عزل وتوصيف الخلايا المناعية من الضفائر المشيمية للفئران المجهرية
Summary
تستخدم هذه الدراسة قياس التدفق الخلوي واستراتيجيتين مختلفتين للبوابات على الضفائر الدماغية المعزولة المنتشرة في دماغ الفئران. يحدد هذا البروتوكول المجموعات الفرعية الرئيسية للخلايا المناعية التي تملأ بنية الدماغ هذه.
Abstract
لم يعد الدماغ يعتبر عضوا يعمل بمعزل عن الآخرين. تشير الأدلة المتراكمة إلى أن التغيرات في الجهاز المناعي المحيطي يمكن أن تشكل وظائف الدماغ بشكل غير مباشر. في الواجهة بين الدماغ والدورة الدموية الجهازية ، تم تسليط الضوء على الضفائر المشيمية (CP) ، التي تشكل حاجز السائل الدموي الدماغي الشوكي ، كموقع رئيسي للتواصل المحيطي مع الدماغ. ينتج CP السائل الدماغي الشوكي ، وعوامل التغذية العصبية ، وجزيئات الإشارات التي يمكن أن تشكل توازن الدماغ. CP هي أيضا مكانة مناعية نشطة. على النقيض من حمة الدماغ ، التي تسكنها بشكل رئيسي الخلايا الدبقية الصغيرة في ظل الظروف الفسيولوجية ، فإن عدم تجانس الخلايا المناعية CP يلخص التنوع الموجود في الأعضاء الطرفية الأخرى. يتغير تنوع الخلايا المناعية CP ونشاطها مع الشيخوخة والإجهاد والمرض ويعدل نشاط ظهارة CP ، وبالتالي يشكل وظائف الدماغ بشكل غير مباشر. الهدف من هذا البروتوكول هو عزل CP الفئران وتحديد حوالي 90٪ من المجموعات الفرعية المناعية الرئيسية التي تملأها. هذه الطريقة هي أداة لتوصيف الخلايا المناعية CP وفهم وظيفتها في تنسيق التواصل من المحيط إلى الدماغ. قد يساعد البروتوكول المقترح في فك رموز كيفية قيام الخلايا المناعية CP بتعديل وظائف الدماغ بشكل غير مباشر في الصحة وعبر مختلف الحالات المرضية.
Introduction
منذ اكتشاف الحاجز الدموي الدماغي من قبل بول إرليتش في أواخر القرن 19th ، تم اعتبار الدماغ منفصلا تقريبا عن الأعضاء الأخرى ومجرى الدم. ومع ذلك ، شهد هذا العقد الماضي ظهور مفهوم أن وظيفة الدماغ تتشكل من خلال عوامل بيولوجية مختلفة ، مثل ميكروبات الأمعاء والخلايا والإشارات المناعية الجهازية1،2،3،4. في موازاة ذلك ، تم تحديد حدود الدماغ الأخرى مثل السحايا والضفائر المشيمية (CP) كواجهات للحديث المناعي الدماغي النشط بدلا من الأنسجة الحاجزة الخاملة5،6،7،8.
