Verwendung einer Zell-Tracer-Injektion zur Untersuchung des Ursprungs von Neointima-bildenden Zellen in einem Rattensack-Seitenwandmodell
Summary
Wir führten eine einpunktige, lipophile Zell-Tracer-Injektion durch, um Endothelzellen zu verfolgen, gefolgt von einer Arteriotomie und dem Nähen von Seitenwandaneurysmen an der Bauchrattenaorta. Die Neointima-Bildung schien bei dezellularisierten Aneurysmen von der Elternarterie abhängig zu sein und wurde durch die Rekrutierung aus Aneurysmawandzellen in lebenswichtigen zellreichen Wänden gefördert.
Abstract
Mikrochirurgisches Clipping schafft eine nachfolgende Barriere des Blutflusses in intrakranielle Aneurysmen, während die endovaskuläre Behandlung auf Neointima- und Thrombusbildung beruht. Die Quelle der Endothelzellen, die die endoluminale Schicht der Neointima bedecken, bleibt unklar. Ziel der vorliegenden Studie war es daher, den Ursprung neointimabildender Zellen nach Zell-Tracer-Injektion im bereits etablierten mikrochirurgischen Seitenwand-Aneurysma-Modell der Helsinki-Ratte zu untersuchen.
Seitenwandaneurysmen wurden bei männlichen Lewis-Ratten durch Nähen von dezellularisierten oder lebenswichtigen arteriellen Beuteln von Ende zu Seite an der Aorta erzeugt. Vor der Arteriotomie mit Aneurysmanaht wurde eine Zell-Tracer-Injektion mit CM-Dil-Farbstoff in die geklemmte Aorta durchgeführt, um Endothelzellen im benachbarten Gefäß zu markieren und ihre Proliferation während der Nachbeobachtung (FU) zu verfolgen. Behandlung mit anschließendem Aufwickeln (n = 16) oder Stenting (n = 15). An der FU (7 Tage oder 21 Tage) unterzogen sich alle Ratten einer Fluoreszenzangiographie, gefolgt von einer Aneurysma-Ernte und einer makroskopischen und histologischen Bewertung mit immunhistologischen Zellzahlen für bestimmte Regionen von Interesse.
Keines der 31 Aneurysmen war bei der Nachuntersuchung gerissen. Vier Tiere starben vorzeitig. Eine makroskopisch residuale Perfusion wurde bei 75,0 % gewickelten und 7,0 % bei entstentten Ratten beobachtet. Die Menge an zell-tracer-positiven Zellen war bei dezellularisierten Stented im Vergleich zu gewickelten Aneurysmen in Bezug auf Thrombus an Tag 7 (p = 0,01) und Neointima an Tag 21 (p = 0,04) signifikant erhöht. Es wurden keine signifikanten Unterschiede bei Thrombus oder Neointima bei vitalen Aneurysmen gefunden.
Diese Ergebnisse bestätigen schlechtere Heilungsmuster bei gewickelten Aneurysmen im Vergleich zu gestulten Aneurysmen. Die Neointima-Formation scheint bei dezellularisierten Aneurysmen besonders abhängig von der Elternarterie zu sein, während sie durch die Rekrutierung aus Aneurysmawandzellen in lebenswichtigen zellreichen Wänden unterstützt wird. In Bezug auf die Translation könnte die Stent-Behandlung für stark degenerierte Aneurysmen besser geeignet sein, während das Aufwickeln allein für Aneurysmen mit meist gesunden Gefäßwänden ausreichend sein könnte.
Introduction
Subarachnoidalblutungen, die durch die Ruptur eines intrakraniellen Aneurysmas (IA) verursacht werden, sind eine verheerende neurochirurgische Erkrankung, die mit hoher Morbidität und Mortalität einhergeht 1,2,3,4. Neben dem mikrochirurgischen Clipping, das einen direkten Endothel-zu-Endothel-Kontakt ermöglicht, haben endovaskuläre Geräte in den letzten Jahrzehnten zunehmend an Bedeutung für die Behandlung von rupturierten und zufällig entdeckten IAs gewonnen. Die Heilungsreaktion bei endovaskulär behandelten invasiven Therapien hängt hauptsächlich von der Neointima-Bildung und der Thrombusorganisation ab. Beides sind synergetische Prozesse, abhängig von der Zellmigration aus dem benachbarten Gefäß und der Aneurysmawand. 5 Bis heute ist der Ursprung von Endothelzellen bei der Neointima-Bildung von endovaskulär behandelten Aneurysmen unklar. In der Literatur gibt es eine anhaltende Debatte über die Quelle, aus der Neointima-bildende Zellen rekrutiert werden.
