Summary
Diese Studie verwendet Durchflusszytometrie und zwei verschiedene Gating-Strategien an isolierten perfundierten Mäusen Gehirn-Aderhautplexus; Dieses Protokoll identifiziert die wichtigsten Untergruppen von Immunzellen, die diese Gehirnstruktur bevölkern.
Abstract
Das Gehirn wird nicht mehr als ein isoliert funktionierendes Organ betrachtet; Sich häufende Beweise deuten darauf hin, dass Veränderungen im peripheren Immunsystem die Gehirnfunktion indirekt beeinflussen können. An der Schnittstelle zwischen dem Gehirn und dem systemischen Kreislauf wurden die Aderhautplexus (CP), die die Blut-Cerebrospinal-Flüssigkeitsschranke bilden, als Schlüsselort der Peripherie-zu-Gehirn-Kommunikation hervorgehoben. CP produziert die Zerebrospinalflüssigkeit, neurotrophe Faktoren und Signalmoleküle, die die Homöostase des Gehirns beeinflussen können. CP sind auch eine aktive immunologische Nische. Im Gegensatz zum Hirnparenchym, das unter physiologischen Bedingungen hauptsächlich von Mikroglia besiedelt wird, rekapituliert die Heterogenität der CP-Immunzellen die Vielfalt anderer peripherer Organe. Die Vielfalt und Aktivität der CP-Immunzellen ändert sich mit Alterung, Stress und Krankheit und moduliert die Aktivität des CP-Epithels, wodurch die Gehirnfunktion indirekt beeinflusst wird. Das Ziel dieses Protokolls ist es, murine CP zu isolieren und etwa 90% der wichtigsten Immununtergruppen, die sie bevölkern, zu identifizieren. Diese Methode ist ein Werkzeug, um CP-Immunzellen zu charakterisieren und ihre Funktion bei der Orchestrierung der Peripherie-zu-Gehirn-Kommunikation zu verstehen. Das vorgeschlagene Protokoll könnte helfen zu entschlüsseln, wie CP-Immunzellen indirekt die Gehirnfunktion in der Gesundheit und über verschiedene Krankheitszustände hinweg modulieren.
Introduction
Seit der Entdeckung der Blut-Hirn-Schranke durch Paul Erhlich im späten 19. Jahrhundert gilt das Gehirn als praktisch getrennt von den anderen Organen und dem Blutkreislauf. In den letzten zehn Jahren ist jedoch das Konzept entstanden, dass die Gehirnfunktion von verschiedenen biologischen Faktoren wie Darmmikrobiota und systemischen Immunzellen und -signalen geprägt wird1,2,3,4. Parallel dazu wurden andere Hirngrenzen wie Hirnhäute und Aderhautplexus (CP) als Schnittstellen des aktiven Immun-Hirn-Cross-Talks und nicht als inertes Barrieregewebe identifiziert5,6,7,8.
Die CP bilden die Blut-Zerebrospinal-Flüssigkeitsschranke, eine der Grenzen, die das Gehirn und die Peripherie trennen. Sie befinden sich in jedem der vier Ventrikel des Gehirns, d.h. im dritten, vierten und beiden lateralen Ventrikeln, und grenzen an Bereiche an, die an der Neurogenese beteiligt sind, wie die subventrikuläre Zone und die subgranulare Zone des Hippocampus3. Strukturell bestehen die CP aus einem Netzwerk von fenestrierten Blutkapillaren, die von einer Monoschicht von Epithelzellen umgeben sind, die durch enge und adhärene Übergänge miteinander verbunden sind9,10. Zu den wichtigsten physiologischen Rollen des CP-Epithels gehören die Produktion von Zerebrospinalflüssigkeit, die das Gehirn von Abfallmetaboliten und Proteinaggregaten spült, sowie die Produktion und kontrollierte Blut-zu-Gehirn-Passage verschiedener Signalmoleküle, einschließlich Hormone und neurotropher Faktoren11,12,13. Sekretierte Moleküle aus CP beeinflussen die Aktivität des Gehirns, d.h. durch Modulation der Neurogenese und der Mikrogliafunktion14,15,16,17,18,19, was CP für die Homöostase des Gehirns entscheidend macht. CP engagieren sich auch in verschiedenen Immunaktivitäten; Während der Hauptimmunzelltyp im Gehirnparenchym unter nicht-pathologischen Bedingungen Mikroglia ist, ist die Vielfalt der CP-Immunzellpopulationen so breit wie in peripheren Organen3,7, was darauf hindeutet, dass verschiedene Kanäle der Immunregulation und -signalisierung am CP am Werk sind.
Der Raum zwischen den Endothel- und Epithelzellen, das CP-Stroma, wird hauptsächlich von grenzassoziierten Makrophagen (BAM) bevölkert, die proinflammatorische Zytokine und Moleküle im Zusammenhang mit der Antigenpräsentation als Reaktion auf Entzündungssignale exprimieren3. Ein weiterer Subtyp von Makrophagen, Kolmers Epiplexuszellen, sind auf der apikalen Oberfläche des CP-Epithels20 vorhanden. CP-Stroma ist auch eine Nische für dendritische Zellen, B-Zellen, Mastzellen, Basophile, Neutrophile, angeborene lymphatische Zellen und T-Zellen, die meist Effektor-Gedächtnis-T-Zellen sind, die in der Lage sind, Antigene des zentralen Nervensystems zu erkennen7,21,22,23,24. Darüber hinaus ändert sich die Zusammensetzung und Aktivität von Immunzellpopulationen am CP bei systemischer oder Gehirnstörung, beispielsweise während des Alterns10,14,15,21,25, der Störung der Mikrobiota7, des Stress26 und der Krankheit27,28. Insbesondere wurde vorgeschlagen, dass diese Veränderungen indirekt die Gehirnfunktion beeinflussen, d.h. eine Verschiebung von CP CD4 + T-Zellen in Richtung Th2-Entzündung tritt bei der Gehirnalterung auf und löst Immunsignale aus dem CP aus, die den altersbedingten kognitiven Verfall beeinflussen können14,15,21,25,29 . Die Beleuchten der Eigenschaften der CP-Immunzellen wäre daher entscheidend, um ihre regulatorische Funktion auf die Physiologie und Sekretion des CP-Epithels besser zu verstehen und dadurch ihren indirekten Einfluss auf die Gehirnfunktion unter gesunden und Krankheitsbedingungen zu entschlüsseln.
