Utilizzo di un'iniezione cell-tracer per studiare l'origine delle cellule che formano neointima in un modello di parete laterale sacculare di ratto
Summary
Abbiamo eseguito un’iniezione di tracciante cellulare lipofila a un punto per tracciare le cellule endoteliali, seguita da un’arteriotomia e sutura degli aneurismi della parete laterale sull’aorta addominale del ratto. La formazione di Neointima sembrava dipendente dall’arteria madre negli aneurismi decellularizzati ed è stata promossa dal reclutamento da cellule della parete dell’aneurisma in pareti vitali ricche di cellule.
Abstract
Il clipping microchirurgico crea una successiva barriera del flusso sanguigno negli aneurismi intracranici, mentre il trattamento endovascolare si basa sulla formazione di neointima e trombo. La fonte delle cellule endoteliali che coprono lo strato endoluminale del neointima rimane poco chiara. Pertanto, lo scopo del presente studio era quello di studiare l’origine delle cellule che formano neointima dopo l’iniezione di tracciante cellulare nel già consolidato modello di aneurisma microchirurgico della parete laterale del ratto di Helsinki.
Gli aneurismi laterali sono stati creati suturando sacche arteriose decellularizzate o vitali end-to-side all’aorta nei ratti Lewis maschi. Prima dell’arteriotomia con sutura dell’aneurisma, è stata eseguita un’iniezione di tracciante cellulare contenente colorante CM-Dil nell’aorta bloccata per etichettare le cellule endoteliali nel vaso adiacente e tracciare la loro proliferazione durante il follow-up (FU). Trattamento seguito da avvolgimento (n = 16) o stenting (n = 15). Al FU (7 giorni o 21 giorni), tutti i ratti sono stati sottoposti ad angiografia a fluorescenza, seguita da raccolta di aneurisma e valutazione macroscopica e istologica con conta cellulare immunoistologica per specifiche regioni di interesse.
Nessuno dei 31 aneurismi si era rotto al follow-up. Quattro animali sono morti prematuramente. La perfusione macroscopicamente residua è stata osservata nel 75,0% dei ratti a spirale e nel 7,0% dei ratti stentati. La quantità di cellule tracer-positive era significativamente elevata negli aneurismi stentati decellularizzati rispetto agli aneurismi a spirale rispetto al trombo il giorno 7 (p = 0,01) e neointima al giorno 21 (p = 0,04). Non sono state riscontrate differenze significative nel trombo o nella neointima negli aneurismi vitali.
Questi risultati confermano modelli di guarigione peggiori in spirale rispetto agli aneurismi stentati. La formazione di Neointima sembra particolarmente dipendente dall’arteria madre negli aneurismi decellularizzati, mentre è supportata dal reclutamento da cellule della parete dell’aneurisma in pareti vitali ricche di cellule. In termini di traduzione, il trattamento con stent potrebbe essere più appropriato per gli aneurismi altamente degenerati, mentre l’avvolgimento da solo potrebbe essere adeguato per gli aneurismi con pareti dei vasi per lo più sane.
Introduction
L’emorragia subaracnoidea causata dalla rottura di un aneurisma intracranico (IA) è una condizione neurochirurgica devastante associata ad alta morbilità e mortalità 1,2,3,4. Oltre al clipping microchirurgico, che fornisce un contatto diretto tra endotelio ed endotelio, i dispositivi endovascolari hanno acquisito un’importanza crescente negli ultimi decenni per il trattamento delle IA rotte e scoperte incidentalmente. La risposta di guarigione nelle IA trattate endovascolarmente dipende principalmente dalla formazione di neointima e dall’organizzazione del trombo. Entrambi sono processi sinergici, a seconda della migrazione cellulare dal vaso adiacente e dalla parete dell’aneurisma. 5 Ad oggi, l’origine delle cellule endoteliali nella formazione neointima degli aneurismi trattati endovascolari rimane poco chiara. C’è un dibattito in corso in letteratura sulla fonte da cui vengono reclutate le cellule che formano neointima.
