente los niveles de isoflurano en incrementos del 0,25% durante la sesión de imágenes para mantener un nivel adecuado de sedación contando manualmente la respiración animal.
  9. Mantenga una tasa de 36-40 respiraciones por minuto (rpm) para mejorar la longevidad animal y las imágenes ópticas. Las tasas de respiración más bajas pueden hacer que el ratón no sobreviva al experimento, mientras que las tasas de respiración superiores a 60 rpm pueden resultar en una sedación deficiente, lo que puede aumentar la respiración y los artefactos de movimiento en los datos de la imagen.

4. Configuración para imágenes intravitales 4D, basadas en intensidad y sin etiquetas del comportamiento dinámico de las células

  1. Una vez que el ratón esté sedado y colocado de forma segura en la etapa de microscopio invertido, comience a localizar las regiones de interés.
  2. Usando una fuente de luz dirigida al MIW, use los oculares del microscopio para identificar áreas potenciales para la investigación. Agregue y guarde las posiciones x, y en el software para volver a estas posiciones.
    NOTA: Los detalles finos del tumor no serán fácilmente visibles con este tipo de iluminación. El objetivo es simplemente identificar regiones para una mayor investigación. La atención se centra en ver la vasculatura y el flujo sanguíneo.
  3. Después de guardar varias posiciones en el software, obtenga una vista previa de los campos de visión elegidos utilizando la excitación de 890 nm y el cubo de filtro FAD / SHG. Utilice un tiempo máximo de permanencia de 4 μs con menor potencia y alto ajuste de PMT. El objetivo es obtener una vista previa de los campos de visión sin sobreexponer el tejido a una luz láser excesiva.
  4. Una vez que se hayan establecido los niveles de potencia adecuados, configure las pilas z. Observe la aparición de abundantes fibras de colágeno (SHG) a 20-50 μm debajo de la superficie de vidrio del MIW. El colágeno se volverá menos prevalente a medida que el microscopio se seccione más profundamente en el tumor (Figura 1B). Los vacíos en el SHG revelan la ubicación de las masas tumorales.
  5. Coloque la rebanada z superior, debajo de la capa de células solitarias donde aparecen las primeras fibras de colágeno a ~ 50-100 μm. Establezca la rebanada z inferior en ~ 250 μm, donde las fibras se desvanecen y la señal pobre domina. Repita esto para todas las posiciones x-y guardadas.
  6. Una vez que se establece el rango z-stack, aumente el tiempo de permanencia (hasta 8 μs) y optimice la configuración de potencia y detector. Optimice los niveles de potencia según sea necesario para excitar el tejido para cada experimento. El uso de potencias de hasta 90 mW a 750 nm o 70 mW a 890 nm en la apertura posterior del objetivo está dentro de un rango aceptable.
    NOTA: La profundidad de la imagen, la cantidad de dispersión dentro del tejido, las características objetivas y la sensibilidad del detector afectarán significativamente la cantidad de energía necesaria para obtener una imagen.
  7. Ajuste los intervalos de tiempo de acuerdo con los objetivos experimentales. Comience con intervalos de 10 minutos entre los puntos de recolección para la mayoría de las películas de migración intravital.
  8. A pesar de que la excitación 2P es suave para las células y los tejidos, tenga en cuenta los signos de fototoxicidad, como el sangrado celular o el rápido aumento de la autofluorescencia, y el fotoblanqueo excesivo. Reduzca la potencia del láser o aumente los intervalos de lapso de tiempo según lo indiquen las condiciones.

5. Imágenes de por vida de fluorescencia (FLIM) de NAD(P)H

  1. Mientras conserva las posiciones x-y de las adquisiciones de lapso de tiempo, configure el microscopio para recolectar una pila FLIM. Inserte un filtro 440/80 en un soporte de filtro frente al detector GaAsP y ajuste el voltaje del detector GaAsP a 800 en el software. Apague las luces de la habitación cuando los detectores estén encendidos.
  2. En el software, cambie de la imagen de intensidad basada en galvanómetro a un modo de imagen FLIM.
  3. Con el fin de identificar y enmascarar la vasculatura, establezca la resolución en 512 x 512 píxeles. Para recopilar información metabólica complementaria, establezca la resolución en 256 x 256 píxeles para aumentar la resolución temporal de la firma de por vida. Ajuste el tiempo de permanencia a 4 μs y ajuste el láser a 750 nm.
  4. Inicie el escaneo de vista previa y comience a ajustar la potencia del láser. Ajuste la potencia del láser hasta que la lectura para el discriminador de fracción constante (CFD) esté entre 1 x 105 y 1 x 106. No exceda 1 x 106 , ya que esto dará como resultado la acumulación de fotones y malos resultados generales.
  5. Una vez establecido el nivel de potencia, establezca el tiempo de integración entre 90 s y 120 s e inicie la colección FLIM. Adquirirá fotones del campo de visión durante el tiempo asignado.
  6. Opcional: Después de que se hayan realizado todas las colecciones necesarias y se haya retirado el ratón del escenario, recoja una función de respuesta del instrumento (IRF). Mida el IRF mediante la obtención de imágenes de la superficie de los cristales de urea disponibles comercialmente en un plato con fondo de vidrio con los mismos parámetros y la configuración utilizada para obtener imágenes del tejido.
    NOTA: El IRF tiene en cuenta cualquier retraso o reflexión debido a la configuración electrónica u óptica. El IRF está involucrado en todas las adquisiciones de FLIM, y desconvolverlo a partir de los datos puede mejorar la precisión de las curvas de desintegración de fluorescencia calculadas. Dicho esto, los IRF calculados a menudo pueden replicar razonablemente la calidad de las curvas de desintegración de fluorescencia a partir de IRF medidos. Es una buena práctica medir el IRF hasta que se haya determinado que el IRF calculado producirá ajustes equivalentes de las curvas de desintegración y se aproximará adecuadamente a los resultados del IRF medido.

