En icke-sekvenseringsmetod för snabb detektion av RNA-redigering
Summary
Snabb detektion och tillförlitlig kvantifiering av RNA-redigeringshändelser i genomisk skala är fortfarande utmanande och förlitar sig för närvarande på direkta RNA-sekvenseringsmetoder. Protokollet som beskrivs här använder mikrotemperaturgradientgelelektrofores (μTGGE) som en enkel, snabb och bärbar metod för att detektera RNA-redigering.
Abstract
RNA-redigering är en process som leder till posttranskriptionella sekvensförändringar i RNA. Detektion och kvantifiering av RNA-redigering bygger huvudsakligen på Sanger-sekvensering och RNA-sekvenseringstekniker. Dessa metoder kan dock vara kostsamma och tidskrävande. I detta protokoll används ett bärbart mikrotemperaturgradientgelelektroforessystem (μTGGE) som en icke-sekvenseringsmetod för snabb detektion av RNA-redigering. Processen är baserad på principen om elektrofores, som använder höga temperaturer för att denaturera nukleinsyraprover när de rör sig över en polyakrylamidgel. Över ett temperaturområde bildar ett DNA-fragment en gradient av helt dubbelsträngat DNA till delvis separerade strängar och sedan till helt separerat enkelsträngat DNA. RNA-redigerade platser med distinkta nukleotidbaser producerar olika smältprofiler i μTGGE-analyser. Vi använde det μTGGE-baserade tillvägagångssättet för att karakterisera skillnaderna mellan smältprofilerna för fyra redigerade RNA-fragment och deras motsvarande icke-redigerade (vildtyp) fragment. Pattern Similarity Scores (PaSS) beräknades genom att jämföra bandmönstren som producerades av de redigerade och icke-redigerade RNA: erna och användes för att bedöma metodens reproducerbarhet. Sammantaget möjliggör plattformen som beskrivs här detektering av även enskilda basmutationer i RNA på ett enkelt, enkelt och kostnadseffektivt sätt. Det förväntas att detta analysverktyg kommer att hjälpa nya molekylärbiologiska fynd.
Introduction
Enstaka nukleotidvarianter (SNV) i genomiskt RNA, inklusive A-till-I,C-till-U och U-till-C-varianter, kan indikera RNA-redigeringshändelser. Detektionen av SNV i RNA är dock fortfarande en tekniskt utmanande uppgift. Konventionellt bestäms förhållandet mellan redigerat och icke-redigerat RNA genom direkt sekvensering, allelspecifik realtidspolymeraskedjereaktion (PCR) eller denaturering av högpresterande vätskekromatografi (HPLC) närmar sig 1,2,3,4,5,6. Dessa metoder är dock inte särskilt tids- eller kostnadseffektiva, och deras låga noggrannhet, orsakad av höga ljudnivåer, utgör tekniska flaskhalsar för RNA-baserad SNV-detektering 7,8. Här beskriver vi ett protokoll baserat på temperaturgradientgelelektrofores (TGGE) för att identifiera enstaka nukleotidpolymorfismer (SNP) som en alternativ metod som eliminerar behovet av direkta RNA-sekvenseringsmetoder för RNA-redigeringsanalyser.
Elektrofores är en föredragen metod för separation och analys av biomolekyler i life science-laboratorier. TGGE möjliggör separation av dubbelsträngade DNA-fragment som är lika stora men har olika sekvenser. Tekniken bygger på sekvensrelaterade skillnader i DNA-fragmentens smälttemperaturer och efterföljande förändringar i deras mobiliteter i porösa geler med en linjär temperaturgradient 9,10. Smältning av DNA-fragment genererar specifika smältprofiler. När domänen med den lägsta smälttemperaturen når motsvarande temperatur vid en viss position i gelén sker övergången från en spiralformad struktur till en delvis smält struktur och migrationen av molekylen kommer praktiskt taget att stanna. Därför använder TGGE både rörlighet (storleksinformation) och temperaturinducerade strukturella övergångar av DNA-fragment (sekvensberoende information), vilket gör det till ett kraftfullt tillvägagångssätt för karakterisering av DNA-fragment. Funktionspunkterna i ett TGGE-smältmönster, som motsvarar tre strukturella övergångar av DNA-molekylen, är strängens initialdissociationspunkt, strängens mittdissociationspunkt och strängens end-dissociationspunkt (figur 1). Sekvensvariationer inom domäner, även skillnader i en bas, påverkar smälttemperaturen, varför molekyler med olika sekvenser kommer att visa diskreta smältmönster (denaturering) i TGGE-analyser. Därför kan TGGE användas för att analysera SNV i genomiskt RNA och kan vara en ovärderlig metod med hög genomströmning för att detektera RNA-redigering. Denna förstärkning med hög genomströmning går förlorad när traditionell gelelektroforesbaserad TGGE används. En miniatyriserad version av TGGE, kallad microTGGE (μTGGE), kan dock användas för att förkorta gelelektroforetisk tid och påskynda analysen med en 100-faldig produktivitetsökning11. Enkelheten och kompaktiteten hos μTGGE-metoden har förbättrats genom introduktionen av PalmPAGE12, ett fälttillämpligt, handhållet och prisvärt gelelektroforessystem.
Här används ett nytt TGGE-baserat protokoll för att undersöka tre typer av RNA-redigeringsställen (A-till-I, C-till-U och U-till-C) i fyra gener, inklusive två från Arabidopsis thaliana-vävnader och två uttryckta i däggdjur HEK293-celler (Figur 1A). Protokollet integrerar användningen av PalmPAGE (hårdvara), ett bärbart system för snabb detektion av RNA-redigering, och uMelt (programvara)13. Med en genomsnittlig körtid på 15-30 minuter möjliggör detta protokoll snabb, tillförlitlig och enkel identifiering av RNA-redigering utan behov av direkta RNA-sekvenseringsmetoder.
