Несеквенирующий подход к быстрому обнаружению редактирования РНК
Summary
Быстрое обнаружение и надежная количественная оценка событий редактирования РНК в геномном масштабе остаются сложными и в настоящее время полагаются на методы прямого секвенирования РНК. Протокол, описанный здесь, использует микротемпературный градиентный гель-электрофорез (μTGGE) в качестве простого, быстрого и портативного метода обнаружения редактирования РНК.
Abstract
Редактирование РНК — это процесс, который приводит к посттранскрипционным изменениям последовательности в РНК. Обнаружение и количественная оценка редактирования РНК в основном зависят от методов секвенирования Сэнгера и секвенирования РНК. Однако эти методы могут быть дорогостоящими и трудоемкими. В этом протоколе портативная система электрофореза геля с градиентной микротемпературой (μTGGE) используется в качестве несеквенирующего подхода для быстрого обнаружения редактирования РНК. Процесс основан на принципе электрофореза, который использует высокие температуры для денатурации образцов нуклеиновых кислот при их перемещении по полиакриламидному гелю. В диапазоне температур фрагмент ДНК образует градиент полностью двухцепочечной ДНК к частично разделенным нитям, а затем к полностью разделенной одноцепочечной ДНК. Отредактированные РНК участки с различными нуклеотидными основаниями производят различные профили плавления в анализах μTGGE. Мы использовали подход, основанный на μTGGE, для характеристики различий между профилями плавления четырех отредактированных фрагментов РНК и их соответствующими неотредактированными (дикого типа) фрагментами. Оценки сходства паттернов (PaSSs) рассчитывались путем сравнения полосовых паттернов, полученных отредактированными и неотредактированными РНК, и использовались для оценки воспроизводимости метода. В целом, платформа, описанная здесь, позволяет обнаруживать даже одноосновные мутации в РНК простым, простым и экономически эффективным способом. Ожидается, что этот инструмент анализа поможет новым выводам молекулярной биологии.
Introduction
Варианты одиночных нуклеотидов (SNV) в геномной РНК, включая варианты A-to-I, C-to-U и U-to-C, могут указывать на события редактирования РНК. Тем не менее, обнаружение SNV в РНК остается технически сложной задачей. Условно соотношение отредактированной и неотредактированной РНК определяется прямым секвенированием, аллель-специфической полимеразной цепной реакцией реального времени (ПЦР) или денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) приближается к 1,2,3,4,5,6. Однако эти подходы не являются особенно эффективными по времени или затратам, а их низкая точность, вызванная высоким уровнем шума, создает технологические узкие места для обнаружения SNV на основе РНК 7,8. Здесь мы описываем протокол, основанный на электрофорезе гель с температурным градиентом (TGGE) для идентификации однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) в качестве альтернативного метода, который устраняет необходимость в подходах прямого секвенирования РНК к анализу редактирования РНК.
Электрофорез является предпочтительным методом разделения и анализа биомолекул в лабораториях наук о жизни. TGGE позволяет разделять двухцепочечные фрагменты ДНК, которые имеют одинаковый размер, но имеют разные последовательности. Метод опирается на связанные с последовательностями различия в температурах плавления фрагментов ДНК и последующие изменения их подвижности в пористых гелях с линейным градиентом температуры 9,10. Плавление фрагментов ДНК генерирует специфические профили плавления. Как только домен с наименьшей температурой плавления достигнет соответствующей температуры в определенном положении в геле, произойдет переход от спиральной структуры к частично расплавленной структуре, и миграция молекулы практически остановится. Таким образом, TGGE использует как мобильность (информация о размере), так и структурные переходы фрагментов ДНК, вызванные температурой (информация, зависящая от последовательности), что делает его мощным подходом к характеристике фрагментов ДНК. Точками признаков в паттерне плавления TGGE, которые соответствуют трем структурным переходам молекулы ДНК, являются точка начальной диссоциации цепи, точка средней диссоциации цепи и точка концевой диссоциации цепи (рисунок 1). Вариации последовательностей внутри доменов, даже одноосновные различия, влияют на температуру плавления, следовательно, молекулы с различными последовательностями будут демонстрировать дискретные модели плавления (денатурации) в анализах TGGE. Таким образом, TGGE может быть использован для анализа SNV в геномной РНК и может быть бесценным высокопроизводительным методом обнаружения редактирования РНК. Это увеличение высокой пропускной способности теряется при использовании традиционного TGGE на основе гелевого электрофореза. Однако миниатюрная версия TGGE, названная microTGGE (μTGGE), может быть использована для сокращения времени электрофоретики геля и ускорения анализа с 100-кратным увеличением производительности11. Простота и компактность метода μTGGE были улучшены благодаря внедрению PalmPAGE12, применимой в полевых условиях, портативной и доступной системы гелевого электрофореза.
Здесь новый протокол на основе TGGE используется для изучения трех типов сайтов редактирования РНК (A-to-I, C-to-U и U-to-C) в четырех генах, в том числе двух из тканей Arabidopsis thaliana и двух, экспрессируемых в клетках HEK293 млекопитающих (рисунок 1A). Протокол объединяет использование PalmPAGE (аппаратное обеспечение), портативной системы для быстрого обнаружения редактирования РНК, и uMelt (программное обеспечение)13. При среднем времени работы 15-30 мин этот протокол обеспечивает быструю, надежную и простую идентификацию редактирования РНК без необходимости применения подходов к прямому секвенированию РНК.