6. Análisis de imágenes NADH Lifetime

  1. Abra el software FLIM e importe la imagen de por vida NAD(P)H desde el conjunto de datos. Para obtener más detalles sobre cómo utilizar correctamente el software, consulte los manuales de vida útil de los fluorescentes (consulte la Tabla de materiales).
  2. Para comenzar, defina los parámetros del modelo en el software. En la barra de menús, haga clic en Opciones > modelo. Seleccione las siguientes casillas: Configuración > decaimiento multiexponencial, Método de ajuste > MLE, Agrupación espacial > cuadrado, Umbral > pico y marque Corregir desplazamiento antes de calcular la imagen.
  3. En la barra de menús, haga clic en Color > A1% en el menú desplegable. En el lado derecho de la ventana, defínalo como un ajuste de tres componentes. Establezca el tamaño de la > 3.
  4. Ajuste el umbral > ~10. Vuelva a evaluar la precisión del umbral después de que se haya calculado la matriz de desintegración por primera vez.
  5. Fijar el τ1 a 200 ps. Esto representa la corta vida útil de los glóbulos rojos. Trate de encontrar el valor que mejor coincida con múltiples puntos en el vaso sanguíneo más grande, que se puede ver en la imagen de intensidad. Fijar el τ2 a 1200 ps. Esto representa la larga vida útil de los glóbulos rojos.
    NOTA: Los valores establecidos son solo el punto de partida. Los valores deberán optimizarse para resaltar más la vasculatura. En la mayoría de los casos, pero no siempre, estos valores disminuirán.
  6. En Calcular en la barra de menús, seleccione Matriz de decaimiento. Esto generará una primera A1% de imágenes de por vida con la vasculatura teniendo valores altos. Use el cursor (punto de mira) para pasar el cursor sobre la vasculatura. Sistemáticamente y uno a la vez, flote (desmarque la casilla Fijar ) el τ1 y el τ2. Registre estos valores, ya que ayudarán a optimizar los parámetros fijos.
    NOTA: El objetivo no es necesariamente obtener los valores más precisos en la imagen, sino más bien maximizar la disparidad entre la vasculatura y el tejido sin disminuir drásticamente el área identificada como vasculatura.
  7. Una vez identificados los parámetros apropiados para τ1 y τ2, en la barra de menús seleccione Calcular > procesamiento por lotes. Asegúrese de que la mayoría de los ajustes sean similares entre los segmentos z.
  8. Asegúrese de verificar que no haya una configuración muy diferente a las demás. Si es así, ajuste el cambio primero e inténtelo de nuevo. Si el problema persiste, vuelva a ajustar con nuevos parámetros. Un cambio incorrecto puede ser una gran causa de ruido en los ataques y puede aumentar los valores de A1% en las regiones tumorales adyacentes.
  9. En la pestaña de menú, guarde los archivos y luego exporte los archivos A1%. Cargue estos archivos en ImageJ para enmascarar y segmentar.

7. Segmentación de la imagen de la vasculatura

  1. Abra ImageJ e importe la imagen A1% como una imagen de texto. Repita esto para todas las imágenes dentro de la pila.
  2. Con todas las imágenes de A1% abiertas, seleccione Image > Stack > Z-Project. Utilice la proyección de intensidad máxima y guarde las imágenes. Consulte Datos complementarios 1 para obtener una imagen representativa.
  3. Vaya a Plugins > Segmentación. Seleccione el plugin de segmentación WEKA entrenable38.
  4. Una vez que se abra la ventana WEKA, use la configuración predeterminada y comience a entrenar el software creando dos clases y líneas de rastreo sobre la vasculatura (regiones altas A1%) y no vasculatura (regiones bajas A1%).
  5. Continúe agregando nuevos rastros a las dos clases hasta que el software identifique consistentemente las regiones altas de A1% de la vasculatura mientras elimina cualquier región más alta de ruido de fondo. Consulte Modelo suplementario para el modelo de clasificador representativo.
  6. Una vez que se produce la imagen clasificada, haga clic en Imagen > Tipo > 8 Bits. Umbral de la imagen y crear una máscara. Si la imagen con umbral aún necesita limpiarse más, utilice la función Analizar partículas .
  7. Ajuste el tamaño y la circularidad hasta que se excluyan las regiones más pequeñas y circulares de la imagen umbralizada. Se obtiene una máscara limpia con solo la vasculatura y muy poco fondo.
  8. Haga clic en Editar > selección > Crear selección. Transfiera la selección al administrador de ROI haciendo clic en Analizar herramientas de > > administrador de ROI.
  9. Duplicar la imagen clasificada. Proceda a Procesar > binario. Para expandir la máscara y definir la distancia desde la vasculatura que se incluirá en la segmentación de la imagen, seleccione Dilatar. Repita hasta que la máscara se haya expandido al rango deseado. Registre esta región de interés (ROI) en el administrador de ROI.
    NOTA: El objetivo de este paso es cuantificar la cantidad o el comportamiento dentro de una cierta proximidad del vaso sanguíneo (por ejemplo, el número de células presentes dentro de X μm de los vasos sanguíneos). La cantidad de dilatación requerida está totalmente determinada por la cuestión científica.
  10. Para cuantificar el número de celdas dentro de las regiones restrictivas, seleccione la ventana (imagen/canal) de interés. Esta puede ser cualquier ventana que comparta el mismo campo de visión que la máscara vascular. Aplique ambos ROI utilizando la función XOR del menú desplegable.
    NOTA: Esta operación medirá los elementos dentro de la distancia deseada de la vasculatura, excluyendo la vasculatura en sí. Este enfoque combinado de ROI se puede utilizar para medir una multitud de parámetros, como la intensidad, el número de células o la migración.

