שימוש בזריקת מעקב אחר תאים כדי לחקור את מקורם של תאים יוצרי ניאו-אינטימה במודל דופן צד סקולרית של חולדה
Summary
ביצענו זריקה חד-נקודתית, ליפופילית, לאיתור תאי אנדותל, ולאחר מכן טרשת עורקים ותפירה של מפרצות דופן הדופן באבי העורקים של חולדות הבטן. היווצרות ניאו-ינטימה נראתה תלויה בעורק האב במפרצות דה-תאיות וקודמה על ידי גיוס מתאי דופן מפרצת בקירות חיוניים עשירים בתאים.
Abstract
חיתוך מיקרו-כירורגי יוצר מחסום נוסף של זרימת הדם למפרצות תוך גולגולתיות, בעוד שהטיפול האנדווסקולרי מסתמך על ניאו-אינטימה והיווצרות פקקת. מקורם של תאי האנדותל המכסים את השכבה האנדולומינלית של הניאו-אינטימה עדיין אינו ברור. לכן, מטרת המחקר הנוכחי הייתה לחקור את מקורם של תאים יוצרי ניאו-אינטימה לאחר הזרקת עוקבים אחר תאים במודל המפרצת המיקרו-כירורגית של חולדות הלסינקי, שכבר היה מבוסס היטב.
מפרצות דופן הדופן נוצרו על ידי תפירה של שקיות עורקים נטולות תאים או חיוניות מקצה לקצה באבי העורקים בחולדות לואיס זכריות. לפני טרשת עורקים עם תפר מפרצת, בוצעה הזרקת מעקב אחר תאים המכילה צבע CM-Dil לתוך אבי העורקים המהודק כדי לתייג תאי אנדותל בכלי הסמוך ולעקוב אחר התפשטותם במהלך מעקב (FU). הטיפול ואחריו סליל (n = 16) או סטנטים (n = 15). ב-FU (7 ימים או 21 ימים), כל החולדות עברו אנגיוגרפיה פלואורסצנטית, ואחריה קצירת מפרצת והערכה מקרוסקופית והיסטולוגית עם ספירת תאים אימונוהיסטולוגית לאזורי עניין ספציפיים.
אף אחת מ-31 המפרצות לא נקרעה במעקב. ארבע חיות מתו בטרם עת. זלוף שיורי מקרוסקופי נצפה ב-75.0% מפותלים וב-7.0% מהחולדות הסטנטיות. כמות התאים החיוביים למעקב אחר תאים עלתה באופן משמעותי בסטנטים דה-תאיים בהשוואה למפרצת מפותלת ביחס לפקקת ביום 7 (p = 0.01) וניאו-ינטימה ביום 21 (p = 0.04). לא נמצאו הבדלים משמעותיים בפקקת או בניאינטימה במפרצות חיוניות.
ממצאים אלה מאשרים דפוסי ריפוי גרועים יותר במפרצות מפותלות בהשוואה למפרצות סטנטות. נראה כי היווצרות ניאו-ינטימה תלויה במיוחד בעורק האב במפרצות שעברו דה-תאיזציה, בעוד שהיא נתמכת על ידי גיוס מתאי דופן מפרצת בקירות חיוניים עשירים בתאים. במונחים של תרגום, טיפול בסטנט עשוי להיות מתאים יותר למפרצות מנוונות מאוד, בעוד שסליל לבדו עשוי להיות מתאים למפרצות עם דפנות כלי דם בריאות ברובן.
Introduction
דימום תת-עכבישי הנגרם על ידי קרע של מפרצת תוך גולגולתית (IA) הוא מצב נוירוכירורגי הרסני הקשור לתחלואה גבוהה ותמותה 1,2,3,4. בנוסף לחיתוך מיקרו-כירורגי, המספק מגע ישיר בין אנדותל לאנדותל, התקנים אנדווסקולריים זכו לחשיבות גוברת בעשורים האחרונים לטיפול ב-IAs שנקרעו והתגלו כבדרך אגב. תגובת הריפוי ב- IAs המטופלים באנדווסקולרית תלויה בעיקר בהיווצרות ניאו-ינטימה ובארגון פקקת. שניהם תהליכים סינרגטיים, בהתאם לנדידת התאים מכלי השיט הסמוך ולדופן המפרצת. 5 נכון להיום, מקורם של תאי אנדותל בהיווצרות ניאו-ינטימה של מפרצות אנדווסקולריות מטופלות עדיין אינו ברור. יש ויכוח מתמשך בספרות על המקור שממנו מגויסים תאים יוצרי ניאו-אינטימה.