Protocol
Representative Results
Discussion
Редактирование РНК играет важную роль в биологии; однако современные методы обнаружения редактирования РНК, такие как хроматография и секвенирование, представляют собой несколько проблем из-за их высокой стоимости, чрезмерных временных требований и сложности. Протокол, описанный зде…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом на научные исследования от Японского общества содействия науке (17H02204 и 18K19288). Ручика получил финансовую поддержку японского правительства (стипендия MEXT). Мы благодарим г-жу Радхику Бияни (Лаборатория Такаги, JAIST) и д-ра Кирти Шарму (Корпорация BioSeeds) за помощь в проведении экспериментов, связанных с электрофорезом.
Materials
| 2U ExoI | Takara | 2650A | Exonuclease I |
| 40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1) | Thermo fisher | AM9022 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Thermo Fisher | 17874 | |
| Centrifuge Mini spin | eppendorf | 5452000034 | |
| Digital dry bath/ block heater | Thermo fisher | NA | |
| Gold Taq Polymerase Master mixture | Promega | M7122 | |
| LATaq DNA polymerase | TAKARA | RR002A | Taq Polymerase |
| micro-TGGE cassette holder | BioSeeds Corp. | BS-GE-CH | |
| micro-TGGE apparatus | Lifetech Corp. | TG | |
| micro-TGGE gel cassette | BioSeeds Corp. | BS-TGGE-C | |
| NanoDrop 1000 | Thermo fisher | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Plant Rneasy Mini kit | Qiagen | 74904 | |
| ReverTra Ace Master Mix | TOYOBO | TRT101 | M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase |
| Rneasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase | Takara | 2660B | |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Thermo fisher | S11494 | |
| TBE buffer | Thermo fisher | B52 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai tesque | 33401-72 | |
| Urea, Nuclease and protease tested | Nacalai tesque | 35940-65 |
References
- Chateigner-Boutin, A. L., Small, I. A rapid high-throughput method for the detection and quantification of RNA editing based on high-resolution melting of amplicons. Nucleic Acids Research. 35 (17), 114 (2007).
- Chen, Y. C., et al. A real-time PCR method for the quantitative analysis of RNA editing at specific sites. Analytical Biochemistry. 375 (1), 46-52 (2008).
- Barbon, A., Vallini, I., La Via, L., Marchina, E., Barlati, S. Glutamate receptor RNA editing: a molecular analysis of GluR2, GluR5 and GluR6 in human brain tissues and in NT2 cells following in vitro neural differentiation. Molecular Brain Research. 117 (2), 168-178 (2003).
- Gallo, A., Thomson, E., Brindle, J., O’Connell, M. A., Keegan, L. P. Micro-processing events in mRNAs identified by DHPLC analysis. Nucleic Acids Research. 30 (18), 3945-3953 (2002).
- Schiffer, H. H., Heinemann, S. F. A Quantitative method to detect RNA editing events. Analytical Biochemistry. 276 (2), 257-260 (1999).
- Burns, C. M., et al. Regulation of serotonin-2C receptor G-protein coupling by RNA editing. Nature. 387 (6630), 303-308 (1997).
- Marian, A. J. The bottleneck in genetic testing. Circulation Research. 117 (7), 586-588 (2015).
- Bird, A. Genome biology: Not drowning but waving. Cell. 154 (5), 951-952 (2013).
- Jones, B. M., Knapp, L. A. Temporal temperature gradient electrophoresis for detection of single nucleotide polymorphisms. Methods in Molecular Biology. 578, 153-165 (2009).
- Riesner, D., et al. Temperature-gradient gel electrophoresis of nucleic acids: analysis of conformational transitions, sequence variations, and protein-nucleic acid interactions. Electrophoresis. 10 (5-6), 377-389 (1989).
- Biyani, M., Nishigaki, K. Hundred-fold productivity of genome analysis by introduction of micro-temperature gradient gel electrophoresis. Electrophoresis. 22 (1), 23-28 (2001).
- Rathore, H., Biyani, R., Kato, H., Takamura, Y., Biyani, M. Palm-size and one-inch gel electrophoretic device for reliable and field-applicable analysis of recombinase polymerase amplification. Analytical Methods. 11 (39), 4969-4976 (2019).
- Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
- Bhakta, S., Sakari, M., Tsukahara, T. RNA editing of BFP, a point mutant of GFP, using artificial APOBEC1 deaminase to restore the genetic code. Scientific Reports. 10 (1), 17304 (2020).
- Azad, T. A., Qulsum, U., Tsukahara, T. Comparative activity of adenosine deaminase acting on RNA (ADARs) isoforms for correction of genetic code in gene therapy. Current Gene Therapy. 19 (1), 31-39 (2019).
- Ruchika, O. C., Sakari, M., Tsukahara, T. Genome-wide identification of U-To-C RNA editing events for nuclear genes in Arabidopsis thaliana. Cells. 10 (3), 635 (2021).
- Tsukahara, T. The U-to-C RNA editing affects the mRNA stability of nuclear genes in Arabidopsis thaliana. Biochemical and Biophysical Research Communications. 571, 110-117 (2021).