CP sind kleine Strukturen, die nur wenige Immunzellen enthalten. Ihre Isolierung erfordert eine Mikrodissektion nach einem vorbereitenden Perfusionsschritt; Immunzellen im Blutkreislauf würden sonst große Verunreinigungen darstellen. Dieses Protokoll zielt darauf ab, die myeloischen und T-Zell-Teilmengen des CP mittels Durchflusszytometrie zu charakterisieren. Diese Methode identifiziert etwa 90% der Immunzellpopulationen, die Maus-CP unter nicht-entzündlichen Bedingungen bilden, in Übereinstimmung mit kürzlich veröffentlichten Arbeiten, die andere Methoden zur Sezierung der Immun-CP-Heterogenität verwenden7,10,28. Dieses Protokoll könnte angewendet werden, um Veränderungen im CP-Immunzellkompartiment mit Krankheit und anderen experimentellen Paradigmen in vivo zu charakterisieren.
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Protocol
Alle Verfahren, die mit den Leitlinien der Europäischen Kommission für den Umgang mit Versuchstieren, Richtlinie 86/609/EWG, übereinstimmen. Sie wurden von den Ethikkommissionen Nr. 59, von der CETEA/CEEA Nr. 089, unter der Nummer dap210067 und APAFIS #32382-2021070917055505 v1 genehmigt.
1. Vorbereitung der Materialien
- Lagern Sie alle Antikörper (Materialtabelle) bei 4 °C, geschützt vor Lichteinwirkung.
- DAPI-Stammlösung (1 mg/ml): Resuspendiert das Pulver in PBS-/- (Table of Materials), aliquot und lagern bei -20 °C.
- DAPI-Arbeitslösung (0,1 mg/ml): Verdünnung der DAPI-Stammlösung mit PBS-/- im Verhältnis 1:10.
- Magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS) Puffer: Herstellen Sie 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) (Tabelle der Materialien) in PBS-/-.
- Kollagenase-IV-Stammlösung (20 HE/μL): Resuspendiert das Pulver in PBS+/+ (Table of Materials), Aliquot und lagern bei -20 °C.
HINWEIS: Kollagenase IV erfordert, dass MgCl2 voll aktiv ist; Kollagenase-IV-Lösung nicht einfrieren und auftauen. - Anästhesie-analgetische Lösung: Mischen Sie 150 μL Ketamin (150 mg/kg), 25 μl Xylazin (5 mg/kg) und 330 μl Buprecare (0,1 mg/kg) in 1 ml PBS-/-.
HINWEIS: Bereiten Sie die Anästhesie-Analgetikum-Lösung spontan vor und bewahren Sie sie nicht länger als einen Tag auf. - Heparinlösung (100 E/ml): Resuspendiert das Pulver in PBS-/-.
- Bereiten Sie das Infusionseinsatzsystem vor, das einen Schlauch mit einem mit PBS-/- gefüllten Dekanter Erlenmeyer verbindet. Verbinden Sie eine 23-G-Nadel mit der Extremität des Infusionsschlauchs. Öffnen Sie den Infusionseinschub und lassen Sie das PBS laufen, bis sich keine Blasen mehr im Schlauch befinden.
- Bereiten Sie die mit einem Licht ausgestattete binokulare Lupe vor.
2. Gehäuse von C57BL/6 Mäusen
- Für die Analyse der myeloischen oder T-Zellen von CP verwenden Sie jeweils vier Mäuse und poolen die vier CP (zwei von jedem lateralen Ventrikel, den dritten Ventrikel und den vierten Ventrikel CP; für insgesamt acht Mäuse). Das Nicht-Pooling von CP birgt das Risiko, die seltenen Immunpopulationen in CP aufgrund ihrer geringen Häufigkeit nicht zu erkennen.
- Lassen Sie die Mäuse mindestens 7 Tage vor dem Experimentieren akklimatisieren. Halten Sie die Mäuse unter pathogenfreien Bedingungen bei konstanter Temperatur und Luftfeuchtigkeit, in einem 12/12 h oder 14/10 h Hell/Dunkel-Zyklus, mit Wasser und Standard-Pelletfutter ad libitum.
3. PBS-Perfusion und Hirndissektion
- Jede Maus wird gewichtet und 10 μL/g der Anästhesie-Analgetika-Mischlösung (Schritt 1.6) intraperitoneal injiziert.
- Warten Sie etwa 30 Minuten auf eine effiziente Analgesie (überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die Ziffern der Maus kneifen).
- Positionieren Sie die betäubte Maus flach auf dem Rücken, auf der Dissektionsstütze, und kleben Sie ihre Handflächen an die Dissektionsstütze.
- Kneifen Sie die Haut des Tieres mit einer Pinzette und mit einer Schere, öffnen Sie den Bauch, das Zwerchfell und den Thorax, um das Herz freizulegen.
