माइक्रो-विच्छेदित माउस Choroid Plexuses से प्रतिरक्षा कोशिकाओं का अलगाव और लक्षण वर्णन
Summary
यह अध्ययन प्रवाह साइटोमेट्री और अलग-अलग चूहों के मस्तिष्क कोरॉइड प्लेक्सस पर दो अलग-अलग गेटिंग रणनीतियों का उपयोग करता है; यह प्रोटोकॉल मुख्य प्रतिरक्षा सेल सबसेट की पहचान करता है जो इस मस्तिष्क संरचना को पॉप्युलेट करते हैं।
Abstract
मस्तिष्क को अब अलगाव में काम करने वाले अंग के रूप में नहीं माना जाता है; संचित साक्ष्य से पता चलता है कि परिधीय प्रतिरक्षा प्रणाली में परिवर्तन अप्रत्यक्ष रूप से मस्तिष्क समारोह को आकार दे सकते हैं। मस्तिष्क और प्रणालीगत परिसंचरण के बीच इंटरफ़ेस पर, कोरॉइड प्लेक्सस (सीपी), जो रक्त-मस्तिष्कमेरु द्रव बाधा का गठन करते हैं, को परिधि-से-मस्तिष्क संचार की एक प्रमुख साइट के रूप में हाइलाइट किया गया है। सीपी मस्तिष्कमेरु द्रव, न्यूरोट्रॉफिक कारकों और सिग्नलिंग अणुओं का उत्पादन करता है जो मस्तिष्क होमोस्टैसिस को आकार दे सकते हैं। सीपी भी एक सक्रिय immunological आला रहे हैं. मस्तिष्क पैरेन्काइमा के विपरीत, जो मुख्य रूप से शारीरिक परिस्थितियों में माइक्रोग्लिया द्वारा आबाद होता है, सीपी प्रतिरक्षा कोशिकाओं की विषमता अन्य परिधीय अंगों में पाई जाने वाली विविधता को दोहराती है। सीपी प्रतिरक्षा कोशिका विविधता और गतिविधि उम्र बढ़ने, तनाव और बीमारी के साथ बदलती है और सीपी उपकला की गतिविधि को संशोधित करती है, जिससे अप्रत्यक्ष रूप से मस्तिष्क समारोह को आकार दिया जाता है। इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य मुरीन सीपी को अलग करना और मुख्य प्रतिरक्षा सबसेट के लगभग 90% की पहचान करना है जो उन्हें पॉप्युलेट करते हैं। यह विधि सीपी प्रतिरक्षा कोशिकाओं को चिह्नित करने और परिधि-से-मस्तिष्क संचार को व्यवस्थित करने में उनके कार्य को समझने के लिए एक उपकरण है। प्रस्तावित प्रोटोकॉल यह समझने में मदद कर सकता है कि सीपी प्रतिरक्षा कोशिकाएं अप्रत्यक्ष रूप से स्वास्थ्य में और विभिन्न रोग स्थितियों में मस्तिष्क समारोह को कैसे संशोधित करती हैं।
Introduction
19 वीं शताब्दी के अंत में पॉल एर्हलिच द्वारा रक्त-मस्तिष्क बाधा की खोज के बाद से, मस्तिष्क को अन्य अंगों और रक्तप्रवाह से वस्तुतः अलग माना जाता है। फिर भी, इस पिछले दशक ने इस अवधारणा के उद्भव को देखा है कि मस्तिष्क समारोह विभिन्न जैविक कारकों द्वारा आकार दिया जाता है, जैसे कि आंत माइक्रोबायोटा और प्रणालीगत प्रतिरक्षा कोशिकाएं और सिग्नल 1,2,3,4। समानांतर में, मेनिन्जेस और कोरॉइड प्लेक्सस (सीपी) जैसे अन्य मस्तिष्क सीमाओं को निष्क्रिय बाधा ऊतक5,6,7,8 के बजाय सक्रिय प्रतिरक्षा-मस्तिष्क क्रॉस टॉक के इंटरफेस के रूप में पहचाना गया है।
सीपी रक्त-मस्तिष्कमेरु द्रव बाधा का गठन करता है, मस्तिष्क और परिधि को अलग करने वाली सीमाओं में से एक। वे मस्तिष्क के चार वेंट्रिकल्स में से प्रत्येक में स्थित हैं, यानी, तीसरा, चौथा, और दोनों पार्श्व वेंट्रिकल्स, और न्यूरोजेनेसिस में शामिल क्षेत्रों जैसे कि सबवेंट्रिकुलर ज़ोन और हिप्पोकैम्पस 3 के सबग्रेन्युलर ज़ोन से सटे हुए हैं। संरचनात्मक रूप से, सीपी उपकला कोशिकाओं के एक मोनोलेयर द्वारा संलग्न फेनेस्टेड रक्त केशिकाओं के एक नेटवर्क से बना होता है, जो तंग और अनुपालन जंक्शनों 9,10 द्वारा परस्पर जुड़े होते हैं। सीपी एपिथेलियम की प्रमुख शारीरिक भूमिकाओं में मस्तिष्कमेरु द्रव का उत्पादन शामिल है, जो मस्तिष्क को अपशिष्ट चयापचयों और प्रोटीन समुच्चय से फ्लश करता है, और हार्मोन