Protocol
Representative Results
Discussion
RNA-redigering spelar en viktig roll i biologin; Nuvarande metoder för att detektera RNA-redigering, såsom kromatografi och sekvensering, utgör emellertid flera utmaningar på grund av deras höga kostnader, överdrivna tidskrav och komplexitet. Protokollet som beskrivs här är en enkel, snabb och kostnadseffektiv metod för att detektera RNA-redigering som använder ett bärbart, mikrosized, TGGE-baserat system. Detta system kan användas för att skilja mellan redigerade och icke-redigerade gener före Sanger-sekve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av ett grant-in-aid för vetenskaplig forskning från Japan Society for the Promotion of Science (17H02204 och 18K19288). Ruchika stöddes ekonomiskt av den japanska regeringen (MEXT-stipendium). Vi tackar Radhika Biyani (Takagi Laboratory, JAIST) och Dr. Kirti Sharma (BioSeeds Corporation) för hjälp med elektroforesrelaterade experiment.
Materials
| 2U ExoI | Takara | 2650A | Exonuclease I |
| 40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1) | Thermo fisher | AM9022 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Thermo Fisher | 17874 | |
| Centrifuge Mini spin | eppendorf | 5452000034 | |
| Digital dry bath/ block heater | Thermo fisher | NA | |
| Gold Taq Polymerase Master mixture | Promega | M7122 | |
| LATaq DNA polymerase | TAKARA | RR002A | Taq Polymerase |
| micro-TGGE cassette holder | BioSeeds Corp. | BS-GE-CH | |
| micro-TGGE apparatus | Lifetech Corp. | TG | |
| micro-TGGE gel cassette | BioSeeds Corp. | BS-TGGE-C | |
| NanoDrop 1000 | Thermo fisher | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Plant Rneasy Mini kit | Qiagen | 74904 | |
| ReverTra Ace Master Mix | TOYOBO | TRT101 | M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase |
| Rneasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase | Takara | 2660B | |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Thermo fisher | S11494 | |
| TBE buffer | Thermo fisher | B52 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai tesque | 33401-72 | |
| Urea, Nuclease and protease tested | Nacalai tesque | 35940-65 |
References
- Chateigner-Boutin, A. L., Small, I. A rapid high-throughput method for the detection and quantification of RNA editing based on high-resolution melting of amplicons. Nucleic Acids Research. 35 (17), 114 (2007).
- Chen, Y. C., et al. A real-time PCR method for the quantitative analysis of RNA editing at specific sites. Analytical Biochemistry. 375 (1), 46-52 (2008).
- Barbon, A., Vallini, I., La Via, L., Marchina, E., Barlati, S. Glutamate receptor RNA editing: a molecular analysis of GluR2, GluR5 and GluR6 in human brain tissues and in NT2 cells following in vitro neural differentiation. Molecular Brain Research. 117 (2), 168-178 (2003).
- Gallo, A., Thomson, E., Brindle, J., O’Connell, M. A., Keegan, L. P. Micro-processing events in mRNAs identified by DHPLC analysis. Nucleic Acids Research. 30 (18), 3945-3953 (2002).
- Schiffer, H. H., Heinemann, S. F. A Quantitative method to detect RNA editing events. Analytical Biochemistry. 276 (2), 257-260 (1999).
- Burns, C. M., et al. Regulation of serotonin-2C receptor G-protein coupling by RNA editing. Nature. 387 (6630), 303-308 (1997).
- Marian, A. J. The bottleneck in genetic testing. Circulation Research. 117 (7), 586-588 (2015).
- Bird, A. Genome biology: Not drowning but waving. Cell. 154 (5), 951-952 (2013).
- Jones, B. M., Knapp, L. A. Temporal temperature gradient electrophoresis for detection of single nucleotide polymorphisms. Methods in Molecular Biology. 578, 153-165 (2009).
- Riesner, D., et al. Temperature-gradient gel electrophoresis of nucleic acids: analysis of conformational transitions, sequence variations, and protein-nucleic acid interactions. Electrophoresis. 10 (5-6), 377-389 (1989).
- Biyani, M., Nishigaki, K. Hundred-fold productivity of genome analysis by introduction of micro-temperature gradient gel electrophoresis. Electrophoresis. 22 (1), 23-28 (2001).
- Rathore, H., Biyani, R., Kato, H., Takamura, Y., Biyani, M. Palm-size and one-inch gel electrophoretic device for reliable and field-applicable analysis of recombinase polymerase amplification. Analytical Methods. 11 (39), 4969-4976 (2019).
- Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
- Bhakta, S., Sakari, M., Tsukahara, T. RNA editing of BFP, a point mutant of GFP, using artificial APOBEC1 deaminase to restore the genetic code. Scientific Reports. 10 (1), 17304 (2020).
- Azad, T. A., Qulsum, U., Tsukahara, T. Comparative activity of adenosine deaminase acting on RNA (ADARs) isoforms for correction of genetic code in gene therapy. Current Gene Therapy. 19 (1), 31-39 (2019).
- Ruchika, O. C., Sakari, M., Tsukahara, T. Genome-wide identification of U-To-C RNA editing events for nuclear genes in Arabidopsis thaliana. Cells. 10 (3), 635 (2021).
- Tsukahara, T. The U-to-C RNA editing affects the mRNA stability of nuclear genes in Arabidopsis thaliana. Biochemical and Biophysical Research Communications. 571, 110-117 (2021).