HINWEIS: Wenn der Thorax geöffnet wird, wird das Gehirn anoxisch. Man muss präzise und schnell durch die nächsten Schritte der Perfusion gehen. - Injizieren Sie 20 μL 100 HE/ml Heparinlösung direkt in den linken Ventrikel.
- Machen Sie mit einer feinen Schere einen Schnitt von mindestens 3 mm im rechten Vorhof, damit das Blut aus dem Körper fließen kann.
- Unmittelbar danach führen Sie die 23-G-Nadel ein, die am Ende des Infusionsschlauchs durch die Spitze des linken Ventrikels platziert ist.
- Öffnen Sie das Infusionssystem maximal und warten Sie auf die vollständige Perfusion: Mit einer 23 G Nadel bei einer Durchflussrate von ca. 6 ml/min ist die Perfusion in 3 min abgeschlossen.
HINWEIS: Die gleichmäßige Verfärbung von Organen wie der Leber bescheinigt die Wirksamkeit der Perfusion. - Schließen Sie das Infusionssystem und entfernen Sie die Nadel aus dem Herzventrikel.
- Entfernen Sie das Klebeband von den Handflächen der Maus. Stellen Sie die Maus in eine ventrale Position.
- Kneifen Sie die Haut des Tieres mit einer Pinzette und mit einer Schere, entfernen Sie die Haut der Oberseite des Kopfes von den Augen zu den Ohren.
- Schneiden Sie mit Hilfe einer Schere zuerst den Schädel zwischen den Augen und dann seitlich von jedem Auge zum Rückenmark direkt über den Massetermuskeln. Verwenden Sie dazu die Extremität der Schere und gehen Sie vorsichtig vor, um zu vermeiden, dass das Gehirn mit der Schere beschädigt wird.
- Öffnen Sie den Schädel mit einer Pinzette, indem Sie ihn aus der Extremität zwischen den Augen kneifen.
- Verwenden Sie eine Schere, um das Rückenmark zu durchschneiden und das Gehirn mit einer Pinzette zu extrahieren, indem Sie ihre beiden Punkte auf der seitlichen Seite des Gehirns platzieren, um es zu kippen und in eine Petrischale zu legen, die mit eiskaltem PBS + / + gefüllt ist. Die CP werden dann sofort gesammelt.
HINWEIS: Überprüfen Sie auf Verfärbungen des Gehirns, um die Wirksamkeit der Perfusion zu überprüfen.
4. Dissektion des Plexus choroidus aus dem Gehirn
- Positionieren Sie die dorsale Gehirnseite nach oben in der Petrischale und unterhalb der Ziele der binokularen Lupen.
- Setzen Sie mit Hilfe einer Pinzette die beiden Enden einer anderen Pinzette durch die Mittellinie zwischen den Hemisphären ein, um das Gehirn an Ort und Stelle zu halten.
- Verwenden Sie die Pinzette, um den Kortex mit dem Callosum und dem Hippocampus vom Septum wegzuziehen und den lateralen Ventrikel und einen Teil des dritten Ventrikels freizulegen.
- Identifizieren Sie den lateralen CP als einen langen Schleier, der den seitlichen Ventrikel auskleidet, der an beiden Enden aufflammt. Verwenden Sie die beiden Enden einer dünnen Pinzette, um die laterale CP zu fangen. Achten Sie darauf, den dreieckigen hinteren Teil zu sammeln, der von der hinteren Falte des Hippocampus verdeckt sein kann.
- Ziehen Sie den Kortex mit dem Corpus callosum und dem Hippocampus der kontralateralen Hemisphäre vom Septum weg, um den gesamten dritten Ventrikel und den gegenüberliegenden lateralen Ventrikel freizulegen.
- Sammeln Sie mit einer feinen Pinzette den dritten CP, der als kurze Struktur mit einem körnigen Oberflächenaspekt identifiziert werden kann.
- Sammeln Sie die anderen lateralen CP.
- Setzen Sie die beiden Enden einer Pinzette zwischen Kleinhirn und Mittelhirn ein. Lösen Sie das Kleinhirn von den Pons und Medulla, um den vierten Ventrikel freizulegen.
- Identifizieren Sie den vierten CP als eine lange kugelförmige Struktur mit einem körnigen Oberflächenaspekt, der den vierten Ventrikel vom lateralen rechten Ende zum linken Ende zwischen dem Kleinhirn und der Medulla auskleidet. Sammeln Sie den vierten CP mit einer feinen Pinzette.
HINWEIS: Die Silan-Basisbeschichtung der Pinzette kann die Klebrigkeit von CP auf der Pinzette verhindern. - Wiederholen Sie die Schritte 3.1-4.9 für jedes der anderen sieben Mäuse. In der Zwischenzeit kann der gesammelte CP zeitlich in einer auf Eis gelegten Röhre aufbewahrt werden.
5. Vorbereitung der Proben für die Durchflusszytometrie-Analyse
- Füllen Sie das Röhrchen mit allen sezierten CP auf 750 μL PBS+/+.
HINWEIS: Die Abscheidung von seziertem CP mit dünner Pinzette in der Röhre bringt ein kleines Volumen von PBS+/+. Vervollständigen Sie lieber das vorhandene Volumen auf 750 μL, als es zu entfernen und durch frische 750 μL PBS+/+ zu ersetzen, um einen möglichen Verlust des CP-Gewebes zu vermeiden. - 15 μL 20 E/μL Collagenase IV-Stammlösung (siehe Schritt 1.5) für eine Endkonzentration von 400 E/ml zugeben.
HINWEIS: DNAse I (150 μg/ml) kann eine übermäßige Zellverklumpung verhindern. - CP mit Kollagenase IV bei 37 °C unter leichter Bewegung (300 U/min) 45 min inkubieren.