और न्यूरोट्रॉफिक कारकों सहित विभिन्न सिग्नलिंग अणुओं के उत्पादन और नियंत्रित रक्त-से-मस्तिष्क मार्ग 11,12,13। सीपी आकार मस्तिष्क की गतिविधि से स्रावित अणु, यानी, न्यूरोजेनेसिस और माइक्रोग्लियल फ़ंक्शन को संशोधित करके 14,15,16,17,18,19, जो सीपी को मस्तिष्क होमियोस्टैसिस के लिए महत्वपूर्ण बनाता है। सीपी भी विभिन्न प्रतिरक्षा गतिविधियों में संलग्न हैं; जबकि गैर-पैथोलॉजिकल स्थितियों के तहत मस्तिष्क पैरेन्काइमा में मुख्य प्रतिरक्षा सेल प्रकार माइक्रोग्लिया है, सीपी प्रतिरक्षा कोशिका आबादी की विविधता परिधीय अंगों 3,7 के रूप में व्यापक है, यह सुझाव देते हुए कि प्रतिरक्षा विनियमन और सिग्नलिंग के विभिन्न चैनल सीपी पर काम कर रहे हैं।
एंडोथेलियल और उपकला कोशिकाओं के बीच की जगह, सीपी स्ट्रोमा, मुख्य रूप से सीमा से जुड़े मैक्रोफेज (बीएएम) द्वारा आबाद है, जो भड़काऊ संकेतों के जवाब में एंटीजन प्रस्तुति से संबंधित प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स और अणुओं को व्यक्त करते हैं3। मैक्रोफेज का एक अन्य उपप्रकार, कोलमर की एपिप्लेक्सस कोशिकाएं, सीपी एपिथेलियम 20 की एपिकल सतह पर मौजूद हैं। सीपी स्ट्रोमा डेंड्राइटिक कोशिकाओं, बी कोशिकाओं, मस्तूल कोशिकाओं, बेसोफिल, न्यूट्रोफिल, जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाओं और टी कोशिकाओं के लिए भी एक आला है जो ज्यादातर प्रभावकारी स्मृति टी कोशिकाएं हैं जो केंद्रीय तंत्रिका तंत्र एंटीजन 7,21,22,23,24 को पहचानने में सक्षम हैं। इसके अलावा, सीपी पर प्रतिरक्षा कोशिका आबादी की संरचना और गतिविधि प्रणालीगत या मस्तिष्क की गड़बड़ी पर बदलजाती है, उदाहरण के लिए, उम्र बढ़ने के दौरान 10,14,15,21,25, माइक्रोबायोटा गड़बड़ी 7, तनाव 26, और रोग 27,28। विशेष रूप से, इन परिवर्तनों को अप्रत्यक्ष रूप से मस्तिष्क समारोह को आकार देने का सुझाव दिया गया था, यानी, Th2 सूजन की ओर CP CD4 + T कोशिकाओं का एक बदलाव मस्तिष्क की उम्र बढ़ने में होता है और CP से प्रतिरक्षा सिग्नलिंग को ट्रिगर करता है जो उम्र बढ़ने से जुड़े संज्ञानात्मक गिरावट को आकार दे सकता है14,15,21,25,29 . सीपी प्रतिरक्षा कोशिकाओं के गुणों को रोशन करना इस प्रकार सीपी उपकला शरीर विज्ञान और स्राव पर उनके नियामक कार्य को बेहतर ढंग से समझने के लिए महत्वपूर्ण होगा और इस प्रकार स्वस्थ और रोग की स्थिति में मस्तिष्क समारोह पर उनके अप्रत्यक्ष प्रभाव को समझना होगा।
सीपी छोटी संरचनाएं हैं जिनमें केवल कुछ प्रतिरक्षा कोशिकाएं होती हैं। उनके अलगाव को परफ्यूजन के प्रारंभिक चरण के बाद माइक्रोडिसेक्शन की आवश्यकता होती है; रक्तप्रवाह में प्रतिरक्षा कोशिकाएं अन्यथा प्रमुख संदूषकों का गठन करेंगी। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके सीपी के माइलॉयड और टी सेल सबसेट को चिह्नित करना है। यह विधि प्रतिरक्षा कोशिका आबादी के लगभग 90% की पहचान करती है जो गैर-भड़काऊ स्थितियों के तहत माउस सीपी की रचना करती है, हाल ही में प्रकाशित कार्यों के अनुसार प्रतिरक्षा सीपी विषमता को विच्छेदित करने के लिए अन्य तरीकों का उपयोग करके 7,10,28। इस प्रोटोकॉल को विवो में रोग और अन्य प्रयोगात्मक प्रतिमानों के साथ सीपी प्रतिरक्षा सेल डिब्बे में परिवर्तन को चिह्नित करने के लिए लागू किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