8. Segmentación de la imagen del nido tumoral

  1. Abra la imagen NADH desde un escaneo de alta resolución de intensidad o una colección FLIM en ImageJ.
    NOTA: Esto se puede hacer en cortes z individuales, pilas completas o aplicarse a proyecciones z de algunos segmentos.
  2. Vaya a Plugins > Segmentación. Seleccione el plugin de segmentación WEKA entrenable.
  3. Una vez que se abra la ventana WEKA, use la configuración predeterminada y comience a entrenar el software en dos clases de regiones altas de NADH y regiones bajas de NADH. Las regiones altas de NADH tendrán un patrón muy discernible de células con núcleos y el software lo identificará fácilmente.
  4. Continúe alternando hacia adelante y hacia atrás con la superposición para refinar el algoritmo con entrenamiento adicional hasta que reconozca todas las regiones del tumor según lo determinado por el ojo y el conocimiento previo de la morfología del tumor. Este es un proceso iterativo.
  5. Una vez que el algoritmo reconozca todas las regiones del tumor, seleccione el botón Crear resultado . Esto producirá una nueva imagen. Duplica esta imagen.
  6. Seleccione la primera imagen duplicada y conviértala en una imagen de 8 bits seleccionando Tipo de > de imagen > 8 bits. Umbral de esta imagen para crear una máscara binaria. Luego cree una selección y transfiérala al administrador de ROI. Estos ROI definirán el estroma.
  7. Seleccione el segundo de la imagen duplicada y conviértalo en una imagen de 8 bits. Invierta esta imagen seleccionando Imagen > Editar > Invertir y, a continuación, umbral esta imagen para crear una máscara binaria. Una vez más, cree una selección y transfiérala al administrador de ROI. Este ROI definirá el nido tumoral.

9. Segmentación de imágenes por organización o alineación de fibras

  1. Para comenzar, abra las imágenes SHG, prepare cualquier proyección z y evalúe la necesidad de cualquier preprocesamiento. Para obtener buenos resultados, se requieren imágenes de alta calidad con fibras discernibles y bajo nivel de ruido.
  2. Opcional: Para el preprocesamiento en ImageJ para aumentar la señal a ruido (SNR) del canal SHG, reste el fondo mediante una sustracción de bola rodante. Para la mayoría de las aplicaciones, use una resta de bola rodante entre 20 píxeles y 50 píxeles. A continuación, suaviza la imagen y guárdala.
  3. Abra el complemento OrientationJ y establezca los parámetros de procesamiento. En la ventana OrientationJ, defina el tamaño de la ventana tensorial local. Para obtener una imagen de 20x de esta densidad de fibra, establezca 10 píxeles en 15 píxeles como punto de partida.
  4. Seleccione Spline cúbico como modelo de degradado y marque el cuadro De inspección de color. Defina la encuesta de color. Establezca el tono y la saturación como coherencia y, a continuación, defina el brillo como imagen original, pulse Ejecutar.
  5. El archivo de salida del plugin es RGB colormap. Ajuste el valor de la ventana tensorial local hasta que las regiones alineadas, según lo determinado por el ojo, se resalten correctamente con tonos azules y magenta.
  6. Una vez que la imagen de salida sea satisfactoria, separe esta imagen RGB en 3 canales. Seleccione Imagen > color > canal dividido.
  7. Para mejorar la apariencia de las regiones alineadas con el fin de enmascarar, utilice la calculadora de imágenes seleccionando Procesar > Calculadora de imágenes. Con este operador, reste la imagen verde de la imagen azul. Para una máscara más restrictiva, reste la imagen verde de la imagen roja. Para regiones aleatorias, reste el canal azul del canal verde.
  8. Umbral de la imagen resultante mediante el algoritmo Moments . En la mayoría de los casos, esto no debería necesitar más ajustes. Sin embargo, ajuste si es necesario. Esto producirá una imagen binaria.
  9. Una vez hecha la imagen binaria, rellene los taladros seleccionando Procesar > binario > Rellenar taladros entre fibras y redondee los límites de la máscara con un filtro mediano. Un filtro mediano de 10 es un buen punto de partida, ajústelo para que se ajuste bien a los datos. Inspeccione manualmente la máscara para ver si hay acuerdo y elimine cualquier ROI que sea erróneo.
  10. Una vez que la máscara sea satisfactoria, cree una selección seleccionando Editar > Selección > Crear selección. Transfiera esta selección al administrador de ROI.

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Representative Results

La instalación del MIW y la planificación experimental básica son los primeros pasos en este proceso. Este diseño y protocolo MIW en particular son más susceptibles a estudioslongitudinales 19 y se han utilizado con éxito con microscopios verticales e invertidos. En este caso, se utilizó un microscopio invertido, ya que ha dado como resultado una mayor estabilidad de la imagen de la glándula mamaria con menos artefactos respiratorios. En la Figura 1A, proporcionamos las dimensiones del MIW rígido y una visión general gráfica del proceso de implantación.

