Ein Nonsequencing-Ansatz für den schnellen Nachweis der RNA-Editierung
Summary
Der schnelle Nachweis und die zuverlässige Quantifizierung von RNA-Editing-Ereignissen auf genomischer Ebene bleiben eine Herausforderung und basieren derzeit auf direkten RNA-Sequenzierungsmethoden. Das hier beschriebene Protokoll verwendet die Mikrotemperaturgradientengelelektrophorese (μTGGE) als einfache, schnelle und tragbare Methode zum Nachweis der RNA-Bearbeitung.
Abstract
RNA-Editing ist ein Prozess, der zu posttranskriptionellen Sequenzveränderungen in RNAs führt. Der Nachweis und die Quantifizierung der RNA-Editierung beruhen hauptsächlich auf Sanger-Sequenzierungs- und RNA-Sequenzierungstechniken. Diese Methoden können jedoch kostspielig und zeitaufwendig sein. In diesem Protokoll wird ein tragbares Mikrotemperatur-Gradienten-Gelelektrophorese-System (μTGGE) als Nicht-Sequenzierungsansatz für den schnellen Nachweis der RNA-Editierung verwendet. Das Verfahren basiert auf dem Prinzip der Elektrophorese, bei der bei hohen Temperaturen Nukleinsäureproben denaturiert werden, während sie sich über ein Polyacrylamidgel bewegen. Über einen Temperaturbereich hinweg bildet ein DNA-Fragment einen Gradienten von vollständig doppelsträngiger DNA zu teilweise getrennten Strängen und dann zu vollständig getrennter einzelsträngiger DNA. RNA-editierte Stellen mit unterschiedlichen Nukleotidbasen erzeugen unterschiedliche Schmelzprofile in μTGGE-Analysen. Wir verwendeten den μTGGE-basierten Ansatz, um die Unterschiede zwischen den Schmelzprofilen von vier editierten RNA-Fragmenten und ihren entsprechenden nicht editierten (Wildtyp-) Fragmenten zu charakterisieren. Pattern Similarity Scores (PaSSs) wurden durch den Vergleich der von den editierten und nicht editierten RNAs erzeugten Bandmuster berechnet und zur Beurteilung der Reproduzierbarkeit der Methode verwendet. Insgesamt ermöglicht die hier beschriebene Plattform den unkomplizierten, einfachen und kostengünstigen Nachweis auch einzelner Basenmutationen in RNAs. Es wird erwartet, dass dieses Analysewerkzeug neue molekularbiologische Erkenntnisse unterstützen wird.
Introduction
Einzelne Nukleotidvarianten (SNVs) in genomischer RNA, einschließlich A-zu-I-, C-zu-U- und U-zu-C-Varianten, können auf RNA-Editierereignisse hinweisen. Der Nachweis von SNVs in RNA bleibt jedoch eine technisch anspruchsvolle Aufgabe. Herkömmlicherweise wird das Verhältnis von editierter zu nicht editierter RNA durch direkte Sequenzierung, allelspezifische Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder denaturierende Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) bestimmt, diesich 1,2,3,4,5,6 nähert. Diese Ansätze sind jedoch nicht besonders zeit- oder kosteneffizient, und ihre geringen Genauigkeiten, die durch hohe Geräuschpegel verursacht werden, stellen technologische Engpässe für den RNA-basierten SNV-Nachweis dar 7,8. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das auf der Temperaturgradientengelelektrophorese (TGGE) basiert, um einzelne Nukleotidpolymorphismen (SNPs) als alternative Methode zu identifizieren, die die Notwendigkeit direkter RNA-Sequenzierungsansätze für RNA-Editing-Analysen eliminiert.