- Pipettieren Sie vorsichtig etwa 10 Mal auf und ab, um die CP-Dissoziation abzuschließen.
- Füllen Sie das CP-Röhrchen auf 1,5 ml mit MACS-Puffer (siehe Rezeptschritt 1.4), um die Kollagenase-IV-Aktivität zu stoppen.
HINWEIS: Die Aktivität von Kollagenase IV wird bei niedriger Temperatur gestoppt und durch Serumalbumin gehemmt. - Die Zellen werden bei 500 x g, 5 min, bei 4 °C zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen mit 1,5 ml MACS-Puffer.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 x g für 5 min, bei 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 220 μL MACS-Puffer.
- Trennen Sie ein Aliquot von 10 μL von der Zellsuspension, die als unbefleckte Kontrolle verwendet werden soll (nächster Schritt 5.18).
- Trennen Sie ein Aliquot von 10 μL von der Zellsuspension, die als DAPI-Mono-gefärbte Kontrolle verwendet werden soll (nächster Schritt 5.12).
- Die verbleibenden 200 μL mit einem Anti-Maus-CD16/CD32-blockierenden Antikörper (1:100) für 20 min bei 4 °C vorbrüten, um unspezifische Fc-vermittelte Wechselwirkungen zu blockieren.
- Teilen Sie die Zellen in zwei 100-μL-Röhrchen auf (eine für die Analyse myeloischer Zellen, die andere für die T-Zell-Analyse) (nächster Schritt 5.14).
- Entnehmen Sie die Probe mit 10 μL Zellen für die DAPI-Mono-Färbungskontrolle (Schritt 5.9) und füllen Sie sie bis zu 100 μL mit MACS-Puffer (nächster Schritt 5.14).
- Es werden elf neue Röhrchen mit 100 μL MACS für den Antikörper mono-gefärbte (Schritt 5.14.4) und alle gefärbten Kontrollen (Schritt 5.14.5) vorbereitet und jeweils ein Tropfen Kompensationsperlen hinzugefügt.
HINWEIS: Die Kompensationskontrollen ermöglichen es, die Spannung des Fluoreszenz-Detektionslasers einzustellen und die potenzielle unspezifische Signaldetektion von Fluoreszenzfarbstoff in den anderen Kanälen zu bewerten, die weiter kompensiert werden. - Antikörper-Inkubation von Proben:
- Myeloische Probe: Zugabe von 0,1 mg/ml DAPI (1:100) (siehe Schritt 1.3), FITC Anti-Maus CD45 (1:100), PE-Dazzle 594 Anti-Maus CD11b (1:100), APC Anti-Maus CX3CR1 (1:100), BV711 Anti-Maus Ly6C (1:100), PE Anti-Maus F4/80 (1:100) und APC-Cy7 Anti-Maus IA-IE (1:100).
- T-Zellprobe: Zugabe von 0,1 mg/ml DAPI (1:100), FITC Anti-Maus CD45 (1:100), PE-Dazzle 594 Anti-Maus CD11b (1:100), APC Anti-Maus TCRβ (1:100), PE Anti-Maus CD8a (1:100) und APC-Cy7 Anti-Maus CD4 (1:50).
- DAPI-Monofärbung (ab Schritt 5.12): Fügen Sie 0,1 mg/ml DAPI (1:100) hinzu.
- Antikörper-Mono-gefärbte Kompensationskügelchen: Fügen Sie jeden der neun zuvor verwendeten Antikörper für myeloische und T-Zellproben (gleiche Verdünnung) separat (einen für jedes Röhrchen) zu den neun Röhrchen hinzu, die die Kügelchen enthalten.
HINWEIS: Die einfach gefärbten Kompensationskontrollen ermöglichen die Bestimmung positiver Fluoreszenzspitzen für jeden der verwendeten fluoreszierenden Marker während des Kompensationsschritts. Der Analysator vergleicht sie mit dem negativen Signal, das in den unbefleckten Kontroll-CP-Zellen beobachtet wurde. - Antikörper-All-Stained Compensation Beads: Fügen Sie alle Antikörper, die für die myeloische Färbung verwendet werden, zu einem Röhrchen und diejenigen, die für die Färbung von T-Zellen verwendet werden, zu einem anderen hinzu.
HINWEIS: Die vollständig gebeizten Kompensationssteuerungen ermöglichen die Einstellung der Spannung jeder fluoreszierenden Laserdetektion und die Bewertung der potenziellen unspezifischen Signaldetektion von Fluoreszenzfarbstoffen in den anderen Kanälen. - Inkubieren Sie für 30-45 min auf Eis, geschützt vor Lichteinwirkung.
- Füllen Sie alle Röhrchen bis zu 1,5 ml mit MACS-Puffer. Zellen zentrifugieren und Kompensationskügelchen bei 500 x g, 5 min, bei 4 °C.
- Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen und Kompensationsperlen in 1,5 ml MACS-Puffer.
- Zellen zentrifugieren und Kompensationskügelchen bei 500 x g, 5 min, bei 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand.
- Resuspendieren Sie die Zellen und Kompensationsperlen in 500 μL MACS-Puffer. Bedruckungsfreie Steuerung (Schritt 5.8) bis 500 μL mit MACS-Puffer füllen.
- Filtern Sie jedes Röhrchen mit CP-Zellen durch ein 70-μm-Sieb (unbefleckte CP-, DAPI-Mono-Färbe-Kontroll- und myeloische und T-Zellproben).