Un campo de visión típico dentro de un tumor mamario MMTV-PyMT39 sin etiqueta (Figura 1B-E, Figura 3A) es muy heterogéneo, compuesto por fibras de colágeno, numerosas células estromales, masas de células tumorales y vasculatura (Figura 3A). En general, las fibras de colágeno son más abundantes cerca de la ventana y disminuyen en abundancia más profundamente en el tumor (Figura 1B-E) La organización de las fibras que rodean las masas tumorales también puede ser bastante variada, a menudo con regiones de organización más aleatoria en el mismo campo de visión que las regiones de mayor alineación (Figura 2D, H y Figura 3I).

Para desarrollar una línea de análisis que pueda segmentar los datos intravitales en regiones perivasculares, tumor y estroma, este protocolo se centró en el uso de la señal de NAD(P)H endógeno y SHG. Si bien la identificación del tumor y el estroma puede ser sencilla, la identificación de las regiones perivasculares dentro del microambiente tumoral puede ser un desafío. La vasculatura a menudo reside dentro de las cintas estrechas de la señal reducida de NAD(P)H entre las masas brillantes de células cancerosas NAD(P)H+. Es importante tener en cuenta que no todos los límites oscuros albergan vasculatura; más bien, algunas regiones oscuras son simplemente pliegues tumorales o el glúteo de lóbulos tumorales adyacentes (flecha amarilla, Figura 2G). Además, mientras que un ojo experimentado puede extraer los vasos sanguíneos de mayor diámetro del tumor, ya que tienen una apariencia distintiva, esta distinción no siempre es trivial. Esto es especialmente cierto para los vasos de menor diámetro donde su apariencia puede ser más sutil y variable. En este caso, el uso de la vida útil de fluorescencia de NAD(P)H puede ayudar en la identificación positiva de la vasculatura (Figura 2B, F). La vida útil de la fluorescencia (FLIM) no mide la abundancia o intensidad de los fotones en un lugar, sino el tiempo que tardan esas moléculas excitadas en emitir un fotón y decaer a su estado fundamental. Se ha demostrado que los glóbulos rojos (RBC) y el plasma sanguíneo tienen una vida útil de fluorescencia característicamente corta y distintiva 32,37 que se puede aprovechar para la identificación y segmentación de los vasos en los tejidos.

Para determinar qué tan bien la vida útil de fluorescencia de NAD(P)H identifica la vasculatura intravitalmente, se inyectó un bolo de 100 μL de un dextrano marcado con rodamina en la vena de la cola después de recolectar la imagen FLIM. Las comparaciones de las proyecciones de intensidad máxima de NAD(P)H FLIM reflejan de cerca los vasos marcados con un dextrano marcado fluorescentemente (Figura 2I-J). La repetición de este enfoque en múltiples ratones demostró que el área promedio de la máscara de la imagen FLIM sobre el área de la máscara de dextrano fue de 78.6% ± 12.3% (Figura 2L). Si bien la superposición no fue del 100%, esta técnica mapeó con precisión toda la red vascular. Las diferencias observadas en las áreas reportadas a menudo podrían atribuirse a problemas de deriva o registro intravital, diámetros de vasos más delgados debido al ajuste del modelo o la pérdida de vasos finos debido a la exclusión de glóbulos rojos por la presión de la masa creciente. Es importante destacar que esta técnica funciona igualmente bien en presencia de fluoróforos codificados genéticamente como GFP o modelos tumorales sin etiqueta (Figura 2D, H), proporcionando así un medio muy robusto y ampliamente aplicable para identificar la vasculatura para la segmentación de imágenes.

Para delinear los límites de las masas tumorales libres de etiquetas, se utilizó la autofluorescencia NAD(P)H (Figura 1C). Esto se puede capturar recopilando de forma independiente una imagen NAD(P)H o sumando los datos NAD(P)H FLIM para generar una imagen de intensidad. Cualquiera de las dos vías permitirá una segmentación adecuada del microambiente tumoral. Como observación general, la excitación de dos fotones de NAD(P)H en células cancerosas provoca una autofluorescencia brillante que produce una imagen que muestra células individuales nítidas con núcleos oscurecidos (Figura 2E, G). Este patrón se puede utilizar para definir la extensión de la masa creciente. Si bien es posible definir el umbral simple basado en la intensidad de NAD(P)H para definir el límite del compartimento tumoral, una herramienta de segmentación entrenable a menudo funciona mejor (Figura 3B, E). Algunas otras lecturas comunes, como la migración celular o el análisis protuberante celular, pueden beneficiarse de la fluorescencia exógena codificada genéticamente dentro del modelo de ratón o la implantación de líneas celulares marcadas fluorescentemente (Figura 2A). En estos casos, la tarea de demarcar el límite de la masa se puede lograr con un umbral simple de la proteína fluorescente. A veces, la expresión del fluoróforo puede volverse bastante heterogénea después de la implantación. Esto no debería causar problemas de segmentación. Además, a menudo se ha observado que los tumores creados por aloinjertos fluorescentes o xenoinjertos tienen regiones menos compartimentadas de fibras de colágeno que los tumores creados por modelos tumorales genéticos como MMTV-PyMT16.

