גישת אי-ריצוף לגילוי מהיר של עריכת RNA
Summary
זיהוי מהיר וכימות אמין של אירועי עריכת RNA בקנה מידה גנומי נותרו מאתגרים ומסתמכים כיום על שיטות ריצוף RNA ישירות. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש באלקטרופורזה של ג’ל גרדיאנט מיקרו-טמפרטורה (μTGGE) כשיטה פשוטה, מהירה וניידת לאיתור עריכת RNA.
Abstract
עריכת RNA היא תהליך שמוביל לשינויים ברצף פוסט-טרנספורמטיבי ב-RNA. זיהוי וכימות של עריכת RNA מסתמכים בעיקר על ריצוף סנגר וטכניקות ריצוף RNA. עם זאת, שיטות אלה יכולות להיות יקרות וגוזלות זמן רב. בפרוטוקול זה, מערכת אלקטרופורזה ניידת של ג’ל גרדיאנט מיקרו-טמפרטורה (μTGGE) משמשת כגישת אי-ריצוף לזיהוי מהיר של עריכת RNA. התהליך מבוסס על עקרון האלקטרופורזה, המשתמשת בטמפרטורות גבוהות כדי לנטרל דגימות של חומצות גרעין בזמן שהן נעות על פני ג’ל פוליאקרילאמיד. על פני טווח טמפרטורות, מקטע דנ”א יוצר שיפוע של דנ”א דו-גדילי מלא לגדילים מופרדים חלקית ולאחר מכן לדנ”א חד-גדילי מופרד לחלוטין. אתרים שנערכו על ידי RNA עם בסיסי נוקלאוטידים מובחנים מייצרים פרופילי התכה שונים בניתוחי μTGGE. השתמשנו בגישה המבוססת על μTGGE כדי לאפיין את ההבדלים בין פרופילי ההיתוך של ארבעה מקטעי RNA ערוכים לבין השברים הלא ערוכים (מסוג פראי) המתאימים להם. ציוני דמיון תבניות (PaSSs) חושבו על ידי השוואת תבניות הפסים שהופקו על ידי ה-RNA הערוכים והלא ערוכים, ושימשו להערכת יכולת השכפול של השיטה. באופן כללי, הפלטפורמה המתוארת כאן מאפשרת לזהות אפילו מוטציות בסיס בודדות ברנ”א בצורה פשוטה, פשוטה וחסכונית. הצפי הוא שכלי ניתוח זה יסייע לממצאים חדשים של הביולוגיה המולקולרית.
Introduction
וריאנטים של נוקלאוטידים בודדים (SNVs) ברנ”א גנומי, כולל גרסאות A-to-I, C-to-U ו-U-to-C, יכולות להצביע על אירועי עריכת RNA. עם זאת, זיהוי של SNVs ב- RNA נותר משימה מאתגרת מבחינה טכנית. באופן קונבנציונלי, היחס בין רנ”א ערוך לרנ”א לא ערוך נקבע על ידי ריצוף ישיר, תגובת שרשרת פולימראז ספציפית לאלל בזמן אמת (PCR), או דה-נטורציה של כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) מתקרבת ל-1,2,3,4,5,6. עם זאת, גישות אלה אינן חסכוניות במיוחד בזמן או באופן חסכוני במיוחד, והדיוקים הנמוכים שלהן, הנגרמים על ידי רמות גבוהות של רעש, מציבים צווארי בקבוק טכנולוגיים לזיהוי SNV מבוסס RNA 7,8. כאן נתאר פרוטוקול המבוסס על אלקטרופורזה של ג’ל שיפוע טמפרטורה (TGGE) לזיהוי פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים (SNPs) כשיטה חלופית המבטלת את הצורך בגישות ריצוף RNA ישירות לניתוחי עריכת RNA.
