Een celtraceringsinjectie gebruiken om de oorsprong van neointimavormende cellen in een sacculair zijwandmodel van een rat te onderzoeken
Summary
We voerden een éénpunts, lipofiele cel-tracer-injectie uit om endotheelcellen te volgen, gevolgd door een arteriotomie en hechting van zijwandaneurysma’s op de abdominale rataorta. Neointima-vorming leek afhankelijk van de bovenliggende slagader in gedecellulariseerde aneurysmata en werd bevorderd door de rekrutering uit aneurysmawandcellen in vitale celrijke wanden.
Abstract
Microchirurgisch knippen creëert een daaropvolgende barrière van bloedtoevoer naar intracraniale aneurysma’s, terwijl endovasculaire behandeling afhankelijk is van neointima- en trombusvorming. De bron van endotheelcellen die de endoluminale laag van de neointima bedekken, blijft onduidelijk. Daarom was het doel van deze studie om de oorsprong van neo-intima-vormende cellen na celtracerinjectie te onderzoeken in het reeds gevestigde Helsinki rat microchirurgische zijwandaneurysmamodel.
Zijwandaneurysma’s werden gemaakt door gedecellulariseerde of vitale arteriële zakjes end-to-side aan de aorta te hechten bij mannelijke Lewis-ratten. Vóór arteriotomie met aneurysma-hechting werd een cel-traceretinjectie met CM-Dil-kleurstof uitgevoerd in de geklemde aorta om endotheelcellen in het aangrenzende vat te labelen en hun proliferatie tijdens follow-up (FU) te volgen. Behandeling gevolgd door coiling (n = 16) of stenting (n = 15). Bij FU (7 dagen of 21 dagen) ondergingen alle ratten fluorescentieangiografie, gevolgd door aneurysma-oogst en macroscopische en histologische evaluatie met immunohistologische celtellingen voor specifieke interessegebieden.
Geen van de 31 aneurysma’s was gescheurd bij follow-up. Vier dieren stierven vroegtijdig. Macroscopisch residuele perfusie werd waargenomen bij 75,0% opgerold en 7,0% van de gestenteerde ratten. De hoeveelheid cel-tracer-positieve cellen was significant verhoogd in gedecellulariseerde stents in vergelijking met opgerolde aneurysma’s met betrekking tot trombus op dag 7 (p = 0,01) en neointima op dag 21 (p = 0,04). Er werden geen significante verschillen gevonden in trombus of neointima in vitale aneurysma’s.
Deze bevindingen bevestigen slechtere genezingspatronen in opgerolde in vergelijking met gestenteerde aneurysma’s. Neointima-vorming lijkt vooral afhankelijk van de bovenwortel in gedecellulariseerde aneurysma’s, terwijl het wordt ondersteund door de rekrutering van aneurysmawandcellen in vitale celrijke wanden. In termen van vertaling kan stentbehandeling meer geschikt zijn voor sterk gedegenereerde aneurysma’s, terwijl coiling alleen voldoende kan zijn voor aneurysma’s met meestal gezonde vaatwanden.
Introduction
Subarachnoïdale bloeding veroorzaakt door de breuk van een intracranieel aneurysma (IA) is een verwoestende neurochirurgische aandoening geassocieerd met hoge morbiditeit en mortaliteit 1,2,3,4. Naast microchirurgisch knippen, dat direct endotheel-naar-endotheelcontact biedt, hebben endovasculaire apparaten de afgelopen decennia steeds belangrijker geworden voor de behandeling van gescheurde en incidenteel ontdekte IA’s. De genezingsreactie bij endovasculair behandelde IA’s hangt voornamelijk af van neointimavorming en trombusorganisatie. Beide zijn synergetische processen, afhankelijk van de celmigratie van het aangrenzende vat en de aneurysmawand. 5 Tot op heden blijft de oorsprong van endotheelcellen in neo-intimavorming van endovasculair behandelde aneurysma’s onduidelijk. Er is een voortdurend debat in de literatuur over de bron waaruit neo-intima-vormende cellen worden gerekruteerd.