6. Durchflusszytometrie
HINWEIS: Das in diesem Protokoll verwendete Durchflusszytometer ist mit den folgenden 5 Lasern ausgestattet: einem 355-nm-UV-Laser, einem 405-nm-Violettlaser, einem 488-nm-Blaulaser, einem 561-nm-Gelb-Grün-Laser und einem 637-nm-Rotlaser.
- Führen Sie die täglichen Qualitätskontrollprüfungen am Zytometer mithilfe der CST-Schnittstelle (Cytometer Setup, Tracking) und der CST-Kontrollperlen durch, um die Konsistenz zwischen den Analysen, die Gerätequalität und die konsistenten Zielfluoreszenzintensitäten sicherzustellen.
- Um das Durchflusszytometrie-Experiment einzurichten, erstellen Sie ein neues Experiment mit bivariaten Diagrammen und Histogrammen. Stellen Sie sicher, dass ein Vorwärtsstreubereich (FSC-A) und ein Seitenstreubereich (SSC-A) sowie Histogrammdiagramme für jede Farbe einbezogen werden, um die Erfassung zu überwachen.
- Definieren Sie die Zellmorphologie, indem Sie die PMT-Spannung für FSC-A- und SSC-A-Parameter auf unbefleckten Kontroll-CP-Zellen einrichten.
- Definieren Sie die Spannungen jedes fluoreszierenden Markers, indem Sie die negativen Peaks der Fluorochrome auf unbefleckten Kontroll-CP-Zellen und die positiven Peaks der Fluorochrome unter Verwendung von Kompensationsperlen, die mit allen Antikörpern angefärbt sind, einrichten und sicherstellen, dass die Detektorsignale nicht außerhalb der Skala liegen und in anderen Kanälen nicht zu stark kreuzdetektiert werden.
- Erstellen Sie eine Kompensationsmatrix, um jedes der einfarbigen Kompensationssteuerelemente zu analysieren. Nachdem Sie die entsprechenden FSC-A/SSC-A-Populationen aktiviert haben, überprüfen Sie einfach gefärbte Kontrollen auf Histogrammdiagrammen und Datensatzkompensationskontrollen. Nachdem Sie alle einfach gefärbten Proben aufgezeichnet haben, berechnen Sie die Kompensationsmatrix.
- Zeichnen Sie alle Ereignisse auf, die sowohl für myeloische als auch für T-Zell-Populationen erkannt wurden.
7. CP myeloische Zellen Gating
- Wählen Sie FSC-A vs. SSC-A und Gate für Zellen (basierend auf der Größe).
- Erstellen Sie ein Tochtergatter für einzelne Zellen mit FSC-A vs. Vorwärtsstreuhöhe (FSC-H).
- Erstellen Sie ein Tochtertor für lebende Zellen mit DAPI vs. FSC-A, um DAPI+- Zellen auszuschließen.
- Erstellen Sie ein Tochtertor für CD45+ Immunzellen mit CD45 vs. FSC-A.
- Erstellen Sie ein Tochtertor aus den CD45+-Zellen und wählen Sie CD11b vs. F4/80, identifizieren Sie die folgenden zwei Gruppen: die CD11b+ F4/80+ und die CD11b+ F4/80- Populationen (nächster Schritt 7.8).
- Erstellen Sie ein Tochtertor für CD11b+ F4/80+-Zellen und wählen Sie CX3CR1 im Vergleich zu IA-IE aus. Identifizieren Sie sowohl CX3CR1+ IA-IE+ BAM, die weiter als CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE+ BAM bezeichnet werden, als auch CX3CR1+ IA-IE- Makrophagen.
- Erstellen Sie ein Tochtertor für CD11b+ F4/80+ CX3CR1+ IA-IE- Makrophagen und wählen Sie F4/80 vs. CD11b. Identifizieren Sie sowohl die CD11bhigh F4/80intermediate als auch die CD11b+ F4/80high Populationen, die weiter als CD11bhigh F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- Kolmer's epiplexus macrophages und CD11b+ F4/80high CX3 bezeichnet werden. CR1+ IA-IE- BAM, beziehungsweise.
HINWEIS: CD11bhigh F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- und CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE- Zellen schienen etwas gemischt zwischen F4/80intermediate-F4/80high und CD11bhigh-CD11b+ Pegeln zu sein. - Ab der CD11b+ F4/80- Population (Schritt 7.5), Gate für Ly6C vs. IA-IE. Wählen Sie sowohl IA-IE+ Ly6C- Population als auch IA-IE- Ly6C+ Zellen aus, die hauptsächlich Monozyten/Neutrophilen entsprechen.
HINWEIS: Eine hohe Präsenz von IA-IE- Ly6C + - Zellen spiegelt wahrscheinlich Probleme in der Perfusionswirksamkeit von Tieren ohne entzündliche Erkrankung wider; ihre Häufigkeit sollte gering sein. - Erstellen Sie ein Tochtertor für CD11b+ F4/80- IA-IE+ Ly6C- Population und wählen Sie CD11b vs. CX3CR1, identifizieren Sie sowohl CD11bhigh CX3CR1low als auch CD11b+ CX3CR1- Populationen.
8. CP T Zellen Gating
- Wählen Sie FSC-A vs. SSC-A und Gate für Zellen (basierend auf der Größe).
- Erstellen Sie ein Tochtergatter für einzelne Zellen mit FSC-A vs. Vorwärtsstreuhöhe (FSC-H).
- Erstellen Sie ein Tochtertor für lebende Zellen mit DAPI vs. FSC-A, um DAPI+- Zellen auszuschließen.
- Erstellen Sie ein Tochtertor für CD45+ Immunzellen mit CD45 vs. FSC-A.
- Erstellen Sie ein Tochtergatter aus den CD45+-Zellen und wählen Sie TCRβ vs. CD11b. Schließen Sie CD11b+ myeloische Zellen aus und wählen Sie TCRβ+ CD11b- T-Zellpopulation.