يشكل CP حاجز السائل الدموي الدماغي الشوكي ، وهو أحد الحدود التي تفصل بين الدماغ والمحيط. وهي تقع في كل من البطينين الأربعة للدماغ ، أي البطينين الثالث والرابع وكلا البطينين الجانبيين ، وهي مجاورة للمناطق المشاركة في تكوين الخلايا العصبية مثل المنطقة تحت البطينية والمنطقة تحت الحبيبية من الحصين 3. من الناحية الهيكلية، يتكون CP من شبكة من الشعيرات الدموية المشتعلة محاطة بطبقة واحدة من الخلايا الظهارية، والتي ترتبط ببعضها البعض بواسطة تقاطعات ضيقة وتلتصق9,10. تتضمن الأدوار الفسيولوجية الرئيسية لظهارة CP إنتاج السائل الدماغي الشوكي ، الذي يطرد الدماغ من مستقلبات النفايات ومجاميع البروتين ، وإنتاج والتحكم في مرور الدم إلى الدماغ لجزيئات الإشارات المختلفة بما في ذلك الهرمونات وعوامل التغذية العصبية11،12،13. تشكل الجزيئات المفرزة من CP نشاط الدماغ ، أي عن طريق تعديل تكوين الخلايا العصبية ووظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة14،15،16،17،18،19 ، مما يجعل CP حاسما لتوازن الدماغ. يشارك CP أيضا في أنشطة مناعية مختلفة. في حين أن نوع الخلايا المناعية الرئيسي في حمة الدماغ في ظل ظروف غير مرضية هو الخلايا الدبقية الصغيرة، فإن تنوع مجموعات الخلايا المناعية CP واسع كما هو الحال في الأعضاء الطرفية3,7، مما يشير إلى أن قنوات مختلفة من التنظيم المناعي والإشارات تعمل في CP.
الفراغ بين الخلايا البطانية والظهارية، سدى CP، مأهول بشكل رئيسي بالبلاعم المرتبطة بالحدود (BAM)، والتي تعبر عن السيتوكينات المؤيدة للالتهابات والجزيئات المتعلقة بعرض المستضد استجابة للإشارات الالتهابية3. وهناك نوع فرعي آخر من البلاعم، وهو خلايا إبلكس كولمر، الموجودة على السطح القمي لظهارة CP20. سدى CP هي أيضا مكانة للخلايا المتغصنة ، والخلايا البائية ، والخلايا البدينة ، والخلايا القاعدية ، والعدلات ، والخلايا اللمفاوية الفطرية ، والخلايا التائية التي هي في الغالب خلايا تائية مستجيبة للذاكرة قادرة على التعرف على مستضدات الجهاز العصبي المركزي 7،21،22،23،24. بالإضافة إلى ذلك، يتغير تكوين ونشاط مجموعات الخلايا المناعية في CP عند الاضطراب الجهازي أو الدماغي، على سبيل المثال، خلال الشيخوخة10،14،15،21،25، واضطراب الميكروبات7، والإجهاد26، والمرض27،28. ومن الجدير بالذكر أن هذه التغييرات قد اقترحت لتشكيل وظائف الدماغ بشكل غير مباشر ، أي أن تحول خلايا CP CD4 + T نحو التهاب Th2 يحدث في شيخوخة الدماغ ويحفز إشارات مناعية من CP قد تشكل التدهور المعرفي المرتبط بالشيخوخة14،15،21،25،29 . وبالتالي فإن إلقاء الضوء على خصائص الخلايا المناعية CP سيكون أمرا بالغ الأهمية لفهم وظيفتها التنظيمية بشكل أفضل في فسيولوجيا وإفراز ظهارة CP وبالتالي فك رموز تأثيرها غير المباشر على وظائف المخ في ظل الظروف الصحية والمرضية.
CP هي هياكل صغيرة تحتوي على عدد قليل من الخلايا المناعية. عزلها يتطلب تشريح مجهري بعد خطوة أولية من التروية. وإلا فإن الخلايا المناعية في مجرى الدم ستشكل ملوثات رئيسية. يهدف هذا البروتوكول إلى توصيف المجموعات الفرعية للخلايا النخاعية والخلايا التائية في CP باستخدام قياس التدفق الخلوي. تحدد هذه الطريقة حوالي 90٪ من مجموعات الخلايا المناعية التي تشكل CP الفئران في ظل ظروف غير التهابية ، وفقا للأعمال المنشورة مؤخرا باستخدام طرق أخرى لتشريح عدم تجانس CP المناعي 7،10،28. يمكن تطبيق هذا البروتوكول لتوصيف التغيرات في حجرة الخلايا المناعية CP مع المرض والنماذج التجريبية الأخرى في الجسم الحي.
