Isolement et caractérisation des cellules immunitaires des plexus choroïdes de souris micro-disséqués
Summary
Cette étude utilise la cytométrie en flux et deux stratégies de contrôle différentes sur des plexus choroïdes cérébraux perfusés isolés; ce protocole identifie les principaux sous-ensembles de cellules immunitaires qui peuplent cette structure cérébrale.
Abstract
Le cerveau n’est plus considéré comme un organe fonctionnant isolément; L’accumulation de preuves suggère que les changements dans le système immunitaire périphérique peuvent indirectement façonner le fonctionnement du cerveau. À l’interface entre le cerveau et la circulation systémique, les plexus choroïdes (PC), qui constituent la barrière hémato-céphalo-rachidienne, ont été mis en évidence comme un site clé de la communication périphérique-cerveau. La PC produit le liquide céphalo-rachidien, les facteurs neurotrophiques et les molécules de signalisation qui peuvent façonner l’homéostasie cérébrale. La PC est également un créneau immunologique actif. Contrairement au parenchyme cérébral, qui est peuplé principalement de microglies dans des conditions physiologiques, l’hétérogénéité des cellules immunitaires CP récapitule la diversité trouvée dans d’autres organes périphériques. La diversité et l’activité des cellules immunitaires CP changent avec le vieillissement, le stress et la maladie et modulent l’activité de l’épithélium CP, façonnant ainsi indirectement la fonction cérébrale. L’objectif de ce protocole est d’isoler la PC murine et d’identifier environ 90% des principaux sous-ensembles immunitaires qui les peuplent. Cette méthode est un outil pour caractériser les cellules immunitaires CP et comprendre leur fonction dans l’orchestration de la communication périphérique-cerveau. Le protocole proposé peut aider à déchiffrer comment les cellules immunitaires CP modulent indirectement le fonctionnement du cerveau dans la santé et dans diverses maladies.
Introduction
Depuis la découverte de la barrière hémato-encéphalique par Paul Erhlich à la fin du 19ème siècle, le cerveau a été considéré comme pratiquement séparé des autres organes et de la circulation sanguine. Pourtant, cette dernière décennie a vu l’émergence du concept selon lequel la fonction cérébrale est façonnée par divers facteurs biologiques, tels que le microbiote intestinal et les cellules et signaux immunitaires systémiques1,2,3,4. En parallèle, d’autres frontières cérébrales telles que les méninges et les plexus choroïdes (PC) ont été identifiées comme des interfaces de diaphonie active entre le cerveau et le cerveau plutôt que comme des tissus de barrière inerte5,6,7,8.
Les CP constituent la barrière du liquide hémato-céphalo-rachidien, l’une des frontières séparant le cerveau et la périphérie. Ils sont situés dans chacun des quatre ventricules du cerveau, c’est-à-dire le troisième, le quatrième et les deux ventricules latéraux, et sont adjacents aux zones impliquées dans la neurogenèse telles que la zone sous-ventriculaire et la zone sous-granulaire de l’hippocampe3. Structurellement, les CP sont composés d’un réseau de capillaires sanguins fenêtrés entourés d’une monocouche de cellules épithéliales, qui sont interconnectées par des jonctions serrées et adhérentes9,10. Les principaux rôles physiologiques de l’épithélium CP impliquent la production de liquide céphalo-rachidien, qui chasse le cerveau des métabolites de déchets et des agrégats de protéines, ainsi que la production et le passage contrôlé du sang au cerveau de diverses molécules de signalisation, y compris les hormones et les facteurs neurotrophiques11,12,13. Les molécules sécrétées par la PC façonnent l’activité du cerveau, c’est-à-dire en modulant la neurogenèse et la fonction microgliale14,15,16,17,18,19, ce qui rend la PC cruciale pour l’homéostasie cérébrale. Cp s’engage également dans diverses activités immunitaires; alors que le principal type de cellules immunitaires dans le parenchyme cérébral dans des conditions non pathologiques est la microglie, la diversité des populations de cellules immunitaires CP est aussi large que dans les organes périphériques3,7, ce qui suggère que divers canaux de régulation immunitaire et de signalisation sont à l’œuvre au CP.