- Erstellen Sie ein Tochtertor für TCRβ+ CD11b- Population und wählen Sie CD4 vs. CD8a. Identifizieren Sie sowohl CD8- CD4+ T-Zellen als auch CD8+ CD4-T-Zellen.
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Representative Results
Die hier vorgestellten Durchflusszytometrie-Analysen zeigten erfolgreich die wichtigsten Teilmengen der myeloischen und T-Zellen (Abbildung 1 bzw. Abbildung 2) und ihre relative Gesamtzahl pro Maus in einer hochgradig reproduzierbaren Weise (Abbildung 3).
Die Durchflusszytometrie-Analyse myeloischer Zellen zeigte, dass CP mit CD11b+ CX3CR1+ F4/80high BAM bestückt sind, was fast 80% der CD45+ Immunzellen am CP ausmacht. Diese BAM wurden entsprechend ihrer Expression von MHC-II in zwei verschiedene Populationen unterteilt: die IA-IE+ BAM, die die Hauptgruppe bildete (72% der CD45+ Immunzellen), in Übereinstimmung mit zuvor veröffentlichten Daten7, und die IA-IE- BAM. Die CD11bhigh F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- Population von Kolmers Epiplexus-Makrophagen7,2 wurde ebenfalls identifiziert und repräsentierte nur etwa 1,2% der CD45+ CP-Immunzellen, in Übereinstimmung mit der Literatur7. Unter den CD11b+ F4/80- Immunzellen wurden zwei verschiedene Populationen von Ly6C- IA-IE+ Zellen charakterisiert, die wahrscheinlich dendritischen Zellen entsprechen und die in CD11bhigh CX3CR1low und CD11b+ CX3CR1-Populationen unterteilt werden können, die etwa 3,1% bzw. 3,7% der CD45+ CP-Immunzellen ausmachten. CD45+ CD11b+ F4/80- IA-IE- Ly6C+ Zellpopulation, die sowohl Monozyten als auch Neutrophile umfasst, machte nur 0,5% der CD45+-Immunzellen aus, wie aus früheren Berichten hervorgeht und die hohe Wirksamkeit der PBS-Perfusion bescheinigt3. Diese Ergebnisse stimmen weitgehend mit zuvor veröffentlichten Daten überein, die CP-Immunpopulationen durch Einzelzell-RNA-Sequenzierung bewerten7.
Die Analyse- und Gating-Strategie von T-Zellen hob das Vorhandensein der geringen Population von CD45 + CD11b- TCRβ + -Zellen hervor. Unter ihnen bevölkerten etwa 30-50 CD8-CD4+ und CD8+ CD4-T-Zellen pro Maus CP unter physiologischen Bedingungen, was 1,3% bzw. 0,9% der CD45+ CP-Immunzellen entspricht. CD4+ Zellen waren etwas häufiger als CD8+ T-Zellen, was sowohl in Bezug auf die Anzahl als auch auf den Anteil mit früheren Ergebnissen übereinstimmt21,30. Diese Gating-Strategie ergab auch eine Population von CD45 + CD11b- TCRβ + CD4- CD8-Zellen, zu denen NKT-Zellen gehören können, und eine kürzlich beschriebene regulatorische T-Zell-Untergruppe10,28,31. Die vorgeschlagene Durchflusszytometrie-Analyse und Gating-Strategien ermöglichten die Zelltyp-Annotation von fast 90% der Immunzellen (CD45+), aus denen sich die CP der Maus zusammensetzt.
Abbildung 1: Durchflusszytometrie-Analyse und Gating-Strategie myeloischer Zellen aus CP von perfundierten Mäusen. Zellen werden basierend auf der Größe mit FSC-A vs. SSC-A eingezäunt. Singulettzellen werden mit FSC-A vs. FSC-H ausgewählt. Lebende Zellen werden durch Ausschließen von DAPI+-Zellen im DAPI- vs. FSC-A-Diagramm eingegrenzt. CD45+ Immunzellen werden dann auf einem CD45 vs. FSC-A Diagramm identifiziert. Gating CD11b vs. F4/80, die CD11b+ F4/80+ und die CD11b+ F4/80- Populationen werden ausgewählt. Gating CD11b+ F4/80+ Population unter Verwendung von CX3CR1 vs. IA-IE werden sowohl der CD11b+ F4/80HI CX3CR1+ IA-IE+ BAM als auch die CX3CR1+ IA-IE- Populationen bestimmt. Diese letztere Population wird dann mit F4/80 vs. CD11b eingezäunt, um CD11b + F4 / 80high CX3CR1 + IA-IE - BAM und CD11bhigh F4 / 80intermediate CX3CR1 + IA-IE - Kolmers Epiplexus-Makrophagen besser zu trennen. Gating Ly6C vs. IA-IE auf CD11b+ F4/80-, beide CD11b+ F4/80- IA-IE- Ly6C+ Zellen, die hauptsächlich Monozyten und Neutrophilen entsprechen, und CD11b+ F4/80- IA-IE+ Ly6C- Zellen, die wahrscheinlich die dendritische Zellpopulation repräsentieren, werden ausgewählt. CD11b+ F4/80- IA-IE+ Ly6C- Zellen werden mit CD11b vs. CX3CR1 eingezäunt, was die Identifizierung von CD11bhigh CX3CR1low und CD11b+ CX3CR1- Zellen ermöglicht. Wenn nicht angegeben, stellen Werte unter jeder Gated Population die Häufigkeit der übergeordneten Grundgesamtheit dar. hallo: hoch; Int: Mittelstufe; Lo: Niedrig. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Durchflusszytometrie-Analyse und Gating-Strategie von T-Zellen aus CP von perfundierten Mäusen. Zellen werden basierend auf der Größe mit FSC-A vs. SSC-A eingezäunt. Einzelne Zellen werden mit FSC-A vs. FSC-H ausgewählt. Lebende Zellen werden ohne DAPI+-Zellen im DAPI- und FSC-A-Diagramm identifiziert. CD45 + -Immunzellen werden dann auf einem CD45 vs. FSC-A-Diagramm eingezäunt. Gating CD11b vs. TCRβ, CD11b- TCRβ+ sind ausgewählt. Beim Gating CD4 vs. CD8 werden die Anteile der CD8-CD4+- und CD4-CD8+-T-Zellen bestimmt. Wenn nicht angegeben, stellen Werte unter jeder Gated Population die Häufigkeit der übergeordneten Grundgesamtheit dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Anzahl der wichtigsten Immunzelluntergruppen am CP pro Maus. Mittelwert der Gesamtzahl der Zellen pro Maus der verschiedenen Immununtergruppen, die in den vier CP identifiziert wurden, die zusammen gepoolt wurden. Darstellung: Mittelwert + Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Studien, die darauf abzielen, die immunologischen Beiträge zur Homöostase und Erkrankung des Gehirns zu verstehen, konzentrierten sich hauptsächlich auf Zellen, die sich im Gehirnparenchym befinden, und vernachlässigten Gehirngrenzen wie CP, die dennoch entscheidend zur Gehirnfunktion beitragen2,3. Die Analyse von Immunzellpopulationen bei CP ist aufgrund der geringen Größe von CP, der geringen Anzahl residenter Immunzellen und des komplizierten Zugangs zu diesem Gewebe eine Herausforderung. Die Durchflusszytometrie, die an den gesamten Immunzellen des Gehirns (CD45+) durchgeführt wird, erlaubt keine Charakterisierung der seltenen Immunpopulationen, die sich im CP befinden. Um die Immunzusammensetzung des CP mit hoher Präzision zu charakterisieren, wurden Durchflusszytometrie-Analysen an CP durchgeführt, die von PBS-perfundierten Mäusen seziert wurden. Dieser Ansatz ermöglicht den Ausschluss von zirkulierenden CD45+-Zellen und CP-CD45-Zellen wie Perizyten, Endothel- und Epithelzellen32. Die Gating-Strategien, die sich auf myeloische und T-Zell-Populationen konzentrieren, identifizieren die wichtigsten CP-Immununtergruppen.
Ein kritischer Schritt des aktuellen Protokolls ist die PBS-Perfusion. Da die CP-Immunzellen selten sind, könnte eine Blutkontamination ihre lokale Heterogenität vollständig maskieren. Leber- und Gehirnverfärbungen werden immer als Kontrolle überprüft, und daher ist die Blutkontamination minimal. Konsequenterweise machte CD11b+ F4/80- Ly6C+, das sowohl Monozyten als auch Neutrophile umfasst, die im Blut und nicht im Gehirn unter nicht-entzündlichen Zuständen vorhanden sind3, nur 0,5% der CD45+-Zellen aus, was eine hohe Wirksamkeit der PBS-Perfusion zeigt. Eine weitere hilfreiche Kontrolle für die Wirksamkeit der PBS-Perfusion könnte der Einbau von Antikörpern gegen Ter119, einen für Erythrozyten spezifischen Marker, sein. Schließlich kann eine zusätzliche Analyse des CP aus PBS-perfundierten Hirnschnitten der Maus durch Immunfärbung und Mikroskopie auch nützlich sein, um zu überprüfen, ob Blutimmunzellen, die stark am Endothel haften, der PBS-Perfusion widerstanden haben und am Lumen des Gefäßsystems haften.
Die myeloische Gating-Strategie ergab zwei Populationen von Makrophagen: CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE+/-BAM und CD11b+ F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- Kolmers Epiplexuszellen, die hohe CD11b- und niedrige Konzentrationen von F4/807 exprimieren. Die Tore von Kolmers Epiplexuszellen7,20 und IA-IE- BAM wurden mit CD11b- und F4/80-Markern nicht klar getrennt. Die Einbeziehung des CD206-Markers in diese Gating-Strategie kann dazu beitragen, CD206+ IA-IE-BAM besser von CD206low Kolmers Epiplexuszellen zu unterscheiden7.
Fast 7% der CP-Immunzellen schienen CD11b + F4 / 80- Ly6C - IA-IE + zu sein. Diese Teilmenge bestand aus zwei Populationen entsprechend ihren CD11b- und CX3CR1-Expressionsniveaus. Diese Zellen entsprechen wahrscheinlich dendritischen Zellen, aber dies muss noch bestätigt werden, indem ihre CD11c-Expression entweder durch FACS3 oder Immunfluoreszenz analysiert wird33. Die CD11b+ F4/80- Ly6C- IA-IE+ Population enthält wahrscheinlich auch Mastzellen. Die Einbeziehung von Antikörpern für den Nachweis von CD117 und c-Kit in die Gating-Strategie würde dazu beitragen, sie von CD11c + dendritischen Zellen zu unterscheiden3,34. Der Anteil der CD45+ CD11b+ F4/80+ Ly6C+ Zellen unter den CP-Immunzellen wurde bestimmt. Sie umfassen jedoch sowohl Monozyten als auch Neutrophile, und die Hinzufügung des Ly6G-Markers zur Gating-Strategie von CD45 + CD11b + F4 / 80 + Ly6C + -Zellen würde das Verhältnis von Ly6G-Monozyten zu Ly6G + -Neutrophilen bestimmen. Über die beschriebene CD45+ CD11b- TCRβ+ Population hinaus kann die Gating-Strategie für CD45+ CD11b- Populationen mit NK1.1- und CD11c-Markern zur Identifizierung von NK-Zellen, TCRγδ zur Analyse von γδ-T-Zellen, CD19 und/oder B220 zur Charakterisierung von B-Zellen und CD138 zur Identifizierung von Plasmazellen angereichert werden3. Die Expression von Reportergenen kann ebenfalls in diese Analyse einbezogen werden. Zum Beispiel könnte die Verwendung von Foxp3-GFP-transgenen Mäusen hilfreich sein, um CP-residente T-regulatorische (Treg) Zellen zu identifizieren3,30. Schließlich kann dieses Protokoll auch die intrazelluläre Färbung von Transkriptionsfaktoren oder Zytokinen beinhalten21.