אלקטרופורזה היא שיטה מועדפת להפרדה וניתוח של ביומולקולות במעבדות מדעי החיים. TGGE מאפשר הפרדה של מקטעי דנ”א דו-גדיליים שהם באותו גודל אך בעלי רצפים שונים. הטכניקה מסתמכת על הבדלים הקשורים לרצף בטמפרטורות ההיתוך של שברי דנ”א ועל השינויים הבאים בניידות שלהם בג’לים נקבוביים עם שיפוע טמפרטורה ליניארי 9,10. התכה של מקטעי דנ”א יוצרת פרופילי התכה ספציפיים. ברגע שהתחום עם טמפרטורת ההיתוך הנמוכה ביותר מגיע לטמפרטורה המתאימה במיקום מסוים בג’ל, מתרחש המעבר ממבנה סלילי למבנה מומס חלקית, והנדידה של המולקולה תיעצר למעשה. לכן, TGGE משתמשת הן בניידות (מידע על גודל) והן במעברים מבניים המושרים על ידי טמפרטורה של מקטעי דנ”א (מידע תלוי רצף), מה שהופך אותה לגישה רבת עוצמה לאפיון מקטעי דנ”א. נקודות התכונה בתבנית התכה של TGGE, המתאימות לשלושה מעברים מבניים של מולקולת הדנ”א, הן נקודת הדיסוציאציה ההתחלתית של גדיל, נקודת הדיסוציאציה האמצעית של הגדיל, ונקודת הדיסוציאציה הסופית של הגדיל (איור 1). וריאציות רצף בתוך תחומים, אפילו הבדלים חד-בסיסיים, משפיעות על טמפרטורת ההיתוך, ולכן, מולקולות עם רצפים שונים יציגו דפוסי התכה בדידים (דנטורציה) בניתוחי TGGE. לכן, TGGE יכול לשמש לניתוח SNVs ברנ”א גנומי ויכול להיות שיטה בעלת תפוקה גבוהה שלא תסולא בפז לגילוי עריכת RNA. רווח זה בתפוקה גבוהה הולך לאיבוד כאשר נעשה שימוש ב- TGGE מסורתי מבוסס אלקטרופורזה של ג’ל. עם זאת, ניתן להשתמש בגרסה ממוזערת של TGGE, הנקראת microTGGE (μTGGE), כדי לקצר את הזמן האלקטרופורטי של הג’ל ולהאיץ את הניתוח עם עלייה של פי 100 בפרודוקטיביות11. הפשטות והקומפקטיות של שיטת μTGGE שופרו על ידי הצגת PalmPAGE12, מערכת אלקטרופורזה ג’לית ישימה בשדה, כף יד ובמחיר סביר.
כאן, פרוטוקול חדש המבוסס על TGGE משמש לבחינת שלושה סוגים של אתרי עריכת RNA (A-to-I, C-to-U ו-U-to-C) בארבעה גנים, כולל שניים מרקמות ה-Arabidopsis thaliana ושניים המתבטאים בתאי HEK293 של יונקים (איור 1A). הפרוטוקול משלב את השימוש ב-PalmPAGE (חומרה), מערכת ניידת לזיהוי מהיר של עריכת RNA, ו-uMelt (תוכנה)13. עם זמן ריצה ממוצע של 15-30 דקות, פרוטוקול זה מאפשר זיהוי מהיר, אמין וקל של עריכת RNA ללא צורך בגישות ריצוף RNA ישירות.
Protocol
Representative Results
Discussion
עריכת רנ”א ממלאת תפקיד חשוב בביולוגיה; עם זאת, השיטות הנוכחיות לאיתור עריכת RNA, כגון כרומטוגרפיה וריצוף, מציבות מספר אתגרים בשל עלותן הגבוהה, דרישות הזמן המופרזות ומורכבותן. הפרוטוקול המתואר כאן הוא שיטה פשוטה, מהירה וחסכונית לאיתור עריכת RNA המשתמשת במערכת ניידת, מיקרו-גדולה, מבוססת TGGE. נית?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק סיוע למחקר מדעי מהחברה היפנית לקידום המדע (17H02204 ו- 18K19288). רוצ’יקה נתמכה כספית על ידי ממשלת יפן (מלגת MEXT). אנו מודים לגב’ ראדהיקה ביאני (מעבדת טקאגי, JAIST) ולד”ר קירטי שארמה (תאגיד BioSeeds) על העזרה בניסויים הקשורים לאלקטרופורזה.