Door gebruik te maken van een cel-tracer injectie van CM-Dil kleurstof (zie de Tabel van Materialen) in de abdominale aorta van ratten, wilden we de rol van endotheelcellen, afkomstig uit de ouderslagader, in neointimavorming op twee verschillende FU-tijdstippen (dag 7 en dag 21) analyseren (figuur 1). Een voordeel van het model is de directe lokale cel-tracer incubatie in vivo in een bovenliggende slagader voorafgaand aan de aneurysma hechting, waardoor FU op latere tijdstippen mogelijk is. In vivo injectietechnieken, zoals cell-tracer incubatie, zijn niet beschreven in de literatuur. Een voordeel van deze techniek is de directe, éénpunts, intraoperatieve, in vivo injectie, die het model robuust en reproduceerbaar maakt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze studie toont aan dat neo-intimavorming wordt gemedieerd via endotheelcellen afkomstig uit de bovenwortel van het aneurysmacomplex, maar wordt ondersteund door de rekrutering van cellen afgeleid van de aneurysmawand in vitale aneurysma’s. Niettemin blijft de rol van circulerende voorlopercellen bij de genezing van aneurysma’s controversieel12,13. In totaal werden 31 mannelijke Lewis-ratten in dit onderzoek opgenomen; slechts 4 stierven vroegtijdig (12,9% ster…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Alessandra Bergadano, DVM, PhD, voor de toegewijde supervisie op de gezondheid van dieren op de lange termijn. Dit werk werd ondersteund door de onderzoeksfondsen van de Research Council, Kantonsspital Aarau, Aarau, Zwitserland, en de Zwitserse nationale wetenschappelijke stichting SNF (310030_182450).
Materials
| 3-0 resorbable suture | Ethicon Inc., USA | VCP428G | |
| 4-0 non-absorbable suture | B. Braun, Germany | G0762563 | |
| 6-0 non-absorbable suture | B. Braun, Germany | C0766070 | |
| 9-0 non-absorbable suture | B. Braun, Germany | G1111140 | |
| Atipamezol | Arovet AG, Switzerland | ||
| Bandpass filter blue | Thorlabs | FD1B | any other |
| Bandpass filter green | Thorlabs | FGV9 | any other |
| Bipolar forceps | any other | ||
| Bicycle spotlight | any other | ||
| Board (20 x 10 cm) | any other | ||
| Buprenorphine | Indivior, Switzerland | 1014197 | |
| Camera | Sony NEX-5R, Sony, Tokyo, Japan | ||
| Cannula (27-1/2 G) | any other | ||
| Cell count software | Image-J version 1.52n, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| CellTracker CM-Dil dye | ThermoFisher SCIENTIFIC, USA | C7000 | |
| Coil-Device | Styker, Kalamazoo, MI, USA | 2 cm of Target 360 TM Ultra, 2-mm diameter | |
| Desinfection | any other | ||
| Eye-lubricant | any other | ||
| Fentanyl | Sintetica, S.A., Switzerland | 98683 | any generic |
| Flumazenil | Labatec-Pharma, Switerzland | ||
| Fluoresceine | Curatis AG | 5030376 | any generic |
| Fluorescence microscope | Olympus BX51, Hamburg, Germany; Cell Sens Dimension Imaging software v1.8 | ||
| Foil mask | any other | ||
| Glucose (5%) | any other | ||
| Heating pad | Homeothermic Control Unit, Harvard, Edenbridge, England | any other | |
| Isotonic sodium chloride solution (0.9%) | Fresenius KABI | 336769 | any generic |
| Isoflurane | any generic | ||
| Longuettes | any other | ||
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | P7626406 | any generic |
| Medetomidine | Virbac, Switzerland | QN05CM91 | |
| Micro needle holder | any other | ||
| Midazolam | Roche, Switzerland | ||
| Monitoring-system | Starr Life Sciences Corp., 333 Allegheny Ave, Oakmont, PA 15139, United States | ||
| Needle holder | any other | ||
| O2-Face mask | any other | ||
| Operation microscope | OPMI, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | any other | |
| Oxygen | any other | ||
| Rectal temperature probe | any other | ||
| Scalpell | Swann-Morton | 210 | any other |
| Small animal shaver | any other | ||
| Smartphone | any other | ||
| Sodium dodecyl sulfate (0.1%) | Sigma-Aldrich | 11667289001 | |
| Soft feed | Emeraid Omnivore | any generic | |
| Soft tissue forceps | any other | ||
| Soft tissue spreader | any other | ||
| Stainless steel sponge bowls | any other | ||
| Stent-Device | Biotroni, Bülach, Switzerland | modified magmaris device, AMS with polymer coating, 6-mm length, 2-mm diameter | |
| Sterile micro swabs | any other | ||
| Straight and curved microforceps | any other | ||
| Straight and curved microscissors | any other | ||
| Straight and curved forceps | any other | ||
| Surgery drape | any other | ||
| Surgical scissors | any other | ||
| Syringes 1 mL, 2 mL, and 5 mL | any other | ||
| Tape | any other | ||
| Vascular clip applicator | B. Braun, Germany | FT495T | |
| Yasargil titan standard clip (2x) | B. Braun Medical AG, Aesculap, Switzerland | FT242T | temporary |
References
- Vergouwen, M. D., et al. Definition of delayed cerebral ischemia after aneurysmal subarachnoid hemorrhage as an outcome event in clinical trials and observational studies: proposal of a multidisciplinary research group. Stroke. 41 (10), 2391-2395 (2010).