Während die Immunzellen des Gehirnparenchyms umfassend untersucht wurden, ist viel weniger über Immunzellen bekannt, die Gehirnbarrieren bevölkern, wie das CP3,35,36. CP bei Mäusen sind kleine Gewebe, die sich in vier verschiedenen Bereichen des Gehirns befinden, und ihre Isolierung erfordert eine ziemlich komplexe Mikrodissektion. Aus diesem Grund wurden die CP meist mit Hilfe der Bildgebung untersucht. Die Färbung von CP-Immunzellen aus ganzem CP-seziertem Gewebe oder aus Hirnschnitten mit anschließender mikroskopischer Analyse brachte große Fortschritte beim Verständnis der CP-Immunmechanismen14,15,21,22,26,27,29,30,33 . Diese Methode erlaubt jedoch keine umfassende Analyse der CP-Immunzelldiversität, da nur vier bis sechs Marker gleichzeitig analysiert werden können. Darüber hinaus sind einige Subpopulationen wie CD4 + - oder CD8 + T-Zellen am CP ziemlich selten, und die quantitative Analyse ihrer Phänotypen mit Mikroskopie wäre eine Herausforderung. Der Durchflusszytometrie-Ansatz ermöglicht die parallele Analyse von Dutzenden von Markern für jede Immunzelle und bietet ein besser geeignetes Werkzeug für die quantitative Beurteilung der CP-Immunzusammensetzung.
In jüngerer Zeit hat sich die transkriptomische Einzelkerntechnologie (snRNA-seq) als leistungsfähige Methode zur Untersuchung der CP-Heterogenität herausgestellt10,28. Es ist jedoch nicht gut geeignet für die Analyse von CP-Immunzellen, da sie nur einen kleinen Bruchteil der CP-Zellen ausmachen. Da snRNA-seq die Zellen in dem Verhältnis abtastet, in dem sie im Gewebe vorhanden sind, sind die Immunzellen im snRNA-seq unterrepräsentiert, und ihre geringe Anzahl stellt ein Hindernis für eine eingehende Analyse dar10,28.
Die Einzelzell-Transkriptomik (scRNA-seq) wurde kürzlich angewendet, um die Immunzellheterogenität isolierter CP-Immunzellen präzise abzubilden7. Während die Durchführung von scRNA-seq recht komplex und kostspielig ist, kann die Durchflusszytometrie als eine zugänglichere Möglichkeit zur Untersuchung von Immunsubpopulationen am CP dienen. Schließlich kann dieses Protokoll als Teil eines Zellsortierungsprotokolls dienen, bei dem die ausgewählten Subtypen von Zellen mit FACS für die Analyse mit molekularen Methoden wie scRNA-seq oder Bulk-RNA-Analyse sortiert werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Wir danken dem Institut Pasteur Animalerie Centrale und den Mitgliedern der CB-UTechS-Einrichtung für ihre Hilfe. Diese Arbeit wurde vom Institut Pasteur finanziell unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Flow cytometry antibody |
| Albumin, bovine | MP Biomedicals | 160069 | Blocking reagent |
| APC anti-mouse CX3CR1 | BioLegend | 149008 | Flow cytometry antibody |
| APC anti-mouse TCRb | BioLegend | 109212 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100414 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse IA-IE | BioLegend | 107628 | Flow cytometry antibody |
| BD FACSymphony A5 Cell Analyzer | BD Biosciences | Flow cytometry analyzer | |
| BV711 anti-mouse Ly6C | BioLegend | 128037 | Flow cytometry antibody |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | Enzyme to dissociate CP tissue |
| DAPI | Thermo Scientific | 62248 | Live/dead marker |
| EDTA | Ion chelator | ||
| fine scissors | FST | 14058-11 | Dissection tool |
| FITC anti-mouse CD45 | BioLegend | 103108 | Flow cytometry antibody |
| Flow controller infusion inset | CareFusion | RG-3-C | Blood perfusion inset |
| FlowJo software | BD Biosciences | Analysis software | |
| forceps | FST | 11018-12 | Dissection tool |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Anticoagulant |
| Imalgene | Boehringer Ingelheim | Ketamine, anesthesic | |
| OneComp eBeads | Invitrogen | 01-1111-42 | Control beads to realize compensation |
| PBS-/- | Gibco | 14190-094 | Buffer |
| PBS+/+ | Gibco | 14040-091 | Buffer |
| PE anti-mouse CD8a | BioLegend | 100708 | Flow cytometry antibody |
| PE anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123110 | Flow cytometry antibody |
| PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101256 | Flow cytometry antibody |
| Rompun | Bayer | Xylazine, anesthesic | |
| thin forceps | Dumoxel Biology | 11242-40 | Dissection tool |
| Vetergesic | Ceva | Buprenorphin, analgesic |
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