Mikro Disseke Fare Koroid Pleksuslarından İmmün Hücrelerin İzolasyonu ve Karakterizasyonu
Summary
Bu çalışmada akım sitometrisi ve izole perfüze edilmiş farelerin beyin koroid pleksusları üzerinde iki farklı geçit stratejisi kullanılmaktadır; Bu protokol, bu beyin yapısını dolduran ana bağışıklık hücresi alt kümelerini tanımlar.
Abstract
Beyin artık izole bir şekilde işleyen bir organ olarak kabul edilmiyor; Biriken kanıtlar, periferik bağışıklık sistemindeki değişikliklerin dolaylı olarak beyin fonksiyonlarını şekillendirebileceğini göstermektedir. Beyin ve sistemik dolaşım arasındaki arayüzde, kan-beyin omurilik sıvısı bariyerini oluşturan koroid pleksuslar (SP), periferi-beyin iletişiminin kilit bir yeri olarak vurgulanmıştır. SP, beyin omurilik sıvısını, nörotrofik faktörleri ve beyin homeostazını şekillendirebilen sinyal moleküllerini üretir. SP aynı zamanda aktif bir immünolojik niştir. Fizyolojik koşullar altında esas olarak mikroglia tarafından doldurulan beyin parankiminin aksine, SP bağışıklık hücrelerinin heterojenliği, diğer periferik organlarda bulunan çeşitliliği özetler. SP immün hücre çeşitliliği ve aktivitesi yaşlanma, stres ve hastalık ile değişir ve SP epitelinin aktivitesini modüle eder, böylece dolaylı olarak beyin fonksiyonunu şekillendirir. Bu protokolün amacı, murin SP’yi izole etmek ve onları dolduran ana bağışıklık alt kümelerinin yaklaşık% 90’ını tanımlamaktır. Bu yöntem, SP bağışıklık hücrelerini karakterize etmek ve periferi-beyin iletişimini düzenlemedeki işlevlerini anlamak için bir araçtır. Önerilen protokol, SP bağışıklık hücrelerinin sağlıkta ve çeşitli hastalık koşullarında beyin fonksiyonlarını dolaylı olarak nasıl modüle ettiğini deşifre etmeye yardımcı olabilir.
Introduction
19. yüzyılın sonlarında Paul Erhlich tarafından kan-beyin bariyerinin keşfedilmesinden bu yana, beynin diğer organlardan ve kan dolaşımından neredeyse ayrı olduğu düşünülmektedir. Yine de, bu son on yılda, beyin fonksiyonlarının bağırsak mikrobiyotası ve sistemik bağışıklık hücreleri ve sinyalleri gibi çeşitli biyolojik faktörler tarafından şekillendirildiği kavramının ortaya çıkışına tanık olunmuştur1,2,3,4. Buna paralel olarak, meninksler ve koroid pleksuslar (SP) gibi diğer beyin sınırları, inert bariyer dokularından ziyade aktif immün-beyin çapraz konuşmasının arayüzleri olarak tanımlanmıştır5,6,7,8.
SP, beyin ve çevresini ayıran sınırlardan biri olan kan-beyin omurilik sıvısı bariyerini oluşturur. Beynin dört ventrikülünün her birinde, yani üçüncü, dördüncü ve her iki lateral ventrikülde bulunurlar ve hipokampusun subventriküler bölgesi ve subgranüler bölgesi gibi nörogenezde yer alan alanlara bitişiktirler3. Yapısal olarak, SP, sıkı ve yapışkan kavşaklarla birbirine bağlanan tek katmanlı bir epitel hücresi tarafından çevrelenmiş bir federe kan kılcal damarları ağından oluşur9,10. SP epitelinin başlıca fizyolojik rolleri, beyni atık metabolitlerden ve protein agregalarından temizleyen beyin omurilik sıvısının üretimini ve hormonlar ve nörotrofik faktörler de dahil olmak üzere çeşitli sinyal moleküllerinin üretimini ve kontrollü kandan beyne geçişini içerir11,12,13. SP’den salgılanan moleküller beynin aktivitesini şekillendirir, yani nörogenezi ve mikroglial fonksiyonu modüle ederek14,15,16,17,18,19, bu da SP’yi beyin homeostazı için çok önemli kılar. SP ayrıca çeşitli bağışıklık aktivitelerine katılır; patolojik olmayan koşullar altında beyin parankimindeki ana immün hücre tipi mikroglia iken, SP immün hücre popülasyonlarının çeşitliliği periferik organlardaki kadar geniştir3,7, bu da SP’de çeşitli immün regülasyon ve sinyal kanallarının iş başında olduğunu düşündürmektedir.