मस्तिष्क होमियोस्टैसिस और बीमारी के लिए प्रतिरक्षाविज्ञानी योगदान को समझने के उद्देश्य से किए गए अध्ययनों ने मुख्य रूप से मस्तिष्क पैरेन्काइमा के भीतर रहने वाली कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित किया है, ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम Institute Pasteur Animalerie Centrale और CB-UTechS सुविधा सदस्यों को उनकी मदद के लिए धन्यवाद देते हैं। इस काम को Institute Pasteur द्वारा वित्तीय रूप से समर्थित किया गया था।
Materials
| anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Flow cytometry antibody |
| Albumin, bovine | MP Biomedicals | 160069 | Blocking reagent |
| APC anti-mouse CX3CR1 | BioLegend | 149008 | Flow cytometry antibody |
| APC anti-mouse TCRb | BioLegend | 109212 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100414 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse IA-IE | BioLegend | 107628 | Flow cytometry antibody |
| BD FACSymphony A5 Cell Analyzer | BD Biosciences | Flow cytometry analyzer | |
| BV711 anti-mouse Ly6C | BioLegend | 128037 | Flow cytometry antibody |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | Enzyme to dissociate CP tissue |
| DAPI | Thermo Scientific | 62248 | Live/dead marker |
| EDTA | Ion chelator | ||
| fine scissors | FST | 14058-11 | Dissection tool |
| FITC anti-mouse CD45 | BioLegend | 103108 | Flow cytometry antibody |
| Flow controller infusion inset | CareFusion | RG-3-C | Blood perfusion inset |
| FlowJo software | BD Biosciences | Analysis software | |
| forceps | FST | 11018-12 | Dissection tool |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Anticoagulant |
| Imalgene | Boehringer Ingelheim | Ketamine, anesthesic | |
| OneComp eBeads | Invitrogen | 01-1111-42 | Control beads to realize compensation |
| PBS-/- | Gibco | 14190-094 | Buffer |
| PBS+/+ | Gibco | 14040-091 | Buffer |
| PE anti-mouse CD8a | BioLegend | 100708 | Flow cytometry antibody |
| PE anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123110 | Flow cytometry antibody |
| PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101256 | Flow cytometry antibody |
| Rompun | Bayer | Xylazine, anesthesic | |
| thin forceps | Dumoxel Biology | 11242-40 | Dissection tool |
| Vetergesic | Ceva | Buprenorphin, analgesic |
References
- Morais, L. H., Schreiber, H. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
- Deczkowska, A., Schwartz, M. Targeting neuro-immune communication in neurodegeneration: Challenges and opportunities. Journal of Experimental Medicine. 215 (11), 2702-2704 (2018).
- Croese, T., Castellani, G., Schwartz, M. Immune cell compartmentalization for brain surveillance and protection. Nature Immunology. 22 (9), 1083-1092 (2021).
- Erny, D., et al. Host microbiota constantly control maturation and function of microglia in the CNS. Nature Neuroscience. 18 (7), 965-977 (2015).
- Mrdjen, D., et al. High-dimensional single-cell mapping of central nervous system immune cells reveals distinct myeloid subsets in health, aging, and disease. Immunity. 48 (2), 380-395 (2018).
- Korin, B., et al. single-cell characterization of the brain’s immune compartment. Nature Neuroscience. 20 (9), 1300-1309 (2017).