Durch die Verwendung einer Zell-Tracer-Injektion von CM-Dil-Farbstoff (siehe Materialtabelle) in die Bauchaorta von Ratten wollten wir die Rolle von Endothelzellen, die aus der Elternarterie stammen, bei der Neointima-Bildung an zwei verschiedenen FU-Zeitpunkten (Tag 7 und Tag 21) analysieren (Abbildung 1). Ein Vorteil des Modells ist die direkte lokale Zell-Tracer-Inkubation in vivo in einer Elternarterie vor der Aneurysmanaht, die FU zu späteren Zeitpunkten ermöglicht. In-vivo-Injektionstechniken , wie die Zell-Tracer-Inkubation, wurden in der Literatur nicht beschrieben. Ein Vorteil dieser Technik ist die direkte, einpunktige, intraoperative In-vivo-Injektion , die das Modell robust und reproduzierbar macht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Studie zeigt, dass die Neointima-Bildung über Endothelzellen vermittelt wird, die aus der Elternarterie des Aneurysmakomplexes stammen, aber durch die Rekrutierung von Zellen aus der Aneurysmawand in lebenswichtigen Aneurysmen unterstützt wird. Dennoch bleibt die Rolle zirkulierender Vorfahrenzellen bei der Aneurysmaheilung umstritten12,13. Insgesamt wurden 31 männliche Lewis-Ratten in diese Untersuchung einbezogen; nur 4 starben vorzeitig (12,9% Mortali…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Alessandra Bergadano, DVM, PhD, für die engagierte Überwachung der langfristigen Tiergesundheit. Diese Arbeit wurde durch die Forschungsmittel des Forschungsrates, des Kantonsspitals Aarau, Schweiz, und des Schweizerischen Nationalfonds SNF (310030_182450) unterstützt.
Materials
| 3-0 resorbable suture | Ethicon Inc., USA | VCP428G | |
| 4-0 non-absorbable suture | B. Braun, Germany | G0762563 | |
| 6-0 non-absorbable suture | B. Braun, Germany | C0766070 | |
| 9-0 non-absorbable suture | B. Braun, Germany | G1111140 | |
| Atipamezol | Arovet AG, Switzerland | ||
| Bandpass filter blue | Thorlabs | FD1B | any other |
| Bandpass filter green | Thorlabs | FGV9 | any other |
| Bipolar forceps | any other | ||
| Bicycle spotlight | any other | ||
| Board (20 x 10 cm) | any other | ||
| Buprenorphine | Indivior, Switzerland | 1014197 | |
| Camera | Sony NEX-5R, Sony, Tokyo, Japan | ||
| Cannula (27-1/2 G) | any other | ||
| Cell count software | Image-J version 1.52n, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| CellTracker CM-Dil dye | ThermoFisher SCIENTIFIC, USA | C7000 | |
| Coil-Device | Styker, Kalamazoo, MI, USA | 2 cm of Target 360 TM Ultra, 2-mm diameter | |
| Desinfection | any other | ||
| Eye-lubricant | any other | ||
| Fentanyl | Sintetica, S.A., Switzerland | 98683 | any generic |
| Flumazenil | Labatec-Pharma, Switerzland | ||
| Fluoresceine | Curatis AG | 5030376 | any generic |
| Fluorescence microscope | Olympus BX51, Hamburg, Germany; Cell Sens Dimension Imaging software v1.8 | ||
| Foil mask | any other | ||
| Glucose (5%) | any other | ||
| Heating pad | Homeothermic Control Unit, Harvard, Edenbridge, England | any other | |
| Isotonic sodium chloride solution (0.9%) | Fresenius KABI | 336769 | any generic |
| Isoflurane | any generic | ||
| Longuettes | any other | ||
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | P7626406 | any generic |
| Medetomidine | Virbac, Switzerland | QN05CM91 | |
| Micro needle holder | any other | ||
| Midazolam | Roche, Switzerland | ||
| Monitoring-system | Starr Life Sciences Corp., 333 Allegheny Ave, Oakmont, PA 15139, United States | ||
| Needle holder | any other | ||
| O2-Face mask | any other | ||
| Operation microscope | OPMI, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | any other | |
| Oxygen | any other | ||
| Rectal temperature probe | any other | ||
| Scalpell | Swann-Morton | 210 | any other |
| Small animal shaver | any other | ||
| Smartphone | any other | ||
| Sodium dodecyl sulfate (0.1%) | Sigma-Aldrich | 11667289001 | |
| Soft feed | Emeraid Omnivore | any generic | |
| Soft tissue forceps | any other | ||
| Soft tissue spreader | any other | ||
| Stainless steel sponge bowls | any other | ||
| Stent-Device | Biotroni, Bülach, Switzerland | modified magmaris device, AMS with polymer coating, 6-mm length, 2-mm diameter | |
| Sterile micro swabs | any other | ||
| Straight and curved microforceps | any other | ||
| Straight and curved microscissors | any other | ||
| Straight and curved forceps | any other | ||
| Surgery drape | any other | ||
| Surgical scissors | any other | ||
| Syringes 1 mL, 2 mL, and 5 mL | any other | ||
| Tape | any other | ||
| Vascular clip applicator | B. Braun, Germany | FT495T | |
| Yasargil titan standard clip (2x) | B. Braun Medical AG, Aesculap, Switzerland | FT242T | temporary |
References
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