Endotel ve epitel hücreleri arasındaki boşluk, CP stroma, esas olarak, inflamatuar sinyallere yanıt olarak pro-inflamatuar sitokinleri ve antijen sunumuyla ilişkili molekülleri eksprese eden sınırla ilişkili makrofajlar (BAM) ile doldurulur3. Makrofajların bir başka alt tipi olan Kolmer epipleksus hücreleri, CP epitelinin apikal yüzeyinde bulunur20. CP stroma ayrıca dendritik hücreler, B hücreleri, mast hücreleri, bazofiller, nötrofiller, doğuştan gelen lenfoid hücreler ve çoğunlukla merkezi sinir sistemi antijenlerini tanıyabilen efektör hafıza T hücreleri olan T hücreleri için bir niştir7,21,22,23,24. Ek olarak, SP’deki bağışıklık hücresi popülasyonlarının bileşimi ve aktivitesi, sistemik veya beyin pertürbasyonu üzerine, örneğin yaşlanma sırasında10,14,15,21,25, mikrobiyota pertürbasyonu7, stres26 ve hastalık27,28 sırasında değişir. Özellikle, bu değişikliklerin dolaylı olarak beyin fonksiyonunu şekillendirdiği öne sürülmüştür, yani CP CD4 + T hücrelerinin Th2 inflamasyonuna doğru kayması beyin yaşlanmasında meydana gelir ve yaşlanma ile ilişkili bilişsel gerilemeyi şekillendirebilecek SP’den bağışıklık sinyalini tetikler14,15,21,25,29 . Bu nedenle, SP immün hücrelerinin özelliklerini aydınlatmak, SP epitel fizyolojisi ve sekresyonu üzerindeki düzenleyici işlevlerini daha iyi anlamak ve böylece sağlıklı ve hastalık koşulları altında beyin fonksiyonu üzerindeki dolaylı etkilerini deşifre etmek için çok önemli olacaktır.
SP, sadece birkaç bağışıklık hücresi içeren küçük yapılardır. İzolasyonları, perfüzyonun ön adımından sonra mikrodiseksiyon gerektirir; aksi takdirde kan dolaşımındaki bağışıklık hücreleri büyük kirleticiler oluşturur. Bu protokol, akım sitometrisi kullanarak SP’nin miyeloid ve T hücre alt kümelerini karakterize etmeyi amaçlamaktadır. Bu yöntem, enflamatuar olmayan koşullar altında fare SP’sini oluşturan immün hücre popülasyonlarının yaklaşık% 90’ını, immün CP heterojenliğini diseke etmek için diğer yöntemleri kullanan yakın zamanda yayınlanan çalışmalara uygun olarak tanımlar7,10,28. Bu protokol, SP immün hücre bölmesindeki değişiklikleri hastalık ve diğer deneysel paradigmalarla in vivo olarak karakterize etmek için uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beyin homeostazı ve hastalığına immünolojik katkıları anlamayı amaçlayan çalışmalar, esas olarak beyin parankimi içinde bulunan hücrelere odaklanmış, SP gibi beyin sınırlarını ihmal etmiş, ancak yine de beyin fonksiyonuna çok önemli katkılarda bulunmuştur2,3. SP’deki bağışıklık hücresi popülasyonlarının analizi, SP’nin küçük boyutu, düşük sayıda yerleşik bağışıklık hücresi ve bu dokuya karmaşık erişim nedeniyle z…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Institut Pasteur Animalerie Centrale’ye ve CB-UTechS tesis üyelerine yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışma Institut Pasteur tarafından finansal olarak desteklenmiştir.
