Quantificazione a livello globale delle modifiche post-traduzionali degli istoni in un modello di coltura cellulare 3D del tessuto epatico

Summary

Questo protocollo delinea come un sistema di coltura cellulare tridimensionale può essere utilizzato per modellare, trattare e analizzare le modifiche della cromatina in uno stato quasi fisiologico.

Abstract

Le colture piatte di cellule di mammifero sono un approccio in vitro ampiamente utilizzato per comprendere la fisiologia cellulare, ma questo sistema è limitato nella modellazione dei tessuti solidi a causa della replicazione cellulare innaturalmente rapida. Ciò è particolarmente difficile quando si modella la cromatina matura, poiché le cellule a replicazione rapida sono spesso coinvolte nella replicazione del DNA e hanno una popolazione poliploide eterogenea. Di seguito è presentato un flusso di lavoro per la modellazione, il trattamento e l’analisi delle modifiche della cromatina quiescente utilizzando un sistema di coltura cellulare tridimensionale (3D). Utilizzando questo protocollo, le linee cellulari di carcinoma epatocellulare vengono coltivate come sferoidi 3D riproducibili in un incubatore che fornisce una diffusione attiva dei nutrienti e basse forze di taglio. Il trattamento con butirrato di sodio e succinato di sodio ha indotto un aumento rispettivamente dell’acetilazione e della succinilazione degli istoni. Gli aumenti dei livelli di acetilazione e succinilazione degli istoni sono associati a uno stato di cromatina più aperto. Gli sferoidi vengono quindi raccolti per l’isolamento dei nuclei cellulari, da cui vengono estratte le proteine istoniche per l’analisi delle loro modificazioni post-traduzionali. L’analisi degli istoni viene eseguita tramite cromatografia liquida accoppiata online con spettrometria di massa tandem, seguita da una pipeline computazionale interna. Infine, vengono mostrati esempi di rappresentazione dei dati per indagare la frequenza e la presenza di segni di istoni combinatori.

Introduction

Dalla fine del 19^° secolo, i sistemi di coltura cellulare sono stati utilizzati come modello per studiare la crescita e lo sviluppo delle cellule al di fuori del corpo umano ^1,2. Il loro uso è stato esteso anche per studiare come funzionano i tessuti e gli organi in contesti sia sani che malati ^1,3. Le cellule in sospensione (ad esempio, le cellule del sangue) crescono in piastre di Petri o fiaschi senza soluzione di continuità e in modo intercambiabile poiché non si assemblano in strutture tridimensionali (3D) in vivo. Le cellule derivate da organi solidi possono crescere in sistemi di coltura bidimensionali (2D) o 3D. Nella coltura 2D, le cellule vengono coltivate in un monostrato che aderisce a una superficie^{piana 2,4}. I sistemi di coltura cellulare 2D sono caratterizzati da una crescita esponenziale e da un tempo di raddoppio rapido, in genere da 24 ore a pochi giorni⁵. Le cellule nei sistemi 3D crescono fino a formare intricate interazioni cellula-cellula modellando più da vicino conglomerati simili a tessuti e sono caratterizzate dalla loro capacità di raggiungere un equilibrio dinamico in cui il loro tempo di raddoppio può raggiungere 1 mese o più⁵.