Materials
| 2U ExoI | Takara | 2650A | Exonuclease I |
| 40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1) | Thermo fisher | AM9022 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Thermo Fisher | 17874 | |
| Centrifuge Mini spin | eppendorf | 5452000034 | |
| Digital dry bath/ block heater | Thermo fisher | NA | |
| Gold Taq Polymerase Master mixture | Promega | M7122 | |
| LATaq DNA polymerase | TAKARA | RR002A | Taq Polymerase |
| micro-TGGE cassette holder | BioSeeds Corp. | BS-GE-CH | |
| micro-TGGE apparatus | Lifetech Corp. | TG | |
| micro-TGGE gel cassette | BioSeeds Corp. | BS-TGGE-C | |
| NanoDrop 1000 | Thermo fisher | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Plant Rneasy Mini kit | Qiagen | 74904 | |
| ReverTra Ace Master Mix | TOYOBO | TRT101 | M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase |
| Rneasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase | Takara | 2660B | |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Thermo fisher | S11494 | |
| TBE buffer | Thermo fisher | B52 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai tesque | 33401-72 | |
| Urea, Nuclease and protease tested | Nacalai tesque | 35940-65 |
References
- Chateigner-Boutin, A. L., Small, I. A rapid high-throughput method for the detection and quantification of RNA editing based on high-resolution melting of amplicons. Nucleic Acids Research. 35 (17), 114 (2007).
- Chen, Y. C., et al. A real-time PCR method for the quantitative analysis of RNA editing at specific sites. Analytical Biochemistry. 375 (1), 46-52 (2008).
- Barbon, A., Vallini, I., La Via, L., Marchina, E., Barlati, S. Glutamate receptor RNA editing: a molecular analysis of GluR2, GluR5 and GluR6 in human brain tissues and in NT2 cells following in vitro neural differentiation. Molecular Brain Research. 117 (2), 168-178 (2003).
- Gallo, A., Thomson, E., Brindle, J., O’Connell, M. A., Keegan, L. P. Micro-processing events in mRNAs identified by DHPLC analysis. Nucleic Acids Research. 30 (18), 3945-3953 (2002).
- Schiffer, H. H., Heinemann, S. F. A Quantitative method to detect RNA editing events. Analytical Biochemistry. 276 (2), 257-260 (1999).
- Burns, C. M., et al. Regulation of serotonin-2C receptor G-protein coupling by RNA editing. Nature. 387 (6630), 303-308 (1997).
- Marian, A. J. The bottleneck in genetic testing. Circulation Research. 117 (7), 586-588 (2015).
- Bird, A. Genome biology: Not drowning but waving. Cell. 154 (5), 951-952 (2013).
- Jones, B. M., Knapp, L. A. Temporal temperature gradient electrophoresis for detection of single nucleotide polymorphisms. Methods in Molecular Biology. 578, 153-165 (2009).
- Riesner, D., et al. Temperature-gradient gel electrophoresis of nucleic acids: analysis of conformational transitions, sequence variations, and protein-nucleic acid interactions. Electrophoresis. 10 (5-6), 377-389 (1989).
- Biyani, M., Nishigaki, K. Hundred-fold productivity of genome analysis by introduction of micro-temperature gradient gel electrophoresis. Electrophoresis. 22 (1), 23-28 (2001).
- Rathore, H., Biyani, R., Kato, H., Takamura, Y., Biyani, M. Palm-size and one-inch gel electrophoretic device for reliable and field-applicable analysis of recombinase polymerase amplification. Analytical Methods. 11 (39), 4969-4976 (2019).
- Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
- Bhakta, S., Sakari, M., Tsukahara, T. RNA editing of BFP, a point mutant of GFP, using artificial APOBEC1 deaminase to restore the genetic code. Scientific Reports. 10 (1), 17304 (2020).
- Azad, T. A., Qulsum, U., Tsukahara, T. Comparative activity of adenosine deaminase acting on RNA (ADARs) isoforms for correction of genetic code in gene therapy. Current Gene Therapy. 19 (1), 31-39 (2019).
- Ruchika, O. C., Sakari, M., Tsukahara, T. Genome-wide identification of U-To-C RNA editing events for nuclear genes in Arabidopsis thaliana. Cells. 10 (3), 635 (2021).
- Tsukahara, T. The U-to-C RNA editing affects the mRNA stability of nuclear genes in Arabidopsis thaliana. Biochemical and Biophysical Research Communications. 571, 110-117 (2021).