על-ידי שימוש בזריקת מעקב תאים של צבע CM-Dil (ראו טבלת החומרים) באבי העורקים הבטני של חולדות, אנו שואפים לנתח את תפקידם של תאי האנדותל, שמקורם בעורק האב, ביצירת ניאו-אינטימה בשתי נקודות זמן FU שונות (יום 7 ויום 21) (איור 1). יתרון של המודל הוא הדגירה הישירה של עוקבי התאים in vivo בעורק אב לפני תפר המפרצת, המאפשרת FU בנקודות זמן מאוחרות יותר. טכניקות הזרקת In vivo , כגון דגירה של תאי מעקב אחר תאים, לא תוארו בספרות. יתרון של טכניקה זו הוא ההזרקה הישירה, החד-פעמית, התוך-ניתוחית, in vivo , מה שהופך את המודל לחזק וניתן לשחזור.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקר זה מדגים כי היווצרות ניאו-אנטימה מתווכת באמצעות תאי אנדותל שמקורם בעורק האב של קומפלקס המפרצת, אך נתמכת על ידי גיוס תאים שמקורם בדופן המפרצת במפרצות חיוניות. עם זאת, תפקידם של תאי אב במחזור הדם בריפוי מפרצת נותר שנוי במחלוקת12,13. בסך הכל, 31 חולדות לואיס ז?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לאלסנדרה ברגאדנו, DVM, PhD, על הפיקוח המסור על בריאות בעלי חיים לטווח ארוך. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות המחקר של מועצת המחקר, Kantonsspital Aarau, Aarau, שוויץ, וקרן המדע הלאומית השוויצרית SNF (310030_182450).
Materials
| 3-0 resorbable suture | Ethicon Inc., USA | VCP428G | |
| 4-0 non-absorbable suture | B. Braun, Germany | G0762563 | |
| 6-0 non-absorbable suture | B. Braun, Germany | C0766070 | |
| 9-0 non-absorbable suture | B. Braun, Germany | G1111140 | |
| Atipamezol | Arovet AG, Switzerland | ||
| Bandpass filter blue | Thorlabs | FD1B | any other |
| Bandpass filter green | Thorlabs | FGV9 | any other |
| Bipolar forceps | any other | ||
| Bicycle spotlight | any other | ||
| Board (20 x 10 cm) | any other | ||
| Buprenorphine | Indivior, Switzerland | 1014197 | |
| Camera | Sony NEX-5R, Sony, Tokyo, Japan | ||
| Cannula (27-1/2 G) | any other | ||
| Cell count software | Image-J version 1.52n, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| CellTracker CM-Dil dye | ThermoFisher SCIENTIFIC, USA | C7000 | |
| Coil-Device | Styker, Kalamazoo, MI, USA | 2 cm of Target 360 TM Ultra, 2-mm diameter | |
| Desinfection | any other | ||
| Eye-lubricant | any other | ||
| Fentanyl | Sintetica, S.A., Switzerland | 98683 | any generic |
| Flumazenil | Labatec-Pharma, Switerzland | ||
| Fluoresceine | Curatis AG | 5030376 | any generic |
| Fluorescence microscope | Olympus BX51, Hamburg, Germany; Cell Sens Dimension Imaging software v1.8 | ||
| Foil mask | any other | ||
| Glucose (5%) | any other | ||
| Heating pad | Homeothermic Control Unit, Harvard, Edenbridge, England | any other | |
| Isotonic sodium chloride solution (0.9%) | Fresenius KABI | 336769 | any generic |
| Isoflurane | any generic | ||
| Longuettes | any other | ||
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | P7626406 | any generic |
| Medetomidine | Virbac, Switzerland | QN05CM91 | |
| Micro needle holder | any other | ||
| Midazolam | Roche, Switzerland | ||
| Monitoring-system | Starr Life Sciences Corp., 333 Allegheny Ave, Oakmont, PA 15139, United States | ||
| Needle holder | any other | ||
| O2-Face mask | any other | ||
| Operation microscope | OPMI, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | any other | |
| Oxygen | any other | ||
| Rectal temperature probe | any other | ||
| Scalpell | Swann-Morton | 210 | any other |
| Small animal shaver | any other | ||
| Smartphone | any other | ||
| Sodium dodecyl sulfate (0.1%) | Sigma-Aldrich | 11667289001 | |
| Soft feed | Emeraid Omnivore | any generic | |
| Soft tissue forceps | any other | ||
| Soft tissue spreader | any other | ||
| Stainless steel sponge bowls | any other | ||
| Stent-Device | Biotroni, Bülach, Switzerland | modified magmaris device, AMS with polymer coating, 6-mm length, 2-mm diameter | |
| Sterile micro swabs | any other | ||
| Straight and curved microforceps | any other | ||
| Straight and curved microscissors | any other | ||
| Straight and curved forceps | any other | ||
| Surgery drape | any other | ||
| Surgical scissors | any other | ||
| Syringes 1 mL, 2 mL, and 5 mL | any other | ||
| Tape | any other | ||
| Vascular clip applicator | B. Braun, Germany | FT495T | |
| Yasargil titan standard clip (2x) | B. Braun Medical AG, Aesculap, Switzerland | FT242T | temporary |
References
- Vergouwen, M. D., et al. Definition of delayed cerebral ischemia after aneurysmal subarachnoid hemorrhage as an outcome event in clinical trials and observational studies: proposal of a multidisciplinary research group. Stroke. 41 (10), 2391-2395 (2010).