In questo articolo viene presentata una metodologia innovativa per far crescere sferoidi 3D in sistemi di coltura cellulare rotante che simulano la gravità ridotta⁶. Questo è un derivato semplificato di un sistema di coltura cellulare introdotto dalla NASA nel 1990⁷. Questo approccio riduce al minimo le forze di taglio, che si verificano nei metodi esistenti come i palloni rotanti, e aumenta la riproducibilità dello sferoide⁶. Inoltre, il bioreattore rotante aumenta la diffusione attiva dei nutrienti, riducendo al minimo la formazione necrotica che si verifica in sistemi come la coltura cellulare a goccia sospesa in cui lo scambio di media non è pratico⁶. In questo modo, le cellule crescono per lo più indisturbate, consentendo la formazione di caratteristiche strutturali e fisiologiche associate alle cellule che crescono nei tessuti. Gli epatociti C3A (HepG2 / C3A) coltivati in questo modo non solo avevano organelli ultrastrutturali, ma producevano anche quantità di ATP, adenilato chinasi, urea e colesterolo paragonabili ai livelli osservati in vivo ^1,2. Inoltre, le cellule cresciute in sistemi di coltura cellulare 2D vs.3D presentano diversi modelli di espressione genica⁸. L’analisi dell’espressione genica degli epatociti C3A cresciuti come sferoidi 3D ha mostrato che queste cellule esprimevano una vasta gamma di proteine specifiche del fegato, nonché geni coinvolti in percorsi chiave che regolano la funzionalità epatica⁸. Pubblicazioni precedenti hanno dimostrato le differenze tra i proteomi di cellule in crescita esponenziale in coltura 2D rispetto alle cellule in equilibrio dinamico in colture sferoidi 3D⁵. Queste differenze includono il metabolismo cellulare, che a sua volta influenza la struttura, la funzione e la fisiologia della cellula⁵. Il proteoma delle cellule cresciute in coltura 2D era più arricchito in proteine coinvolte nella replicazione cellulare, mentre il proteoma degli sferoidi 3D era più arricchito nella funzionalità epatica⁵.

Il tasso di replicazione più lento delle cellule cresciute come sferoidi 3D modella in modo più accurato fenomeni specifici associati allo stato e alle modifiche della cromatina (ad esempio il ritaglio dell’istone⁹). Il clipping istonico è una modificazione post-traduzionale irreversibile dell’istono (PTM) che causa la scissione proteolitica di parte della coda N-terminale dell’istone. Mentre la sua funzione biologica è ancora in discussione 10,11,12,13, è chiaro che la sua presenza nelle cellule primarie e nel tessuto epatico è modellata da cellule HepG2 / C3A cresciute come sferoidi, ma non come cellule piatte 9. Questo è fondamentale, poiché lo stato della cromatina e le modifiche regolano la lettura del DNA principalmente modulando l’accessibilità ai geni e quindi la loro espressione¹⁴. I PTM istonici influenzano direttamente lo stato della cromatina influenzando la carica netta dei nucleosomi in cui sono assemblati gli istoni, o indirettamente reclutando scrittori, lettori e cancellatori di cromatina¹⁴. Centinaia di PTM istonici sono stati identificati fino ad oggi¹⁵, rafforzando l’ipotesi che la cromatina ospiti un “codice istonico” utilizzato dalla cellula per interpretare il DNA¹⁶. Tuttavia, l’identificazione di una miriade di combinazioni PTM¹⁵ e la scoperta che le combinazioni di PTM istonici hanno spesso funzioni biologiche diverse dalle PTM presenti in isolamento (ad esempio Fischle, et ^al.17), evidenzia che è necessario più lavoro per decifrare il “codice istonico”.

Attualmente, l’analisi PTM degli istoni si basa su tecniche che utilizzano anticorpi (ad esempio, western blots, immunofluorescenza o immunoprecipitazione della cromatina seguita da sequenziamento [ChIP-seq]) o spettrometria di massa (MS). Le tecniche basate su anticorpi hanno un’elevata sensibilità e possono fornire informazioni dettagliate sulla localizzazione a livello di genoma dei segni istonici, ma sono spesso limitate nello studio di PTM o PTM rari presenti in combinazioni 18,19,20. La SM è più adatta per l’identificazione e la quantificazione imparziali e ad alto rendimento di modificazioni proteiche singole e coesistenti, in particolare proteine istoniche 18,19,20. Per questi motivi, questo e molti altri laboratori hanno ottimizzato la pipeline MS per l’analisi di peptidi istonici (MS bottom-up), code istoniche intatte (MS middle-down) e proteine istoniche a lunghezza intera (MS top-down)21,22,23.