Die Elektrophorese ist eine bevorzugte Methode zur Trennung und Analyse von Biomolekülen in Life-Science-Labors. TGGE ermöglicht die Trennung von doppelsträngigen DNA-Fragmenten, die gleich groß sind, aber unterschiedliche Sequenzen haben. Die Technik beruht auf sequenzbezogenen Unterschieden in den Schmelztemperaturen von DNA-Fragmenten und nachfolgenden Veränderungen ihrer Beweglichkeiten in porösen Gelen mit einem linearen Temperaturgradienten 9,10. Durch das Schmelzen von DNA-Fragmenten entstehen spezifische Schmelzprofile. Sobald die Domäne mit der niedrigsten Schmelztemperatur die entsprechende Temperatur an einer bestimmten Position im Gel erreicht, erfolgt der Übergang von einer helikalen Struktur zu einer teilweise geschmolzenen Struktur, und die Migration des Moleküls wird praktisch gestoppt. Daher nutzt TGGE sowohl Mobilität (Größeninformation) als auch temperaturinduzierte strukturelle Übergänge von DNA-Fragmenten (sequenzabhängige Information) und ist damit ein leistungsfähiger Ansatz zur Charakterisierung von DNA-Fragmenten. Die Merkmalspunkte in einem TGGE-Schmelzmuster, die drei strukturellen Übergängen des DNA-Moleküls entsprechen, sind der Stranginitialdissoziationspunkt, der Strangmitteldissoziationspunkt und der Strangenddissoziationspunkt (Abbildung 1). Sequenzvariationen innerhalb von Domänen, sogar Unterschiede bei Einzelbasen, beeinflussen die Schmelztemperatur, daher zeigen Moleküle mit unterschiedlichen Sequenzen diskrete Schmelzmuster (Denaturierungsmuster) in TGGE-Analysen. Daher kann TGGE zur Analyse von SNVs in genomischer RNA verwendet werden und kann eine unschätzbare Hochdurchsatzmethode zum Nachweis der RNA-Editierung sein. Dieser hohe Durchsatzgewinn geht verloren, wenn herkömmliches TGGE auf Gelelektrophoresebasis verwendet wird. Eine miniaturisierte Version von TGGE, genannt microTGGE (μTGGE), kann jedoch verwendet werden, um die gelelektrophoretische Zeit zu verkürzen und die Analyse mit einer 100-fachen Produktivitätssteigerungzu beschleunigen 11. Die Einfachheit und Kompaktheit der μTGGE-Methode wurde durch die Einführung von PalmPAGE12, einem praxistauglichen, tragbaren und erschwinglichen Gelelektrophoresesystem, verbessert.
Hier wird ein neues TGGE-basiertes Protokoll verwendet, um drei Arten von RNA-Editierstellen (A-zu-I, C-zu-U und U-zu-C) in vier Genen zu untersuchen, darunter zwei aus Arabidopsis thaliana-Geweben und zwei in HEK293-Zellen von Säugetieren exprimiert (Abbildung 1A). Das Protokoll integriert die Verwendung von PalmPAGE (Hardware), einem tragbaren System zur schnellen Detektion von RNA-Editierung, und uMelt (Software)13. Mit einer durchschnittlichen Laufzeit von 15-30 min ermöglicht dieses Protokoll eine schnelle, zuverlässige und einfache Identifizierung der RNA-Bearbeitung, ohne dass direkte RNA-Sequenzierungsansätze erforderlich sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
RNA-Editieren spielt eine wichtige Rolle in der Biologie; Aktuelle Methoden zum Nachweis der RNA-Editierung, wie Chromatographie und Sequenzierung, stellen jedoch aufgrund ihrer hohen Kosten, ihres übermäßigen Zeitaufwands und ihrer Komplexität mehrere Herausforderungen dar. Das hier beschriebene Protokoll ist eine einfache, schnelle und kostengünstige Methode zum Nachweis der RNA-Bearbeitung, die ein tragbares, mikroskaliertes, TGGE-basiertes System verwendet. Dieses System kann verwendet werden, um vor der Sanger-…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch einen Grant-in-Aid for Scientific Research der Japan Society for the Promotion of Science (17H02204 und 18K19288) unterstützt. Ruchika wurde von der japanischen Regierung finanziell unterstützt (MEXT-Stipendium). Wir danken Frau Radhika Biyani (Takagi Laboratory, JAIST) und Dr. Kirti Sharma (BioSeeds Corporation) für ihre Hilfe bei elektrophoresebezogenen Experimenten.