L’espace entre les cellules endothéliales et épithéliales, le stroma CP, est principalement peuplé de macrophages associés à la frontière (BAM), qui expriment des cytokines et des molécules pro-inflammatoires liées à la présentation de l’antigène en réponse à des signaux inflammatoires3. Un autre sous-type de macrophages, les cellules épiplexes de Kolmer, sont présentes sur la surface apicale de l’épithélium CP20. CP stroma est également une niche pour les cellules dendritiques, les cellules B, les mastocytes, les basophiles, les neutrophiles, les cellules lymphoïdes innées et les cellules T qui sont principalement des cellules T à mémoire effectrice capables de reconnaître les antigènes du système nerveux central7,21,22,23,24. En outre, la composition et l’activité des populations de cellules immunitaires au CP changent en cas de perturbation systémique ou cérébrale, par exemple, au cours du vieillissement10,14,15,21,25, de la perturbation du microbiote7, du stress26 et de la maladie27,28. Notamment, ces changements ont été suggérés pour façonner indirectement la fonction cérébrale, c’est-à-dire qu’un déplacement des lymphocytes T CP CD4+ vers l’inflammation Th2 se produit dans le vieillissement du cerveau et déclenche une signalisation immunitaire de la PC qui peut façonner le déclin cognitif associé au vieillissement14,15,21,25,29 . Éclairer les propriétés des cellules immunitaires CP serait donc crucial pour mieux comprendre leur fonction régulatrice sur la physiologie et la sécrétion de l’épithélium CP et ainsi déchiffrer leur impact indirect sur le fonctionnement du cerveau dans des conditions saines et pathologiques.
Les CP sont de petites structures qui ne contiennent que quelques cellules immunitaires. Leur isolement nécessite une microdissection après une étape préliminaire de perfusion; les cellules immunitaires dans la circulation sanguine constitueraient autrement des contaminants majeurs. Ce protocole vise à caractériser les sous-ensembles de cellules myéloïdes et T du CP à l’aide de la cytométrie en flux. Cette méthode identifie environ 90% des populations de cellules immunitaires qui composent la PC de souris dans des conditions non inflammatoires, conformément aux travaux récemment publiés utilisant d’autres méthodes pour disséquer l’hétérogénéité immunitaire de la CP7,10,28. Ce protocole pourrait être appliqué pour caractériser les changements dans le compartiment des cellules immunitaires CP avec la maladie et d’autres paradigmes expérimentaux in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les études visant à comprendre les contributions immunologiques à l’homéostasie et à la maladie cérébrales se sont principalement concentrées sur les cellules résidant dans le parenchyme cérébral, négligeant les frontières cérébrales telles que la PC, qui sont néanmoins des contributeurs cruciaux au fonctionnement du cerveau2,3. L’analyse des populations de cellules immunitaires au CP est difficile en raison de la petite taille de la CP, du fa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions l’Institut Pasteur Animalerie Centrale et les membres de l’établissement CB-UTechS pour leur aide. Ces travaux ont été soutenus financièrement par l’Institut Pasteur.
Materials
| anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Flow cytometry antibody |
| Albumin, bovine | MP Biomedicals | 160069 | Blocking reagent |
| APC anti-mouse CX3CR1 | BioLegend | 149008 | Flow cytometry antibody |
| APC anti-mouse TCRb | BioLegend | 109212 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100414 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse IA-IE | BioLegend | 107628 | Flow cytometry antibody |
| BD FACSymphony A5 Cell Analyzer | BD Biosciences | Flow cytometry analyzer | |
| BV711 anti-mouse Ly6C | BioLegend | 128037 | Flow cytometry antibody |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | Enzyme to dissociate CP tissue |
| DAPI | Thermo Scientific | 62248 | Live/dead marker |
| EDTA | Ion chelator | ||
| fine scissors | FST | 14058-11 | Dissection tool |
| FITC anti-mouse CD45 | BioLegend | 103108 | Flow cytometry antibody |
| Flow controller infusion inset | CareFusion | RG-3-C | Blood perfusion inset |
| FlowJo software | BD Biosciences | Analysis software | |
| forceps | FST | 11018-12 | Dissection tool |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Anticoagulant |
| Imalgene | Boehringer Ingelheim | Ketamine, anesthesic | |
| OneComp eBeads | Invitrogen | 01-1111-42 | Control beads to realize compensation |
| PBS-/- | Gibco | 14190-094 | Buffer |
| PBS+/+ | Gibco | 14040-091 | Buffer |
| PE anti-mouse CD8a | BioLegend | 100708 | Flow cytometry antibody |
| PE anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123110 | Flow cytometry antibody |
| PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101256 | Flow cytometry antibody |
| Rompun | Bayer | Xylazine, anesthesic | |
| thin forceps | Dumoxel Biology | 11242-40 | Dissection tool |
| Vetergesic | Ceva | Buprenorphin, analgesic |
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