- Macdonald, R. L., et al. Preventing vasospasm improves outcome after aneurysmal subarachnoid hemorrhage: rationale and design of CONSCIOUS-2 and CONSCIOUS-3 trials. Neurocritical Care. 13 (3), 416-424 (2010).
- Wanderer, S., et al. Levosimendan as a therapeutic strategy to prevent neuroinflammation after aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Journal of Neurointerventional Surgery. , (2021).
- Wanderer, S., et al. Aspirin treatment prevents inflammation in experimental bifurcation aneurysms in New Zealand White rabbits. Journal of Neurointerventional Surgery. 14 (2), 189-195 (2021).
- Gruter, B. E., et al. Patterns of neointima formation after coil or stent treatment in a rat saccular sidewall aneurysm model. Stroke. 52 (3), 1043-1052 (2021).
- Kilkenny, C., et al. Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines. British Journal of Pharmacology. 160 (7), 1577-1579 (2010).
- Tornqvist, E., et al. Strategic focus on 3R principles reveals major reductions in the use of animals in pharmaceutical toxicity testing. PLoS One. 9 (7), 101638 (2014).
- Nevzati, E., et al. Aneurysm wall cellularity affects healing after coil embolization: assessment in a rat saccular aneurysm model. Journal of Neurointerventional Surgery. 12 (6), 621-625 (2020).
- Marbacher, S., et al. The Helsinki rat microsurgical sidewall aneurysm model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51071 (2014).
- Nevzati, E., et al. Biodegradable magnesium stent treatment of saccular aneurysms in a rt model – introduction of the surgical technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56359 (2017).
- Gruter, B. E., et al. Testing bioresorbable stent feasibility in a rat aneurysm model. Journal of Neurointerventional Surgery. 11 (10), 1050-1054 (2019).
- Kadirvel, R., et al. Cellular mechanisms of aneurysm occlusion after treatment with a flow diverter. Radiology. 270 (2), 394-399 (2014).
- Li, Z. F., et al. Endothelial progenitor cells contribute to neointima formation in rabbit elastase-induced aneurysm after flow diverter treatment. CNS Neuroscience & Therapeutics. 19 (5), 352-357 (2013).
- Marbacher, S., et al. Intraluminal cell transplantation prevents growth and rupture in a model of rupture-prone saccular aneurysms. Stroke. 45 (12), 3684-3690 (2014).
- Frosen, J., et al. Contribution of mural and bone marrow-derived neointimal cells to thrombus organization and wall remodeling in a microsurgical murine saccular aneurysm model. Neurosurgery. 58 (5), 936-944 (2006).
- Marbacher, S., Niemela, M., Hernesniemi, J., Frosen, J. Recurrence of endovascularly and microsurgically treated intracranial aneurysms-review of the putative role of aneurysm wall biology. Neurosurgical Review. 42 (1), 49-58 (2019).
- Frosen, J. Smooth muscle cells and the formation, degeneration, and rupture of saccular intracranial aneurysm wall–a review of current pathophysiological knowledge. Translational Stroke Research. 5 (3), 347-356 (2014).
- Fang, X., et al. Bone marrow-derived endothelial progenitor cells are involved in aneurysm repair in rabbits. Journal of Clinical Neuroscience. 19 (9), 1283-1286 (2012).
- Morel, S., et al. Sex-related differences in wall remodeling and intraluminal thrombus resolution in a rat saccular aneurysm model. Journal of Neurosurgery. , 1-14 (2019).
- Gruter, B. E., et al. Fluorescence video angiography for evaluation of dynamic perfusion status in an aneurysm preclinical experimental setting. Operative Neurosurgery. 17 (4), 432-438 (2019).
- Marbacher, S., Strange, F., Frosen, J., Fandino, J. Preclinical extracranial aneurysm models for the study and treatment of brain aneurysms: A systematic review. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (5), 922-938 (2020).
- Ravindran, K., et al. Mechanism of action and biology of flow diverters in the treatment of intracranial aneurysms. Neurosurgery. 86, 13-19 (2020).
- Marbacher, S., et al. Loss of mural cells leads to wall degeneration, aneurysm growth, and eventual rupture in a rat aneurysm model. Stroke. 45 (1), 248-254 (2014).
- Morosanu, C. O., et al. Neurosurgical cadaveric and in vivo large animal training models for cranial and spinal approaches and techniques – systematic review of current literature. Neurologia i Neurochirurgia Polska. 53 (1), 8-17 (2019).
- Wanderer, S., et al. Arterial pouch microsurgical bifurcation aneurysm model in the rabbit. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61157 (2020).