El compartimento estromal abarca las regiones fuera de la masa de crecimiento o entre masas de crecimiento, y se obtiene una máscara para el estroma invirtiendo el ROI del tumor (Figura 3B-F). El compartimento estromal se puede compartimentar aún más en subarodios basados en la arquitectura de fibra de colágeno. Las fibras de colágeno son una característica importante en el estroma y tienen una gran diversidad de organizaciones de fibras, que se sabe que modulan el comportamiento celular40,41. A menudo existen numerosas regiones locales (<100 μm) de fibras alineadas o aleatorias dentro de la imagen16. Por lo tanto, las regiones de organización de fibra relativamente alineadas (tonos rojos / azules) o aleatorias (tonos verdes) (Figura 3I) se identificaron con el complemento OrientationJ. Utilizando el mapa de color de coherencia OrientationJ, se pueden crear máscaras basadas en la organización de fibra local con fines de segmentación (Figura 3J). Estas máscaras se pueden superponer para analizar el comportamiento diferencial dinámico de las células estromales (Figura 3K) debido a los efectos de la organización específica de la fibra (Figura 3H, I).

Ahora que se han definido los ROI para los diversos compartimentos del microambiente tumoral, se pueden aplicar a los fotogramas o canales individuales de la película de lapso de tiempo intravital. En este punto, es importante destacar que todas las señales mostradas en la Figura 3A se derivan enteramente de fuentes endógenas. Esta imagen demuestra el rico potencial de las señales espaciales y contextuales que pueden provenir de fuentes puramente endógenas, ubicuas y libres de etiquetas. Aquí, utilizamos el modelo tumoral MMTV-PyMT como ejemplo para ilustrar la aplicabilidad del método para cuantificar el número y las características de los macrófagos dentro de ubicaciones específicas del microambiente tumoral (TME). Un estudio intravital previo42 ha demostrado que las células que emiten altos niveles de autofluorescencia FAD (Figura 3A, células magenta, flechas amarillas) se tiñen positivamente con anticuerpos F4/80 y representan una población de macrófagos dentro de la EMT. Utilizando este flujo de trabajo para segmentar la imagen, es posible examinar de manera eficiente y precisa el número, monitorear las interacciones célula-célula a lo largo del tiempo, o incluso observar las características metabólicas de este subconjunto de macrófagos (magenta) dentro de diferentes compartimentos del TME (Figura 3A, flechas amarillas). Por ejemplo, se puede caracterizar el comportamiento de los macrófagos con FAD alto que residen específicamente dentro del nido tumoral NAD(P)H-alto (Figura 3E). Del mismo modo, se pueden examinar los comportamientos de los macrófagos con respecto a la organización local de las fibras en la región del estroma. Algunos informes recientes han indicado que los macrófagos y otras células migratorias en el estroma responden a las señales mecánicas de su microambiente local 16,43,44. Utilizando las máscaras de alineación de fibra producidas por este método, es posible examinar sus comportamientos diferenciales entre regiones de organizaciones de colágeno aleatorias y alineadas. Por último, este mismo análisis enfocado también se puede aplicar para determinar el número y el comportamiento de los macrófagos localizados dentro de una proximidad definida a la vasculatura. En la Figura 3G, la vasculatura se puede ver en rojo, y los macrófagos se pueden ver una vez más en magenta. Se creó una máscara para la vasculatura utilizando NAD(P)H FLIM y luego se expandió a través de la dilatación de 10 píxeles. La distancia elegida fue arbitraria para fines de demostración, pero puede optimizarse para las necesidades particulares del experimento individual. Es importante destacar que, si bien esta imagen es de un solo corte z, este procedimiento podría extrapolarse fácilmente a pilas 3D para observar el comportamiento alrededor de todo el volumen del recipiente.

Figure 1
Figura 1: Resumen gráfico de la implantación de la ventana mamaria y la organización subyacente de un tumor MMTV-PyMT. (A) Las dimensiones de la ventana de imágenes mamarias y el esquema para el proceso general de implantación. (B-E) Este es un montaje de un representante tumoral MMTV-PyMT sin etiquetar a partir de 50 μm debajo de la superficie del MIW y continuando hasta una profundidad de 80 μm. Los valores de profundidad se proporcionan debajo de cada imagen. Las fibras de colágeno (gris) son más prevalentes en la superficie del tumor (NAD(P)H, azul) que en mayores profundidades. Barra de escala 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Imagen intravital representativa de un tumor PyMT marcado y sin etiqueta GFP y validación de NAD(P)H FLIM como marcador para la vasculatura. Una imagen compuesta (A) de un aloinjerto típico de células GFP-4T1 en la almohadilla de grasa mamaria y un tumor mamario representativo de un modelo de tumor MMTV-PyMT (E). NAD(P)H FLIM mapea la vasculatura en ambos modelos (B,F). Se utilizaron la fluorescencia GFP (C) y la autofluorescencia NAD(P)H (G) para identificar el tumor. El colágeno fue visualizado por SHG (D,H). Se validó una imagen compuesta utilizando NAD(P)H FLIM para identificar la vasculatura comparando las proyecciones de máxima intensidad de la pila intravital antes y después de la inyección de dextrano fluorescente en la vena de la cola (I, J, K). La cuantificación de la relación del área determinada por NAD(P)H FLIM sobre el área identificada por inyección de dextrano en cuatro ratones (el color identifica ratones individuales) y múltiples campos de visión (puntos individuales en el gráfico) se muestra en (L). Barras de escala 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Segmentación representativa de imágenes utilizando fluorescencia endógena dentro del tumor PyMT libre de etiquetas. Se recogió una imagen compuesta (A) de una sola rebanada z de un tumor mamario PyMT típico utilizando solo señales intrínsecas. SHG (gris) visualiza las fibras de colágeno del tumor. Las imágenes de fluorescencia de por vida de la autofluorescencia NAD(P)H (media Tau (τ)) informan las firmas metabólicas de las células (tonos verdes a naranjas) y la ubicación de los vasos sanguíneos (rojo). La autofluorescencia FAD (magenta) identifica a los macrófagos. Utilizando el esquema de segmentación descrito en este protocolo, el tumor libre de etiqueta se segmentó en compartimentos para el nido tumoral (B, E), el estroma (C, F) y la vasculatura (D, G) utilizando solo la autofluorescencia SHG y NAD (P) H. Las fibras de estroma y colágeno (H) también se pueden clasificar en regiones locales de fibras alineadas ((mostradas en magenta /azul), J, K). Barras de escala 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Datos suplementarios 1: Conjunto de datos representativos de Aajustado 1% de NAD(P)H FLIM. Esta es una proyección de intensidad máxima de unA ajustado 1% de un conjunto de datos típico. Es un representante de la calidad de identificación posible y un nivel típico de antecedentes antes de usar el clasificador entrenable. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Modelo Suplementario: Clasificador representativo utilizado en el Aajustado al 1% para la identificación de la vasculatura. Este es un modelo de clasificador de muestra para su uso en el complemento de segmentación WEKA entrenable dentro de ImageJ. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

