Een nonsequencing-benadering voor de snelle detectie van RNA-bewerking
Summary
Snelle detectie en betrouwbare kwantificering van RNA-bewerkingsgebeurtenissen op genomische schaal blijven een uitdaging en vertrouwen momenteel op directe RNA-sequencingmethoden. Het hier beschreven protocol maakt gebruik van microtemperature gradient gel elektroforese (μTGGE) als een eenvoudige, snelle en draagbare methode om RNA-bewerking te detecteren.
Abstract
RNA-bewerking is een proces dat leidt tot posttranscriptionele sequentieveranderingen in RNA’s. Detectie en kwantificering van RNA-bewerking zijn voornamelijk afhankelijk van Sanger-sequencing- en RNA-sequencingtechnieken. Deze methoden kunnen echter kostbaar en tijdrovend zijn. In dit protocol wordt een draagbaar microtemperature gradient gel elektroforese (μTGGE) systeem gebruikt als een nonsequencing benadering voor de snelle detectie van RNA-bewerking. Het proces is gebaseerd op het principe van elektroforese, waarbij hoge temperaturen worden gebruikt om nucleïnezuurmonsters te denatureren terwijl ze over een polyacrylamidegel bewegen. Over een temperatuurbereik vormt een DNA-fragment een gradiënt van volledig dubbelstrengs DNA naar gedeeltelijk gescheiden strengen en vervolgens naar volledig gescheiden enkelstrengs DNA. RNA-bewerkte sites met verschillende nucleotidebasen produceren verschillende smeltprofielen in μTGGE-analyses. We gebruikten de op μTGGE gebaseerde benadering om de verschillen tussen de smeltprofielen van vier bewerkte RNA-fragmenten en hun overeenkomstige niet-bewerkte (wild-type) fragmenten te karakteriseren. Pattern Similarity Scores (PaSSs) werden berekend door de bandpatronen geproduceerd door de bewerkte en niet-bewerkte RNA’s te vergelijken en werden gebruikt om de reproduceerbaarheid van de methode te beoordelen. Over het algemeen maakt het hier beschreven platform de detectie van zelfs enkele basemutaties in RNA’s op een eenvoudige, eenvoudige en kosteneffectieve manier mogelijk. Verwacht wordt dat deze analysetool nieuwe bevindingen van de moleculaire biologie zal helpen.
Introduction
Enkelvoudige nucleotidevarianten (SNV’s) in genomisch RNA, waaronder A-to-I,C-to-U en U-to-C-varianten, kunnen wijzen op RNA-bewerkingsgebeurtenissen. De detectie van SNV’s in RNA blijft echter een technisch uitdagende taak. Conventioneel wordt de verhouding tussen bewerkt en niet-bewerkt RNA bepaald door directe sequencing, allel-specifieke real-time polymerasekettingreactie (PCR) of denaturerende high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) benadert 1,2,3,4,5,6. Deze benaderingen zijn echter niet bijzonder tijd- of kosteneffectief en hun lage nauwkeurigheid, veroorzaakt door hoge geluidsniveaus, vormt technologische knelpunten voor op RNA gebaseerde SNV-detectie 7,8. Hier beschrijven we een protocol op basis van temperatuurgradiëntgel-elektroforese (TGGE) om single nucleotide polymorfismen (SNP’s) te identificeren als een alternatieve methode die de noodzaak van directe RNA-sequencingbenaderingen voor RNA-bewerkingsanalyses elimineert.