Di seguito è riportato un flusso di lavoro per la coltivazione di sferoidi HepG2 / C3A e la loro preparazione per l’analisi dei peptidi istonici (MS bottom-up) tramite cromatografia nano-liquida, accoppiata online con spettrometria di massa tandem (nLC-MS / MS). È stata coltivata una coltura cellulare 2D e le cellule sono state raccolte e trasferite in un bioreattore dove avrebbero iniziato a formare sferoidi (Figura 1). Dopo 18 giorni in coltura, gli sferoidi sono stati trattati con butirrato di sodio o succinato di sodio per aumentare l’abbondanza relativa di acetilazione e succinilazione degli istoni. In particolare, le colture 3D possono essere trattate con composti genotossici altrettanto bene dei loro equivalenti di coltura piatta; infatti, recenti pubblicazioni evidenziano che la risposta tossicologica delle cellule in coltura 3D è più simile ai tessuti primari rispetto a quelli in coltura piatta 2D ^24,25. Le cellule sono state quindi raccolte in punti temporali specificati ed è stato eseguito l’isolamento nucleare. Quindi, gli istoni sono stati estratti e derivatizzati con anidride propionica prima e dopo la digestione della tripsina secondo un protocollo sviluppato per la prima volta da Garcia et ^al.26. Questa procedura genera peptidi di dimensioni appropriate per la separazione online con cromatografia a fase inversa (C₁₈) e il rilevamento con SM. Infine, i peptidi istonici sono stati identificati e quantificati e i dati generati sono stati rappresentati in più modi per un’interpretazione biologica più completa.

Protocol

1. Preparazione di tamponi e reagenti Mezzi di crescita cellulare (per le cellule HepG2/C3A): aggiungere siero bovino fetale (FBS) (10% v/v), aminoacidi non essenziali (1% v/v), integratore di L-glutammina (1% v/v) e penicillina/streptomicina (0,5% v/v) al Modified Eagle’s Medium di Dulbecco (DMEM, contenente 4,5 g/L di glucosio). I substrati di crescita vengono conservati a 4 °C per un massimo di 2 settimane. 200 mM di soluzione di butirrato di sodio (NaBut): per preparare 10 mL, so…

Representative Results

In questo protocollo, gli sferoidi HepG2/C3A sono stati trattati con 20 mM NaBut e 10 mM NaSuc, entrambi i quali hanno influenzato i livelli globali di PTM istonici (Figura 3A). I PTM istonici sono stati quindi identificati e quantificati a livello di singolo residuo tramite acquisizione ms/MS (Figura 3B). Quando i campioni vengono eseguiti in repliche, è possibile eseguire analisi statistiche per valutare l’arricchimento de…

Discussion

L’analisi dei PTM istonici è fondamentalmente diversa dalla tipica pipeline di analisi proteomica. La maggior parte dei PTM istonici hanno ancora funzioni biologiche enigmatiche; di conseguenza, annotazioni come Gene Ontology o database di pathway non sono disponibili. Esistono diverse risorse che associano le modificazioni istoniche all’enzima responsabile della loro catalisi o proteine contenenti domini che legano questi PTM (ad esempio, HISTome³⁶). Inoltre, è possibile speculare sullo stato g…