La imagen intravital 4D es una herramienta poderosa para investigar interacciones fisiológicas dinámicas dentro del contexto espacial y temporal del microambiente tumoral nativo. Este manuscrito proporciona un marco operativo muy básico y adaptable para compartimentar las interacciones celulares dinámicas dentro de la masa tumoral, el estroma adyacente o dentro de la proximidad a la red vascular utilizando solo señales endógenas de segunda generación armónica o autofluorescencia NAD(P)H. Este protocolo proporciona un método integral paso a paso desde la implantación de la ventana de imágenes hasta la adquisición, el análisis y la segmentación de imágenes. Creemos que esta técnica contribuirá a un marco de análisis necesario para segmentar y cuantificar los datos intravitales 4D.

Este protocolo fue desarrollado para ser ampliamente compatible con numerosos modelos de ratón intravital, incluidos los modelos PDX sin etiquetar. Los PDX son un modelo45 increíblemente informativo, pero plantean un desafío para las imágenes intravitales porque la naturaleza del modelo PDX no es adecuada para la manipulación genética. Por lo tanto, sería bastante ventajoso tener un método que pueda visualizar y compartimentar las interacciones dinámicas dentro de su entorno fisiológico no etiquetado utilizando únicamente metabolitos endógenos como NAD(P)H y segunda generación armónica (SHG). Además de ser ventajoso para los modelos PDX, este enfoque multidimensional podría aplicarse teóricamente a cualquier estudio intravital en tejido canceroso o normal que necesite un contexto espacial y estructural para abordar una cuestión fisiológica. La autofluorescencia NAD(P)H y el SHG de las fibras de colágeno son omnipresentes en todos los tejidos y representan un recurso universal y gratuito en las colecciones intravitales. Este enfoque FLIM también es robusto, ya que puede identificar la vasculatura en presencia de fluorescencia de fuentes exógenas como GFP. Este enfoque también es ventajoso porque la emisión de SHG y NAD(P)H se puede visualizar en el espectro azul, residiendo así en una longitud de onda que no se utiliza típicamente en las imágenes de construcciones de fusión fluorescente que de otro modo podrían ser necesarias para el estudio.

El aspecto de este enfoque que es novedoso y tiene un valor añadido particular es la identificación sin etiquetas de la vasculatura. Si bien otros enfoques pueden funcionar, el uso de la vida útil de fluorescencia de NAD(P)H proporciona fácilmente una firma clara sin la necesidad de un etiquetado adicional. Los datos muestran que los vasos definidos de por vida reflejan la vasculatura marcada por la inyección de dextrano fluorescente en la vena de la cola, el estándar de oro para las imágenes de vasculatura. Nuestra técnica sobresale en la visualización de vasos sanguíneos más pequeños en comparación con la excitación simple de dos o tres fotones, donde los vasos más grandes se visualizan fácilmente, pero los más pequeños requieren más experiencia para identificarse. La firma de por vida es inequívoca para todos los buques, independientemente de su tamaño. Además, esta adquisición adicional de NAD(P)H FLIM se puede combinar fácilmente con otros marcadores para la segmentación del microambiente tumoral. A través de una sola adquisición FLIM de NAD(P)H, los requisitos para definir la vasculatura, el nido tumoral y el estroma son alcanzables. La colección FLIM se puede incorporar al diseño experimental existente recopilando una sola adquisición al final o al comienzo de una serie temporal o intercalando las colecciones a lo largo de toda la adquisición 4D. La determinación de la cantidad adecuada de imágenes FLIM dependerá de las necesidades y restricciones experimentales específicas, como los intervalos de adquisición, la duración experimental o la estabilidad de la imagen, pero como mínimo, se necesitará una colección FLIM por serie 4D para este método.