Protocol
Representative Results
Discussion
ركزت الدراسات التي تهدف إلى فهم المساهمات المناعية في توازن الدماغ والمرض بشكل أساسي على الخلايا الموجودة داخل حمة الدماغ ، وإهمال حدود الدماغ مثل CP ، والتي تعد مع ذلك مساهمين حاسمين في وظائف الدماغ2,3. يعد تحليل مجموعات الخلايا المناعية في CP أمرا صعبا بسبب ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر معهد باستور أنيميري المركزي وأعضاء مرفق CB-UTechS على مساعدتهم. وقد حظي هذا العمل بدعم مالي من معهد باستور.
Materials
| anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Flow cytometry antibody |
| Albumin, bovine | MP Biomedicals | 160069 | Blocking reagent |
| APC anti-mouse CX3CR1 | BioLegend | 149008 | Flow cytometry antibody |
| APC anti-mouse TCRb | BioLegend | 109212 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100414 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse IA-IE | BioLegend | 107628 | Flow cytometry antibody |
| BD FACSymphony A5 Cell Analyzer | BD Biosciences | Flow cytometry analyzer | |
| BV711 anti-mouse Ly6C | BioLegend | 128037 | Flow cytometry antibody |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | Enzyme to dissociate CP tissue |
| DAPI | Thermo Scientific | 62248 | Live/dead marker |
| EDTA | Ion chelator | ||
| fine scissors | FST | 14058-11 | Dissection tool |
| FITC anti-mouse CD45 | BioLegend | 103108 | Flow cytometry antibody |
| Flow controller infusion inset | CareFusion | RG-3-C | Blood perfusion inset |
| FlowJo software | BD Biosciences | Analysis software | |
| forceps | FST | 11018-12 | Dissection tool |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Anticoagulant |
| Imalgene | Boehringer Ingelheim | Ketamine, anesthesic | |
| OneComp eBeads | Invitrogen | 01-1111-42 | Control beads to realize compensation |
| PBS-/- | Gibco | 14190-094 | Buffer |
| PBS+/+ | Gibco | 14040-091 | Buffer |
| PE anti-mouse CD8a | BioLegend | 100708 | Flow cytometry antibody |
| PE anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123110 | Flow cytometry antibody |
| PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101256 | Flow cytometry antibody |
| Rompun | Bayer | Xylazine, anesthesic | |
| thin forceps | Dumoxel Biology | 11242-40 | Dissection tool |
| Vetergesic | Ceva | Buprenorphin, analgesic |
References
- Morais, L. H., Schreiber, H. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
- Deczkowska, A., Schwartz, M. Targeting neuro-immune communication in neurodegeneration: Challenges and opportunities. Journal of Experimental Medicine. 215 (11), 2702-2704 (2018).
- Croese, T., Castellani, G., Schwartz, M. Immune cell compartmentalization for brain surveillance and protection. Nature Immunology. 22 (9), 1083-1092 (2021).
- Erny, D., et al. Host microbiota constantly control maturation and function of microglia in the CNS. Nature Neuroscience. 18 (7), 965-977 (2015).
- Mrdjen, D., et al. High-dimensional single-cell mapping of central nervous system immune cells reveals distinct myeloid subsets in health, aging, and disease. Immunity. 48 (2), 380-395 (2018).
- Korin, B., et al. single-cell characterization of the brain’s immune compartment. Nature Neuroscience. 20 (9), 1300-1309 (2017).
- van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
- Ajami, B., et al. Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models. Nature Neuroscience. 21 (4), 541-551 (2018).
- Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: Biology and pathology. Acta Neuropathologica. 119 (1), 75-88 (2010).
- Dani, N., et al. A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages. Cell. 184 (11), 3056-3074 (2021).
- Falcão, A. M., Marques, F., Novais, A., Sousa, N., Palha, J. A., Sousa, J. C. The path from the choroid plexus to the subventricular zone: Go with the flow. Frontiers in Cellular Neuroscience. 6, (2012).