- van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
- Ajami, B., et al. Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models. Nature Neuroscience. 21 (4), 541-551 (2018).
- Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: Biology and pathology. Acta Neuropathologica. 119 (1), 75-88 (2010).
- Dani, N., et al. A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages. Cell. 184 (11), 3056-3074 (2021).
- Falcão, A. M., Marques, F., Novais, A., Sousa, N., Palha, J. A., Sousa, J. C. The path from the choroid plexus to the subventricular zone: Go with the flow. Frontiers in Cellular Neuroscience. 6, (2012).
- Shipley, F. B., et al. Tracking calcium dynamics and immune surveillance at the choroid plexus blood-cerebrospinal fluid interface. Neuron. 108 (4), 623-639 (2020).
- Mazucanti, C. H., et al. Release of insulin produced by the choroids plexis is regulated by serotonergic signaling. JCI Insight. 4 (23), (2019).
- Baruch, K., et al. Aging-induced type I interferon response at the choroid plexus negatively affects brain function. Science. 346 (6205), 89-93 (2014).
- Deczkowska, A., et al. Mef2C restrains microglial inflammatory response and is lost in brain ageing in an IFN-I-dependent manner. Nature Communications. 8 (1), (2017).
- Silva-Vargas, V., Maldonado-Soto, A. R., Mizrak, D., Codega, P., Doetsch, F. Age-dependent niche signals from the choroid plexus regulate adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 19 (5), 643-652 (2016).
- Iliff, J. J., et al. Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury. Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).
- Redzic, Z. B., Preston, J. E., Duncan, J. A., Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. The choroid plexus-cerebrospinal fluid system: From development to aging. Current Topics in Developmental Biology. 71, 1-52 (2005).
- da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer’s disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
- Schwarze, E. -. W. The origin of (Kolmer’s) epiplexus cells. Histochemistry. 44 (1), 103-104 (1975).
- Baruch, K., et al. CNS-specific immunity at the choroid plexus shifts toward destructive Th2 inflammation in brain aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (6), 2264-2269 (2013).
- Kunis, G., et al. IFN-γ-dependent activation of the brain’s choroid plexus for CNS immune surveillance and repair. Brain. 136 (11), 3427-3440 (2013).
- Prinz, M., Priller, J. Microglia and brain macrophages in the molecular age: From origin to neuropsychiatric disease. Nature Reviews Neuroscience. 15 (5), 300-312 (2014).
- Goldmann, T., et al. fate and dynamics of macrophages at central nervous system interfaces. Nature Immunology. 17 (7), 797-805 (2016).
- Fung, I. T. H., et al. Activation of group 2 innate lymphoid cells alleviates aging-associated cognitive decline. Journal of Experimental Medicine. 217 (4), (2020).
- Kertser, A., et al. Corticosteroid signaling at the brain-immune interface impedes coping with severe psychological stress. Science Advances. 5, 4111 (2019).
- Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
- Yang, A. C., et al. Dysregulation of brain and choroid plexus cell types in severe COVID-19. Nature. 595 (7868), 565-571 (2021).
- Baruch, K., et al. PD-1 immune checkpoint blockade reduces pathology and improves memory in mouse models of Alzheimer’s disease. Nature Medicine. 22 (2), 135-137 (2016).
- Baruch, K., et al. Breaking immune tolerance by targeting Foxp3+ regulatory T cells mitigates Alzheimer’s disease pathology. Nature Communications. 6, 7967 (2015).
- Rodríguez-Rodríguez, N., Flores-Mendoza, G., Apostolidis, S. A., Rosetti, F., Tsokos, G. C., Crispín, J. C. TCR-α/β CD4 − CD8 − double negative T cells arise from CD8 + T cells. Journal of Leukocyte Biology. 108 (3), 851-857 (2020).
- Schafflick, D., et al. Single-cell profiling of CNS border compartment leukocytes reveals that B cells and their progenitors reside in non-diseased meninges. Nature Neuroscience. 24 (9), 1225-1234 (2021).
- Quintana, E., et al. DNGR-1+ dendritic cells are located in meningeal membrane and choroid plexus of the noninjured brain. GLIA. 63 (12), 2231-2248 (2015).
- Kabashima, K., et al. Biomarkers for evaluation of mast cell and basophil activation. Immunological Reviews. 282 (1), 114-120 (2018).
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Borst, K., Dumas, A. A., Prinz, M. Microglia: Immune and non-immune functions. Immunity. 54 (10), 2194-2208 (2021).