Este proceso de utilizar NAD(P)H FLIM para la identificación de la vasculatura requiere ajustar matemáticamente los datos de FLIM a una función exponencial de la forma

Equation 1

con A1+A2+A3=1. Mientras que la mayoría de las imágenes de por vida de NAD(P)H reportadas en la literatura se ajustan como bi-exponenciales, en esta aplicación NAD(P)H se ajustó como un tri-exponencial donde el τ1 y τ2 se establecen en los valores reportados de RBC y τ3 se permite flotar. Es importante destacar que el objetivo no es lograr el valor de vida útil más preciso, sino más bien proporcionar una imagen óptima para la segmentación. Cuando los valores de τ1 y τ2 se fijan inicialmente en los valores reportados de32,46 de rbC y se calcula la matriz, los vasos sanguíneos se destacarán con valores de A1% superiores al 60% en los vasos sanguíneos y valores de A1% generalmente inferiores al 40% en el tumor adyacente. El siguiente paso es tratar de maximizar el A1% en los vasos sanguíneos mientras se minimiza el A1% en el tumor adyacente. Este es un proceso iterativo, y al final del mismo, los valores A1% de los vasos sanguíneos serán mayores que 90% con los valores A1% del tumor menos del 10%. Una vez que los valores de A1% de los vasos sanguíneos sean uniformemente altos y el fondo sea uniformemente bajo, exporte estos archivos A1% a una herramienta de segmentación entrenable. Esto eliminará rápidamente cualquier ruido restante y definirá el ROI para la vasculatura.

Como la almohadilla de grasa mamaria se encuentra fuera de la cavidad corporal, la cirugía es mínimamente invasiva y los mejores resultados se obtienen implantando el MIW sobre la4ª glándula mamaria inguinal. El momento de la implantación de la ventana y cuándo se llevará a cabo el experimento es crítico. Es mejor permitir 24 - 48 h de curación después de la cirugía antes del punto de tiempo fisiológico que se investigará. Si bien el procedimiento en sí solo requiere una pequeña incisión (≈ 10 mm) para insertar la ventana (Figura 1A), el tiempo de curación posterior a la cirugía permitirá que se eliminen cualquier inflamación y líquidos que se acumularon debido al proceso de implantación. Además, también permitirá que el tumor continúe creciendo en la ventana. Ambos factores mejorarán la calidad general de la imagen al disminuir la opacidad / dispersión y aumentar la estabilidad de la imagen. Lo siguiente a considerar es la duración total planificada del experimento. Si bien estas ventanas fueron diseñadas para estudios longitudinales, la naturaleza rígida de la ventana incurre en un límite de tiempo de 2 a 3 semanas. Después de ese lapso de tiempo, la ventana tiene una tendencia a desprenderse de la capa dérmica, contaminando y terminando así el experimento. Si no se requiere un estudio longitudinal de la glándula mamaria, otros métodos intravitales como un procedimiento de colgajo cutáneo terminal22 que elimina la implantación quirúrgica de un MIW pueden ser una mejor opción. El procedimiento de colgajo de piel proporciona un mejor acceso a toda la glándula, ya que no está limitada por la colocación y las dimensiones del MIW, y puede producir una mayor estabilidad de la imagen a medida que la glándula se aleja de la cavidad corporal. Independientemente del enfoque de imágenes intravitales, la segmentación del microambiente utilizando fluorescencia endógena sigue siendo ampliamente aplicable para el análisis posterior de imágenes. Lo último a considerar es la duración del experimento de imágenes individual. No es irrazonable adquirir películas que duran 6-8 h. Sin embargo, durante las colecciones más largas, la hidratación se convierte en un problema y se requiere un monitoreo cercano de la salud del ratón.

Una ventaja significativa de este método es que las diversas imágenes de fluorescencia endógena requeridas para la segmentación del microambiente tumoral se pueden recolectar con relativa facilidad y sin manipulaciones adicionales para el ratón. Con la combinación filtro/dicroico que se informa aquí (Tabla de materiales), las imágenes SHG y NADH se pueden adquirir con el mismo conjunto de filtros cambiando las longitudes de onda de 890 nm a 750 nm. Si bien esto crea un retraso en la adquisición, no afecta la segmentación posterior de la imagen. También es importante recordar que este método representa un mero punto de partida para una técnica de segmentación que utiliza fluorescencia endógena, y las configuraciones ópticas más avanzadas pueden permitir adquisiciones simultáneas si es necesario.

Existen limitaciones en el uso de FLIM para identificar la vasculatura. El enfoque FLIM requiere electrónica especializada, instrumentación y experiencia para recopilar. Sin embargo, todos estos requisitos están cada vez más integrados en los microscopios modernos y más disponibles a través del uso de instalaciones centrales de imágenes. FLIM se ha convertido en una tecnología madura y adquirir buenos datos no requiere mucha capacitación. Una segunda limitación es que las adquisiciones de FLIM consumen mucho tiempo. Si bien la velocidad de fotogramas para una imagen recolectada con dextrano fluorescente es de aproximadamente un segundo o menos, la colección promedio de FLIM puede variar de 60 s a 120 s, lo que puede ser prohibitivo si los puntos de tiempo fisiológicos son más cortos que eso. La identificación FLIM de la vasculatura no está destinada a reemplazar todo el dextrano fluorescente inyectado en la vena de la cola o la excitación multifotónica de la vasculatura; más bien, es otro enfoque en la creciente caja de herramientas para imágenes intravitales. Además, anticipamos que los tiempos de adquisición más largos se harán dramáticamente más cortos en los próximos años. Los detectores y la electrónica están mejorando rápidamente, disminuyendo el tiempo muerto del detector y, por lo tanto, requiriendo períodos de adquisición más cortos para capturar el mismo número de fotones. Otra razón para ser optimista de tiempos de adquisición más cortos es la aparición de software de aprendizaje automático o algoritmo de restauración de imágenes como CSBDeep47. Estos algoritmos podrían ser entrenados para trabajar con tiempos de exposición más cortos, reduciendo así el número de fotones necesarios para identificar con precisión las estructuras con fines de segmentación. En conjunto, esto podría reducir rápidamente los plazos necesarios para estas adquisiciones multidimensionales.