Materials
| 2U ExoI | Takara | 2650A | Exonuclease I |
| 40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1) | Thermo fisher | AM9022 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Thermo Fisher | 17874 | |
| Centrifuge Mini spin | eppendorf | 5452000034 | |
| Digital dry bath/ block heater | Thermo fisher | NA | |
| Gold Taq Polymerase Master mixture | Promega | M7122 | |
| LATaq DNA polymerase | TAKARA | RR002A | Taq Polymerase |
| micro-TGGE cassette holder | BioSeeds Corp. | BS-GE-CH | |
| micro-TGGE apparatus | Lifetech Corp. | TG | |
| micro-TGGE gel cassette | BioSeeds Corp. | BS-TGGE-C | |
| NanoDrop 1000 | Thermo fisher | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Plant Rneasy Mini kit | Qiagen | 74904 | |
| ReverTra Ace Master Mix | TOYOBO | TRT101 | M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase |
| Rneasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase | Takara | 2660B | |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Thermo fisher | S11494 | |
| TBE buffer | Thermo fisher | B52 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai tesque | 33401-72 | |
| Urea, Nuclease and protease tested | Nacalai tesque | 35940-65 |
References
- Chateigner-Boutin, A. L., Small, I. A rapid high-throughput method for the detection and quantification of RNA editing based on high-resolution melting of amplicons. Nucleic Acids Research. 35 (17), 114 (2007).
- Chen, Y. C., et al. A real-time PCR method for the quantitative analysis of RNA editing at specific sites. Analytical Biochemistry. 375 (1), 46-52 (2008).
- Barbon, A., Vallini, I., La Via, L., Marchina, E., Barlati, S. Glutamate receptor RNA editing: a molecular analysis of GluR2, GluR5 and GluR6 in human brain tissues and in NT2 cells following in vitro neural differentiation. Molecular Brain Research. 117 (2), 168-178 (2003).
- Gallo, A., Thomson, E., Brindle, J., O’Connell, M. A., Keegan, L. P. Micro-processing events in mRNAs identified by DHPLC analysis. Nucleic Acids Research. 30 (18), 3945-3953 (2002).
- Schiffer, H. H., Heinemann, S. F. A Quantitative method to detect RNA editing events. Analytical Biochemistry. 276 (2), 257-260 (1999).
- Burns, C. M., et al. Regulation of serotonin-2C receptor G-protein coupling by RNA editing. Nature. 387 (6630), 303-308 (1997).
- Marian, A. J. The bottleneck in genetic testing. Circulation Research. 117 (7), 586-588 (2015).
- Bird, A. Genome biology: Not drowning but waving. Cell. 154 (5), 951-952 (2013).
- Jones, B. M., Knapp, L. A. Temporal temperature gradient electrophoresis for detection of single nucleotide polymorphisms. Methods in Molecular Biology. 578, 153-165 (2009).
- Riesner, D., et al. Temperature-gradient gel electrophoresis of nucleic acids: analysis of conformational transitions, sequence variations, and protein-nucleic acid interactions. Electrophoresis. 10 (5-6), 377-389 (1989).
- Biyani, M., Nishigaki, K. Hundred-fold productivity of genome analysis by introduction of micro-temperature gradient gel electrophoresis. Electrophoresis. 22 (1), 23-28 (2001).
- Rathore, H., Biyani, R., Kato, H., Takamura, Y., Biyani, M. Palm-size and one-inch gel electrophoretic device for reliable and field-applicable analysis of recombinase polymerase amplification. Analytical Methods. 11 (39), 4969-4976 (2019).
- Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
- Bhakta, S., Sakari, M., Tsukahara, T. RNA editing of BFP, a point mutant of GFP, using artificial APOBEC1 deaminase to restore the genetic code. Scientific Reports. 10 (1), 17304 (2020).
- Azad, T. A., Qulsum, U., Tsukahara, T. Comparative activity of adenosine deaminase acting on RNA (ADARs) isoforms for correction of genetic code in gene therapy. Current Gene Therapy. 19 (1), 31-39 (2019).
- Ruchika, O. C., Sakari, M., Tsukahara, T. Genome-wide identification of U-To-C RNA editing events for nuclear genes in Arabidopsis thaliana. Cells. 10 (3), 635 (2021).
- Tsukahara, T. The U-to-C RNA editing affects the mRNA stability of nuclear genes in Arabidopsis thaliana. Biochemical and Biophysical Research Communications. 571, 110-117 (2021).