Elektroforese is een voorkeursmethode voor de scheiding en analyse van biomoleculen in life science laboratoria. TGGE maakt de scheiding mogelijk van dubbelstrengs DNA-fragmenten die even groot zijn maar verschillende sequenties hebben. De techniek is gebaseerd op sequentiegerelateerde verschillen in de smelttemperaturen van DNA-fragmenten en daaropvolgende veranderingen in hun mobiliteit in poreuze gels met een lineaire temperatuurgradiëntvan 9,10. Het smelten van DNA-fragmenten genereert specifieke smeltprofielen. Zodra het domein met de laagste smelttemperatuur de overeenkomstige temperatuur op een bepaalde positie in de gel bereikt, vindt de overgang van een spiraalvormige structuur naar een gedeeltelijk gesmolten structuur plaats en zal de migratie van het molecuul praktisch stoppen. Daarom maakt TGGE gebruik van zowel mobiliteit (grootte-informatie) als temperatuur-geïnduceerde structurele overgangen van DNA-fragmenten (sequentie-afhankelijke informatie), waardoor het een krachtige benadering is voor de karakterisering van DNA-fragmenten. De kenmerkpunten in een TGGE-smeltpatroon, die overeenkomen met drie structurele overgangen van het DNA-molecuul, zijn het strenginitiële-dissociatiepunt, het strengmiddendissociatiepunt en het einddissociatiepunt van de streng (figuur 1). Sequentievariaties binnen domeinen, zelfs single-base verschillen, beïnvloeden de smelttemperatuur, vandaar dat moleculen met verschillende sequenties discrete smeltpatronen (denaturatie) vertonen in TGGE-analyses. Daarom kan TGGE worden gebruikt om SNV’s in genomisch RNA te analyseren en kan het een onschatbare high-throughput methode zijn voor het detecteren van RNA-bewerking. Deze winst met hoge doorvoer gaat verloren wanneer traditionele op gel-elektroforese gebaseerde TGGE wordt gebruikt. Een geminiaturiseerde versie van TGGE, genaamd microTGGE (μTGGE), kan echter worden gebruikt om de gel-elektroforetische tijd te verkorten en de analyse te versnellen met een 100-voudige toename van de productiviteit11. De eenvoud en compactheid van de μTGGE-methode zijn verbeterd door de introductie van PalmPAGE12, een in de praktijk toepasbaar, handheld en betaalbaar gel-elektroforesesysteem.
Hier wordt een nieuw op TGGE gebaseerd protocol gebruikt om drie soorten RNA-bewerkingsplaatsen (A-to-I, C-to-U en U-to-C) in vier genen te onderzoeken, waaronder twee van Arabidopsis thaliana-weefsels en twee tot expressie gebracht in HEK293-cellen van zoogdieren (figuur 1A). Het protocol integreert het gebruik van PalmPAGE (hardware), een draagbaar systeem voor de snelle detectie van RNA-bewerking, en uMelt (software)13. Met een gemiddelde looptijd van 15-30 minuten maakt dit protocol een snelle, betrouwbare en eenvoudige identificatie van RNA-bewerking mogelijk zonder de noodzaak van directe RNA-sequencingbenaderingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
RNA-bewerking speelt een belangrijke rol in de biologie; de huidige methoden voor het detecteren van RNA-bewerking, zoals chromatografie en sequencing, vormen echter verschillende uitdagingen vanwege hun hoge kosten, overmatige tijdsvereisten en complexiteit. Het hier beschreven protocol is een eenvoudige, snelle en kosteneffectieve methode voor het detecteren van RNA-bewerking die een draagbaar, gemicrosized, TGGE-gebaseerd systeem gebruikt. Dit systeem kan worden gebruikt om onderscheid te maken tussen bewerkte en niet…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een Grant-in-Aid for Scientific Research van de Japan Society for the Promotion of Science (17H02204 en 18K19288). Ruchika werd financieel ondersteund door de Japanse overheid (MEXT-beurs). We bedanken mevrouw Radhika Biyani (Takagi Laboratory, JAIST) en Dr. Kirti Sharma (BioSeeds Corporation) voor hulp bij elektroforese-gerelateerde experimenten.