El uso de imágenes intravitales solo será más importante a medida que los investigadores intenten desentrañar las muchas interacciones complejas célula-célula y célula-matriz que ocurren dentro del microambiente fisiológico del tumor. Por lo tanto, se necesitan desarrollos continuos en las capacidades de adquisición, segmentación y análisis. Con este fin, es importante no pasar por alto el potencial de la fluorescencia endógena para la segmentación del microambiente. En este protocolo, la señal endógena de los metabolitos SHG y de fluorescencia, incluida la intensidad de NAD(P)H y FLIM, se utilizó con fines de segmentación durante la imagen intravital de la EMT mamaria. Otros metabolitos endógenos o propiedades intrínsecas pueden proporcionar señales adicionales para revelar la reciprocidad dinámica de las células tumorales y el microambiente. Por ejemplo, FAD se puede utilizar para monitorear el movimiento de las poblaciones inmunes42, la generación 3P puede resaltar características estructurales como membranas plasmáticas o adiposas36, y la fluorescencia de elastina se puede usar para separar las arterias de las venas46. Por lo tanto, la fluorescencia endógena continuará proporcionando una rica plataforma multidimensional que debe utilizarse al máximo a medida que la comunidad de investigación continúa construyendo la caja de herramientas para la segmentación y el análisis del microambiente intravital.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer las subvenciones del NCI R01 CA216248, CA206458 y CA179556 por financiar este trabajo. También nos gustaría agradecer al Dr. Kevin Eliceiri y su grupo de imágenes por su experiencia técnica en el desarrollo temprano de nuestro programa intravital. También agradecemos al Dr. Ben Cox y a otros miembros del Grupo de Fabricación Eliceiri en el Instituto Morgridge de Investigación por su diseño técnico esencial durante las primeras fases del MIW. Ellen Dobson ayudó con conversaciones útiles sobre la herramienta de segmentación WEKA entrenable ImageJ. Además, nos gustaría agradecer a la Dra. Melissa Skala y a la Dra. Alexa Barres-Heaton por el uso oportuno de su microscopio. Por último, nos gustaría agradecer a la Dra. Brigitte Raabe, D.V.M, por todas las discusiones reflexivas y consejos sobre nuestro manejo y cuidado del ratón.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#1.5 12mm round cover glass Warner Instruments # 64-0712 MIW construction
1.0 mL syringe for SQ injection BD 309659 Syringe
20x objective Zeiss 421452-988 Water immersion
27G needle for SQ injection Covidien 1188827012 Needle
40x objective Nikon MRD77410 Water immersion
5-0 silk braided suture Ethicon K870 Suture for MIW implantation
Artificial tears gel Akorn NDC 59399-162-35 Eye gel
Betadine solution, 5% Fisher Scientific NC1558063 Surgery antiseptic
cotton-tipped applicator Fisher Scientific 23-400-101
Cyanoacrylate adhesive Loctite 1365882 MIW construction
fluorescent dextran Sigma T1287-50mg intravenous labelling of vasculature
forceps Mckesson.com Miltex #18-782 stainless, 4 inch, curved
GaAsP photomultiplier tube Hamamatsu 
heating blanket CARA 72 heating pad  038056000729 Temperature selectable
heating chamber home built
Fluorescent lifetime handbook Becker and Hickl https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks
inverted microscope base Nikon
Isoflurane Akorn NDC 59399-106-01 Anesthesia
Liqui-Nox Fisher Scientific 16-000-125 MIW cleaning
Meloxicam Norbrook NDC 55529-040-10 Analgesic
Micro Hose Scientific Commodities INC.  BB31695-PE/1
multiphoton scan head Bruker Ultima II Multiphoton scanhead and imaging platform
NADH FLIM filter Chroma 284994 ET 440/80 m-2P
Nair CVS 339826 Depilatory cream
objective heater Tokai Hit STRG-WELSX-SET
SHG/FAD filter Chroma 320740 ET450/40m-2P
Sparkle glass cleaner Amazon.com B00814ME24 Glass Cleaner for implanted MIW
SPC-150 photon counting board Becker and Hickl
surgical light FAJ B06XV1VQVZ Magnetic LED gooseneck light
surgical micro-scissors Excelta 366 stainless, 3 inch
Triple antibiotic ointment Actavis Pharma NDC 0472-0179-34 Antibiotic
TV catheter Custom BD 30G needle: 305106 Catheter for TV injection
Two photon filter Chroma 320282 ET585/65m-2P
two-photon laser Coherent charmeleon Tunable multiphoton laser
ultrasound gel Parker PKR-03-02 Water immersion gel
Urea crystals Sigma U5128-5G Optional: FLIM IRF

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Investigación del cáncer número 183
Un enfoque de segmentación sin etiquetas para imágenes intravitales del microambiente tumoral mamario
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Burkel, B. M., Inman, D. R.,… More

Burkel, B. M., Inman, D. R., Virumbrales-Muñoz, M., Hoffmann, E. J., Ponik, S. M. A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment. J. Vis. Exp. (183), e63413, doi:10.3791/63413 (2022).

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