لا يزال الكشف السريع والقياس الكمي الموثوق به لأحداث تحرير الحمض النووي الريبي على نطاق الجينوم أمرا صعبا ويعتمدان حاليا على طرق تسلسل الحمض النووي الريبي المباشرة. يستخدم البروتوكول الموصوف هنا الرحلان الكهربائي الهلامي المتدرج في درجة الحرارة الدقيقة (μTGGE) كطريقة بسيطة وسريعة ومحمولة للكشف عن تحرير الحمض النووي الريبي.
تحرير الحمض النووي الريبي هو عملية تؤدي إلى تغييرات تسلسل ما بعد النسخ في الحمض النووي الريبي. يعتمد الكشف عن تحرير الحمض النووي الريبي وتحديده كميا بشكل أساسي على تقنيات تسلسل Sanger وتسلسل الحمض النووي الريبي. ومع ذلك ، يمكن أن تكون هذه الطرق مكلفة وتستغرق وقتا طويلا. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام نظام الرحلان الكهربائي الهلامي المتدرج في درجة الحرارة الدقيقة المحمول (μTGGE) كنهج غير تسلسلي للكشف السريع عن تحرير الحمض النووي الريبي. وتستند العملية إلى مبدأ الرحلان الكهربائي، الذي يستخدم درجات حرارة عالية لتشويه عينات الأحماض النووية أثناء تحركها عبر هلام بولي أكريلاميد. عبر مجموعة من درجات الحرارة ، تشكل شظية الحمض النووي تدرجا من الحمض النووي المزدوج بالكامل إلى خيوط منفصلة جزئيا ثم إلى حمض نووي منفصل تماما. تنتج المواقع التي تم تحريرها بواسطة الحمض النووي الريبي مع قواعد النيوكليوتيدات المتميزة ملفات تعريف ذوبان مختلفة في تحليلات μTGGE. استخدمنا النهج القائم على μTGGE لتوصيف الاختلافات بين ملفات تعريف الذوبان لأربعة أجزاء من الحمض النووي الريبي المحررة والأجزاء المقابلة غير المحررة (من النوع البري). تم حساب درجات تشابه النمط (PaSSs) من خلال مقارنة أنماط النطاق التي تنتجها الحمض النووي الريبي المحرر وغير المحرر وتم استخدامها لتقييم قابلية تكرار الطريقة. بشكل عام ، تتيح المنصة الموضحة هنا اكتشاف طفرات قاعدة واحدة في الحمض النووي الريبي بطريقة مباشرة وبسيطة وفعالة من حيث التكلفة. ومن المتوقع أن تساعد أداة التحليل هذه في التوصل إلى نتائج جديدة في البيولوجيا الجزيئية.
يمكن أن تشير متغيرات النوكليوتيدات المفردة (SNVs) في الحمض النووي الريبي الجينومي ، بما في ذلك متغيرات A-to-I و C-to-U و U-to-C ، إلى أحداث تحرير الحمض النووي الريبي. ومع ذلك ، فإن اكتشاف SNVs في الحمض النووي الريبي لا يزال مهمة صعبة تقنيا. تقليديا ، يتم تحديد نسبة الحمض النووي الريبي المحرر إلى الحمض النووي الريبي غير المعدل عن طريق التسلسل المباشر ، أو تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي (PCR) الخاص بالأليل ،أو تغيير طبيعة الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) إلى 1،2،3،4،5،6. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب ليست فعالة من حيث الوقت أو التكلفة بشكل خاص ، ودقتها المنخفضة ، الناجمة عن ارتفاع مستويات الضوضاء ، تشكل اختناقات تكنولوجية للكشف عن SNV القائم على الحمض النووي الريبي 7,8. هنا ، نصف بروتوكولا يعتمد على الرحلان الكهربائي الهلامي المتدرج في درجة الحرارة (TGGE) لتحديد تعدد أشكال النيوكليوتيدات المفردة (SNPs) كطريقة بديلة تلغي الحاجة إلى نهج تسلسل الحمض النووي الريبي المباشرة لتحليلات تحرير الحمض النووي الريبي.