- Macdonald, R. L., et al. Preventing vasospasm improves outcome after aneurysmal subarachnoid hemorrhage: rationale and design of CONSCIOUS-2 and CONSCIOUS-3 trials. Neurocritical Care. 13 (3), 416-424 (2010).
- Wanderer, S., et al. Levosimendan as a therapeutic strategy to prevent neuroinflammation after aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Journal of Neurointerventional Surgery. , (2021).
- Wanderer, S., et al. Aspirin treatment prevents inflammation in experimental bifurcation aneurysms in New Zealand White rabbits. Journal of Neurointerventional Surgery. 14 (2), 189-195 (2021).
- Gruter, B. E., et al. Patterns of neointima formation after coil or stent treatment in a rat saccular sidewall aneurysm model. Stroke. 52 (3), 1043-1052 (2021).
- Kilkenny, C., et al. Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines. British Journal of Pharmacology. 160 (7), 1577-1579 (2010).
- Tornqvist, E., et al. Strategic focus on 3R principles reveals major reductions in the use of animals in pharmaceutical toxicity testing. PLoS One. 9 (7), 101638 (2014).
- Nevzati, E., et al. Aneurysm wall cellularity affects healing after coil embolization: assessment in a rat saccular aneurysm model. Journal of Neurointerventional Surgery. 12 (6), 621-625 (2020).
- Marbacher, S., et al. The Helsinki rat microsurgical sidewall aneurysm model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51071 (2014).
- Nevzati, E., et al. Biodegradable magnesium stent treatment of saccular aneurysms in a rt model – introduction of the surgical technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56359 (2017).
- Gruter, B. E., et al. Testing bioresorbable stent feasibility in a rat aneurysm model. Journal of Neurointerventional Surgery. 11 (10), 1050-1054 (2019).
- Kadirvel, R., et al. Cellular mechanisms of aneurysm occlusion after treatment with a flow diverter. Radiology. 270 (2), 394-399 (2014).
- Li, Z. F., et al. Endothelial progenitor cells contribute to neointima formation in rabbit elastase-induced aneurysm after flow diverter treatment. CNS Neuroscience & Therapeutics. 19 (5), 352-357 (2013).
- Marbacher, S., et al. Intraluminal cell transplantation prevents growth and rupture in a model of rupture-prone saccular aneurysms. Stroke. 45 (12), 3684-3690 (2014).
- Frosen, J., et al. Contribution of mural and bone marrow-derived neointimal cells to thrombus organization and wall remodeling in a microsurgical murine saccular aneurysm model. Neurosurgery. 58 (5), 936-944 (2006).
- Marbacher, S., Niemela, M., Hernesniemi, J., Frosen, J. Recurrence of endovascularly and microsurgically treated intracranial aneurysms-review of the putative role of aneurysm wall biology. Neurosurgical Review. 42 (1), 49-58 (2019).
- Frosen, J. Smooth muscle cells and the formation, degeneration, and rupture of saccular intracranial aneurysm wall–a review of current pathophysiological knowledge. Translational Stroke Research. 5 (3), 347-356 (2014).
- Fang, X., et al. Bone marrow-derived endothelial progenitor cells are involved in aneurysm repair in rabbits. Journal of Clinical Neuroscience. 19 (9), 1283-1286 (2012).
- Morel, S., et al. Sex-related differences in wall remodeling and intraluminal thrombus resolution in a rat saccular aneurysm model. Journal of Neurosurgery. , 1-14 (2019).
- Gruter, B. E., et al. Fluorescence video angiography for evaluation of dynamic perfusion status in an aneurysm preclinical experimental setting. Operative Neurosurgery. 17 (4), 432-438 (2019).
- Marbacher, S., Strange, F., Frosen, J., Fandino, J. Preclinical extracranial aneurysm models for the study and treatment of brain aneurysms: A systematic review. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (5), 922-938 (2020).
- Ravindran, K., et al. Mechanism of action and biology of flow diverters in the treatment of intracranial aneurysms. Neurosurgery. 86, 13-19 (2020).
- Marbacher, S., et al. Loss of mural cells leads to wall degeneration, aneurysm growth, and eventual rupture in a rat aneurysm model. Stroke. 45 (1), 248-254 (2014).
- Morosanu, C. O., et al. Neurosurgical cadaveric and in vivo large animal training models for cranial and spinal approaches and techniques – systematic review of current literature. Neurologia i Neurochirurgia Polska. 53 (1), 8-17 (2019).
- Wanderer, S., et al. Arterial pouch microsurgical bifurcation aneurysm model in the rabbit. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61157 (2020).