Materials
| anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Flow cytometry antibody |
| Albumin, bovine | MP Biomedicals | 160069 | Blocking reagent |
| APC anti-mouse CX3CR1 | BioLegend | 149008 | Flow cytometry antibody |
| APC anti-mouse TCRb | BioLegend | 109212 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100414 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse IA-IE | BioLegend | 107628 | Flow cytometry antibody |
| BD FACSymphony A5 Cell Analyzer | BD Biosciences | Flow cytometry analyzer | |
| BV711 anti-mouse Ly6C | BioLegend | 128037 | Flow cytometry antibody |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | Enzyme to dissociate CP tissue |
| DAPI | Thermo Scientific | 62248 | Live/dead marker |
| EDTA | Ion chelator | ||
| fine scissors | FST | 14058-11 | Dissection tool |
| FITC anti-mouse CD45 | BioLegend | 103108 | Flow cytometry antibody |
| Flow controller infusion inset | CareFusion | RG-3-C | Blood perfusion inset |
| FlowJo software | BD Biosciences | Analysis software | |
| forceps | FST | 11018-12 | Dissection tool |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Anticoagulant |
| Imalgene | Boehringer Ingelheim | Ketamine, anesthesic | |
| OneComp eBeads | Invitrogen | 01-1111-42 | Control beads to realize compensation |
| PBS-/- | Gibco | 14190-094 | Buffer |
| PBS+/+ | Gibco | 14040-091 | Buffer |
| PE anti-mouse CD8a | BioLegend | 100708 | Flow cytometry antibody |
| PE anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123110 | Flow cytometry antibody |
| PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101256 | Flow cytometry antibody |
| Rompun | Bayer | Xylazine, anesthesic | |
| thin forceps | Dumoxel Biology | 11242-40 | Dissection tool |
| Vetergesic | Ceva | Buprenorphin, analgesic |
References
- Morais, L. H., Schreiber, H. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
- Deczkowska, A., Schwartz, M. Targeting neuro-immune communication in neurodegeneration: Challenges and opportunities. Journal of Experimental Medicine. 215 (11), 2702-2704 (2018).
- Croese, T., Castellani, G., Schwartz, M. Immune cell compartmentalization for brain surveillance and protection. Nature Immunology. 22 (9), 1083-1092 (2021).
- Erny, D., et al. Host microbiota constantly control maturation and function of microglia in the CNS. Nature Neuroscience. 18 (7), 965-977 (2015).
- Mrdjen, D., et al. High-dimensional single-cell mapping of central nervous system immune cells reveals distinct myeloid subsets in health, aging, and disease. Immunity. 48 (2), 380-395 (2018).
- Korin, B., et al. single-cell characterization of the brain’s immune compartment. Nature Neuroscience. 20 (9), 1300-1309 (2017).
- van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
- Ajami, B., et al. Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models. Nature Neuroscience. 21 (4), 541-551 (2018).
- Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: Biology and pathology. Acta Neuropathologica. 119 (1), 75-88 (2010).
- Dani, N., et al. A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages. Cell. 184 (11), 3056-3074 (2021).
- Falcão, A. M., Marques, F., Novais, A., Sousa, N., Palha, J. A., Sousa, J. C. The path from the choroid plexus to the subventricular zone: Go with the flow. Frontiers in Cellular Neuroscience. 6, (2012).