Utilizzando un’iniezione cell-tracer di colorante CM-Dil (vedi tabella dei materiali) nell’aorta addominale dei ratti, abbiamo mirato ad analizzare il ruolo delle cellule endoteliali, originarie dell’arteria madre, nella formazione di neointima in due diversi punti temporali FU (giorno 7 e giorno 21) (Figura 1). Un vantaggio del modello è l’incubazione diretta del tracciante cellulare locale in vivo in un’arteria genitore prima della sutura dell’aneurisma, consentendo la FU in punti temporali successivi. Le tecniche di iniezione in vivo , come l’incubazione cell-tracer, non sono state descritte in letteratura. Un vantaggio di questa tecnica è l’iniezione diretta, a un punto, intraoperatoria, in vivo , che rende il modello robusto e riproducibile.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo studio dimostra che la formazione di neointima è mediata da cellule endoteliali originarie dell’arteria madre del complesso dell’aneurisma, ma è supportata dal reclutamento di cellule derivate dalla parete dell’aneurisma negli aneurismi vitali. Tuttavia, il ruolo delle cellule progenitrici circolanti nella guarigione dell’aneurisma rimane controverso12,13. Complessivamente, 31 ratti Lewis maschi sono stati inclusi in questa indagine; solo 4 morirono prem…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Alessandra Bergadano, DVM, PhD, per la supervisione dedicata alla salute animale a lungo termine. Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi di ricerca del Consiglio della ricerca, Kantonsspital Aarau, Aarau, Svizzera, e dal Fondo nazionale svizzero per la scienza FNS (310030_182450).
Materials
| 3-0 resorbable suture | Ethicon Inc., USA | VCP428G | |
| 4-0 non-absorbable suture | B. Braun, Germany | G0762563 | |
| 6-0 non-absorbable suture | B. Braun, Germany | C0766070 | |
| 9-0 non-absorbable suture | B. Braun, Germany | G1111140 | |
| Atipamezol | Arovet AG, Switzerland | ||
| Bandpass filter blue | Thorlabs | FD1B | any other |
| Bandpass filter green | Thorlabs | FGV9 | any other |
| Bipolar forceps | any other | ||
| Bicycle spotlight | any other | ||
| Board (20 x 10 cm) | any other | ||
| Buprenorphine | Indivior, Switzerland | 1014197 | |
| Camera | Sony NEX-5R, Sony, Tokyo, Japan | ||
| Cannula (27-1/2 G) | any other | ||
| Cell count software | Image-J version 1.52n, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| CellTracker CM-Dil dye | ThermoFisher SCIENTIFIC, USA | C7000 | |
| Coil-Device | Styker, Kalamazoo, MI, USA | 2 cm of Target 360 TM Ultra, 2-mm diameter | |
| Desinfection | any other | ||
| Eye-lubricant | any other | ||
| Fentanyl | Sintetica, S.A., Switzerland | 98683 | any generic |
| Flumazenil | Labatec-Pharma, Switerzland | ||
| Fluoresceine | Curatis AG | 5030376 | any generic |
| Fluorescence microscope | Olympus BX51, Hamburg, Germany; Cell Sens Dimension Imaging software v1.8 | ||
| Foil mask | any other | ||
| Glucose (5%) | any other | ||
| Heating pad | Homeothermic Control Unit, Harvard, Edenbridge, England | any other | |
| Isotonic sodium chloride solution (0.9%) | Fresenius KABI | 336769 | any generic |
| Isoflurane | any generic | ||
| Longuettes | any other | ||
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | P7626406 | any generic |
| Medetomidine | Virbac, Switzerland | QN05CM91 | |
| Micro needle holder | any other | ||
| Midazolam | Roche, Switzerland | ||
| Monitoring-system | Starr Life Sciences Corp., 333 Allegheny Ave, Oakmont, PA 15139, United States | ||
| Needle holder | any other | ||
| O2-Face mask | any other | ||
| Operation microscope | OPMI, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | any other | |
| Oxygen | any other | ||
| Rectal temperature probe | any other | ||
| Scalpell | Swann-Morton | 210 | any other |
| Small animal shaver | any other | ||
| Smartphone | any other | ||
| Sodium dodecyl sulfate (0.1%) | Sigma-Aldrich | 11667289001 | |
| Soft feed | Emeraid Omnivore | any generic | |
| Soft tissue forceps | any other | ||
| Soft tissue spreader | any other | ||
| Stainless steel sponge bowls | any other | ||
| Stent-Device | Biotroni, Bülach, Switzerland | modified magmaris device, AMS with polymer coating, 6-mm length, 2-mm diameter | |
| Sterile micro swabs | any other | ||
| Straight and curved microforceps | any other | ||
| Straight and curved microscissors | any other | ||
| Straight and curved forceps | any other | ||
| Surgery drape | any other | ||
| Surgical scissors | any other | ||
| Syringes 1 mL, 2 mL, and 5 mL | any other | ||
| Tape | any other | ||
| Vascular clip applicator | B. Braun, Germany | FT495T | |
| Yasargil titan standard clip (2x) | B. Braun Medical AG, Aesculap, Switzerland | FT242T | temporary |
References
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