Materials
| 2U ExoI | Takara | 2650A | Exonuclease I |
| 40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1) | Thermo fisher | AM9022 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Thermo Fisher | 17874 | |
| Centrifuge Mini spin | eppendorf | 5452000034 | |
| Digital dry bath/ block heater | Thermo fisher | NA | |
| Gold Taq Polymerase Master mixture | Promega | M7122 | |
| LATaq DNA polymerase | TAKARA | RR002A | Taq Polymerase |
| micro-TGGE cassette holder | BioSeeds Corp. | BS-GE-CH | |
| micro-TGGE apparatus | Lifetech Corp. | TG | |
| micro-TGGE gel cassette | BioSeeds Corp. | BS-TGGE-C | |
| NanoDrop 1000 | Thermo fisher | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Plant Rneasy Mini kit | Qiagen | 74904 | |
| ReverTra Ace Master Mix | TOYOBO | TRT101 | M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase |
| Rneasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase | Takara | 2660B | |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Thermo fisher | S11494 | |
| TBE buffer | Thermo fisher | B52 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai tesque | 33401-72 | |
| Urea, Nuclease and protease tested | Nacalai tesque | 35940-65 |
References
- Chateigner-Boutin, A. L., Small, I. A rapid high-throughput method for the detection and quantification of RNA editing based on high-resolution melting of amplicons. Nucleic Acids Research. 35 (17), 114 (2007).
- Chen, Y. C., et al. A real-time PCR method for the quantitative analysis of RNA editing at specific sites. Analytical Biochemistry. 375 (1), 46-52 (2008).
- Barbon, A., Vallini, I., La Via, L., Marchina, E., Barlati, S. Glutamate receptor RNA editing: a molecular analysis of GluR2, GluR5 and GluR6 in human brain tissues and in NT2 cells following in vitro neural differentiation. Molecular Brain Research. 117 (2), 168-178 (2003).
- Gallo, A., Thomson, E., Brindle, J., O’Connell, M. A., Keegan, L. P. Micro-processing events in mRNAs identified by DHPLC analysis. Nucleic Acids Research. 30 (18), 3945-3953 (2002).
- Schiffer, H. H., Heinemann, S. F. A Quantitative method to detect RNA editing events. Analytical Biochemistry. 276 (2), 257-260 (1999).
- Burns, C. M., et al. Regulation of serotonin-2C receptor G-protein coupling by RNA editing. Nature. 387 (6630), 303-308 (1997).
- Marian, A. J. The bottleneck in genetic testing. Circulation Research. 117 (7), 586-588 (2015).
- Bird, A. Genome biology: Not drowning but waving. Cell. 154 (5), 951-952 (2013).
- Jones, B. M., Knapp, L. A. Temporal temperature gradient electrophoresis for detection of single nucleotide polymorphisms. Methods in Molecular Biology. 578, 153-165 (2009).
- Riesner, D., et al. Temperature-gradient gel electrophoresis of nucleic acids: analysis of conformational transitions, sequence variations, and protein-nucleic acid interactions. Electrophoresis. 10 (5-6), 377-389 (1989).
- Biyani, M., Nishigaki, K. Hundred-fold productivity of genome analysis by introduction of micro-temperature gradient gel electrophoresis. Electrophoresis. 22 (1), 23-28 (2001).
- Rathore, H., Biyani, R., Kato, H., Takamura, Y., Biyani, M. Palm-size and one-inch gel electrophoretic device for reliable and field-applicable analysis of recombinase polymerase amplification. Analytical Methods. 11 (39), 4969-4976 (2019).
- Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
- Bhakta, S., Sakari, M., Tsukahara, T. RNA editing of BFP, a point mutant of GFP, using artificial APOBEC1 deaminase to restore the genetic code. Scientific Reports. 10 (1), 17304 (2020).
- Azad, T. A., Qulsum, U., Tsukahara, T. Comparative activity of adenosine deaminase acting on RNA (ADARs) isoforms for correction of genetic code in gene therapy. Current Gene Therapy. 19 (1), 31-39 (2019).
- Ruchika, O. C., Sakari, M., Tsukahara, T. Genome-wide identification of U-To-C RNA editing events for nuclear genes in Arabidopsis thaliana. Cells. 10 (3), 635 (2021).
- Tsukahara, T. The U-to-C RNA editing affects the mRNA stability of nuclear genes in Arabidopsis thaliana. Biochemical and Biophysical Research Communications. 571, 110-117 (2021).