- Shipley, F. B., et al. Tracking calcium dynamics and immune surveillance at the choroid plexus blood-cerebrospinal fluid interface. Neuron. 108 (4), 623-639 (2020).
- Mazucanti, C. H., et al. Release of insulin produced by the choroids plexis is regulated by serotonergic signaling. JCI Insight. 4 (23), (2019).
- Baruch, K., et al. Aging-induced type I interferon response at the choroid plexus negatively affects brain function. Science. 346 (6205), 89-93 (2014).
- Deczkowska, A., et al. Mef2C restrains microglial inflammatory response and is lost in brain ageing in an IFN-I-dependent manner. Nature Communications. 8 (1), (2017).
- Silva-Vargas, V., Maldonado-Soto, A. R., Mizrak, D., Codega, P., Doetsch, F. Age-dependent niche signals from the choroid plexus regulate adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 19 (5), 643-652 (2016).
- Iliff, J. J., et al. Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury. Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).
- Redzic, Z. B., Preston, J. E., Duncan, J. A., Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. The choroid plexus-cerebrospinal fluid system: From development to aging. Current Topics in Developmental Biology. 71, 1-52 (2005).
- da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer’s disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
- Schwarze, E. -. W. The origin of (Kolmer’s) epiplexus cells. Histochemistry. 44 (1), 103-104 (1975).
- Baruch, K., et al. CNS-specific immunity at the choroid plexus shifts toward destructive Th2 inflammation in brain aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (6), 2264-2269 (2013).
- Kunis, G., et al. IFN-γ-dependent activation of the brain’s choroid plexus for CNS immune surveillance and repair. Brain. 136 (11), 3427-3440 (2013).
- Prinz, M., Priller, J. Microglia and brain macrophages in the molecular age: From origin to neuropsychiatric disease. Nature Reviews Neuroscience. 15 (5), 300-312 (2014).
- Goldmann, T., et al. fate and dynamics of macrophages at central nervous system interfaces. Nature Immunology. 17 (7), 797-805 (2016).
- Fung, I. T. H., et al. Activation of group 2 innate lymphoid cells alleviates aging-associated cognitive decline. Journal of Experimental Medicine. 217 (4), (2020).
- Kertser, A., et al. Corticosteroid signaling at the brain-immune interface impedes coping with severe psychological stress. Science Advances. 5, 4111 (2019).
- Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
- Yang, A. C., et al. Dysregulation of brain and choroid plexus cell types in severe COVID-19. Nature. 595 (7868), 565-571 (2021).
- Baruch, K., et al. PD-1 immune checkpoint blockade reduces pathology and improves memory in mouse models of Alzheimer’s disease. Nature Medicine. 22 (2), 135-137 (2016).
- Baruch, K., et al. Breaking immune tolerance by targeting Foxp3+ regulatory T cells mitigates Alzheimer’s disease pathology. Nature Communications. 6, 7967 (2015).
- Rodríguez-Rodríguez, N., Flores-Mendoza, G., Apostolidis, S. A., Rosetti, F., Tsokos, G. C., Crispín, J. C. TCR-α/β CD4 − CD8 − double negative T cells arise from CD8 + T cells. Journal of Leukocyte Biology. 108 (3), 851-857 (2020).
- Schafflick, D., et al. Single-cell profiling of CNS border compartment leukocytes reveals that B cells and their progenitors reside in non-diseased meninges. Nature Neuroscience. 24 (9), 1225-1234 (2021).
- Quintana, E., et al. DNGR-1+ dendritic cells are located in meningeal membrane and choroid plexus of the noninjured brain. GLIA. 63 (12), 2231-2248 (2015).
- Kabashima, K., et al. Biomarkers for evaluation of mast cell and basophil activation. Immunological Reviews. 282 (1), 114-120 (2018).
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Borst, K., Dumas, A. A., Prinz, M. Microglia: Immune and non-immune functions. Immunity. 54 (10), 2194-2208 (2021).