- Shipley, F. B., et al. Tracking calcium dynamics and immune surveillance at the choroid plexus blood-cerebrospinal fluid interface. Neuron. 108 (4), 623-639 (2020).
- Mazucanti, C. H., et al. Release of insulin produced by the choroids plexis is regulated by serotonergic signaling. JCI Insight. 4 (23), (2019).
- Baruch, K., et al. Aging-induced type I interferon response at the choroid plexus negatively affects brain function. Science. 346 (6205), 89-93 (2014).
- Deczkowska, A., et al. Mef2C restrains microglial inflammatory response and is lost in brain ageing in an IFN-I-dependent manner. Nature Communications. 8 (1), (2017).
- Silva-Vargas, V., Maldonado-Soto, A. R., Mizrak, D., Codega, P., Doetsch, F. Age-dependent niche signals from the choroid plexus regulate adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 19 (5), 643-652 (2016).
- Iliff, J. J., et al. Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury. Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).
- Redzic, Z. B., Preston, J. E., Duncan, J. A., Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. The choroid plexus-cerebrospinal fluid system: From development to aging. Current Topics in Developmental Biology. 71, 1-52 (2005).
- da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer’s disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
- Schwarze, E. -. W. The origin of (Kolmer’s) epiplexus cells. Histochemistry. 44 (1), 103-104 (1975).
- Baruch, K., et al. CNS-specific immunity at the choroid plexus shifts toward destructive Th2 inflammation in brain aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (6), 2264-2269 (2013).
- Kunis, G., et al. IFN-γ-dependent activation of the brain’s choroid plexus for CNS immune surveillance and repair. Brain. 136 (11), 3427-3440 (2013).
- Prinz, M., Priller, J. Microglia and brain macrophages in the molecular age: From origin to neuropsychiatric disease. Nature Reviews Neuroscience. 15 (5), 300-312 (2014).
- Goldmann, T., et al. fate and dynamics of macrophages at central nervous system interfaces. Nature Immunology. 17 (7), 797-805 (2016).
- Fung, I. T. H., et al. Activation of group 2 innate lymphoid cells alleviates aging-associated cognitive decline. Journal of Experimental Medicine. 217 (4), (2020).
- Kertser, A., et al. Corticosteroid signaling at the brain-immune interface impedes coping with severe psychological stress. Science Advances. 5, 4111 (2019).
- Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
- Yang, A. C., et al. Dysregulation of brain and choroid plexus cell types in severe COVID-19. Nature. 595 (7868), 565-571 (2021).
- Baruch, K., et al. PD-1 immune checkpoint blockade reduces pathology and improves memory in mouse models of Alzheimer’s disease. Nature Medicine. 22 (2), 135-137 (2016).
- Baruch, K., et al. Breaking immune tolerance by targeting Foxp3+ regulatory T cells mitigates Alzheimer’s disease pathology. Nature Communications. 6, 7967 (2015).
- Rodríguez-Rodríguez, N., Flores-Mendoza, G., Apostolidis, S. A., Rosetti, F., Tsokos, G. C., Crispín, J. C. TCR-α/β CD4 − CD8 − double negative T cells arise from CD8 + T cells. Journal of Leukocyte Biology. 108 (3), 851-857 (2020).
- Schafflick, D., et al. Single-cell profiling of CNS border compartment leukocytes reveals that B cells and their progenitors reside in non-diseased meninges. Nature Neuroscience. 24 (9), 1225-1234 (2021).
- Quintana, E., et al. DNGR-1+ dendritic cells are located in meningeal membrane and choroid plexus of the noninjured brain. GLIA. 63 (12), 2231-2248 (2015).
- Kabashima, K., et al. Biomarkers for evaluation of mast cell and basophil activation. Immunological Reviews. 282 (1), 114-120 (2018).
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Borst, K., Dumas, A. A., Prinz, M. Microglia: Immune and non-immune functions. Immunity. 54 (10), 2194-2208 (2021).