الرحلان الكهربائي هو الطريقة المفضلة لفصل وتحليل الجزيئات الحيوية في مختبرات علوم الحياة. يتيح TGGE فصل شظايا الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل والتي هي بنفس الحجم ولكن لها تسلسلات مختلفة. تعتمد هذه التقنية على الاختلافات المرتبطة بالتسلسل في درجات حرارة انصهار شظايا الحمض النووي والتغيرات اللاحقة في تحركاتها في المواد الهلامية المسامية مع تدرج درجة حرارة خطي 9,10. ذوبان شظايا الحمض النووي يولد ملامح ذوبان محددة. بمجرد أن يصل المجال ذو أدنى درجة حرارة انصهار إلى درجة الحرارة المقابلة في موضع معين في الجل ، يحدث الانتقال من بنية حلزونية إلى بنية مذابة جزئيا ، وسيتوقف ترحيل الجزيء عمليا. لذلك ، يستخدم TGGE كلا من التنقل (معلومات الحجم) والتحولات الهيكلية الناجمة عن درجة الحرارة لشظايا الحمض النووي (المعلومات المعتمدة على التسلسل) ، مما يجعلها نهجا قويا لتوصيف شظايا الحمض النووي. نقاط السمة في نمط انصهار TGGE ، والتي تتوافق مع ثلاثة تحولات هيكلية لجزيء الحمض النووي ، هي نقطة التفكك الأولي للحبلا ، ونقطة التفكك منتصف الخيط ، ونقطة التفكك النهائية للحبلا (الشكل 1). تؤثر اختلافات التسلسل داخل المجالات ، حتى الاختلافات أحادية القاعدة ، على درجة حرارة الانصهار ، وبالتالي ، فإن الجزيئات ذات التسلسلات المختلفة ستظهر أنماط ذوبان منفصلة (تمسخ) في تحليلات TGGE. لذلك ، يمكن استخدام TGGE لتحليل SNVs في الحمض النووي الريبي الجينومي ويمكن أن يكون طريقة عالية الإنتاجية لا تقدر بثمن للكشف عن تحرير الحمض النووي الريبي. يتم فقدان هذا الكسب عالي الإنتاجية عند استخدام TGGE التقليدي القائم على الرحلان الكهربائي الهلامي. ومع ذلك ، يمكن استخدام نسخة مصغرة من TGGE ، تسمى microTGGE (μTGGE) ، لتقصير الوقت الكهربائي الهلامي وتسريع التحليل مع زيادة 100 ضعف في الإنتاجية11. تم تحسين بساطة واكتناز طريقة μTGGE من خلال إدخال PalmPAGE12 ، وهو نظام هرهلام كهربائي قابل للتطبيق في الميدان ومحمولة باليد وبأسعار معقولة.
هنا ، يتم استخدام بروتوكول جديد قائم على TGGE لفحص ثلاثة أنواع من مواقع تحرير الحمض النووي الريبي (A-to-I و C-to-U و U-to-C) في أربعة جينات ، بما في ذلك اثنان من أنسجة Arabidopsis thaliana واثنان معبرا عنهما في خلايا HEK293 الثديية (الشكل 1A). يدمج البروتوكول استخدام PalmPAGE (الأجهزة) ، وهو نظام محمول للكشف السريع عن تحرير الحمض النووي الريبي ، و uMelt (برنامج)13. مع متوسط وقت تشغيل يتراوح بين 15 و 30 دقيقة ، يتيح هذا البروتوكول التعرف السريع والموثوق والسهل على تحرير الحمض النووي الريبي دون الحاجة إلى نهج تسلسل الحمض النووي الريبي المباشر.
يلعب تحرير الحمض النووي الريبي دورا مهما في علم الأحياء. ومع ذلك ، فإن الطرق الحالية للكشف عن تحرير الحمض النووي الريبي ، مثل الكروماتوغرافيا والتسلسل ، تمثل العديد من التحديات بسبب تكلفتها العالية ، ومتطلبات الوقت المفرطة ، والتعقيد. البروتوكول الموضح هنا هو طريقة بسيطة وسريعة وفعالة من…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا العمل من قبل منحة معونة للبحث العلمي من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (17H02204 و 18K19288). تم دعم روتشيكا ماليا من قبل الحكومة اليابانية (منحة MEXT). نشكر السيدة راديكا بياني (مختبر تاكاغي، JAIST) والدكتورة كيرتي شارما (شركة BioSeeds Corporation) على المساعدة في التجارب المتعلقة بالرحلان الكهربائي.
2U ExoI | Takara | 2650A | Exonuclease I |
40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1) | Thermo fisher | AM9022 | |
Ammonium persulfate (APS) | Thermo Fisher | 17874 | |
Centrifuge Mini spin | eppendorf | 5452000034 | |
Digital dry bath/ block heater | Thermo fisher | NA | |
Gold Taq Polymerase Master mixture | Promega | M7122 | |
LATaq DNA polymerase | TAKARA | RR002A | Taq Polymerase |
micro-TGGE cassette holder | BioSeeds Corp. | BS-GE-CH | |
micro-TGGE apparatus | Lifetech Corp. | TG | |
micro-TGGE gel cassette | BioSeeds Corp. | BS-TGGE-C | |
NanoDrop 1000 | Thermo fisher | ND-1000 | Spectrophotometer |
Plant Rneasy Mini kit | Qiagen | 74904 | |
ReverTra Ace Master Mix | TOYOBO | TRT101 | M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase |
Rneasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
Shrimp Alkaline Phosphatase | Takara | 2660B | |
SYBR Gold nucleic acid gel stain | Thermo fisher | S11494 | |
TBE buffer | Thermo fisher | B52 | |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai tesque | 33401-72 | |
Urea, Nuclease and protease tested | Nacalai tesque | 35940-65 |