Materials

0.05% trypsin-EDTA solution	Gibco	25300054
0.5-20 µL pipet tips	BRAND	13-889-172 (Fisher Scientific)
1.5 mL microcentrifuge tubes	Bio-Rad	2239480
10 µL multi-channel pipette	BRAND	BR7059000 (Millipore Sigma)
10 mL syringe	Henke Sass Wolf	14-817-31 (Fisher Scientific)	Luer lock tip, graduated to 12 mL
10, 20, 200, and 1000 µL single-channel pipettes	Eppendorf	14-285-904 (Fisher Scientific)
1000 µL pipet tips	Rainin	30389164
18 G syringe needle	Air-Tite	14-817-100 (Fisher Scientific)	3" length, 0.05" diameter
200 µL multi-channel pipette	Corning	4082
2-200 µL pipet tips	BRAND	Z740118 (Millipore Sigma)
24-well ultra-low attachment microplate	Corning	07-200-602
75 cm2  U-shaped cell culture flask	Corning	461464U	Untreated, with vent cap
96-well skirted plate	Axygen	PCR-96-FS-C (Corning)
Acetone	Fisher Scientific	A949-1	Acetone should be used cold
Ammonium bicarbonate (NH4HCO3)	Sigma-Aldrich	A6141-25G
Ammonium hydroxide solution	Fisher Scientific	AC423300250
Cell culture grade water	Corning	25-055-CV
ClinoReactor	CelVivo	10004-12	Bioreactor for 3D cell culture
ClinoStar	CelVivo	N/A	Clinostat CO2 incubator for 3D cell culture
Control unit	CelVivo	N/A	Tablet for ClinoStar settings
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning	17-205-CV	1X solution with 4.5 g/L glucose and sodium pyruvate, without L-glutamine and phenol red
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	35-010-CV
Formic acid	Thermo Scientific	28905
Fume hood	Mott	N/A	Model 7121000
Glass Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-8B	9", cotton-plugged, borosilicate glass, non-sterile
Glutagro supplement	Corning	25-015-CI	200 mM L-ananyl-L-glutamine
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning	21-022-CV	1X solution without calcium, magnesium, and phenol red
HPLC grade acetonitrile	Fisher Scientific	A955-4
HPLC grade water	Fisher Scientific	W6-1
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher Scientific	A481-212
Ice	N/A	N/A
MEM non-essential amino acids	Corning	25-025-CI	100X solution
Oasis HLB resin	Waters	186007549	Hydrophilic-Lipophilic-Balanced (HLB) Resin with 30µm particle size
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer	Thermo Fisher Scientific	IQLAAEGAAPFADBMBHQ	High resolution mass spectrometer
Oro-Flex I polypropylene filter plate	Orochem	OF1100	96-well polypropylene filter plate w/ 10 µM PE frit
Penicillin-Streptomycin	Corning	30-002-CI	100X solution
pH paper	Hydrion	Z111848 (Sigma-Aldrich)	0-13 pH test paper
Pipette gun	Eppendorf	Z666467 (Millipore Sigma)
Polymicro capillary	Molex	50-110-7740 (Fisher Scientific)	Flexible fused silica capillary tubing with polymide coating, 75 µM ID x 363 µM OD
Polystyrene 10 mL serological pipets, sterile	Fisher Scientific	1367549
Propionic anhydride	Sigma-Aldrich	240311-50G
Refrigerated centrifuge	Thermo Scientific	75-217-420
Reprosil-Pur resin	MSWIL	R13.AQ.0003	120 Å pore size, C18-AQ phase, 3 µM bead size
Rotator	Clay Adams	25477 (American Laboratory Trading)	Nutator Mixer 1105
Sequencing grade modified trypsin	Promega	V5111
Sodium butyrate	Thermo Scientific	A11079
Sodium succinate dibasic	Sigma-Aldrich	14160-100G
SpeedVac vacuum concentrator (1.5 mL microcentrifuge tubes)	Savant	20249 (American Laboratory Trading)
SpeedVac vacuum concentrator (96-well)	Thermo Scientific	15308325	Savant SPD1010
Sterile hood	Thermo Scientific	1375	Class II, Type A2
Sulfuric acid (H2SO4)	Fisher Scientific	02-004-375	Baker Analyzed ACS reagent
Tissue-culture treated 100 mm x 20 mm dish	Fisher Scientific	08-772-23
Trichloroacetic acid (TCA)	Thermo Scientific	AC421451000	Resuspend 100% w/v in HPLC grade water
Trifluoroacetic acid (TFA)	Fisher Scientific	PI28904	Sequencing grade
Vacuum manifold 96-well	Millipore	MAVM0960R
Vortex	Sigma-Aldrich	Z258415
Water bath	Fisher Scientific	FSGPD10
Wide bore pipet tips 1000 µL	Axygen	14-222-703 (Fisher Scientific)
Wide bore pipet tips 200 µL	Axygen	14-222-730 (Fisher Scientific)