간 조직의 3D 세포 배양 모델에서 히스톤 번역 후 변형의 글로벌 수준 정량화
Summary
이 프로토콜은 입체 세포 배양 시스템이 거의 생리적 인 상태에서 염색질 변형을 모델링, 치료 및 분석하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 설명합니다.
Abstract
포유동물 세포의 편평한 배양은 세포 생리학을 이해하기 위해 시험관내 접근법으로 널리 사용되지만, 이 시스템은 부자연스럽게 빠른 세포 복제로 인해 고체 조직을 모델링하는데 한계가 있다. 이것은 성숙한 크로마틴을 모델링 할 때 특히 도전적인데, 빠른 복제 세포는 종종 DNA 복제에 관여하고 이질적인 폴리 플로이드 집단을 가지고 있기 때문입니다. 아래는 3차원(3D) 세포 배양 시스템을 사용하여 정동작 염색질 변형을 모델링, 치료 및 분석하기 위한 워크플로우입니다. 이 프로토콜을 사용하여, 간세포 암종 세포주는 활성 영양소 확산 및 낮은 전단력을 제공하는 인큐베이터에서 재현 가능한 3D 구상체로 성장한다. 소듐 부티레이트와 소듐 숙시네이트에 의한 처리는 각각 히스톤 아세틸화 및 숙시닐화의 증가를 유도하였다. 히스톤 아세틸화 및 숙시닐화 수준의 증가는 보다 개방된 크로마틴 상태와 연관된다. 그런 다음 구상체는 세포 핵의 분리를 위해 수집되며, 히스톤 단백질은 번역 후 변형의 분석을 위해 추출됩니다. Histone 분석은 탠덤 질량 분광법과 온라인으로 결합 된 액체 크로마토그래피를 통해 수행되고 사내 계산 파이프 라인이 뒤 따릅니다. 마지막으로, 조합 히스톤 마크의 빈도 및 발생을 조사하기 위한 데이터 표현의 예가 도시된다.
Introduction
19세기 후반부터 세포 배양시스템은 인체 1,2 외부의 세포의 성장과 발달을 연구하기 위한 모델로 사용되어 왔다. 그들의 사용은 또한 조직과 기관이 건강한 상황과 병든 맥락에서 어떻게 기능하는지 연구하기 위해 확장되었습니다 1,3. 현탁액 세포 (예를 들어, 혈액 세포)는 페트리 접시 또는 플라스크에서 매끄럽고 상호 교환 가능하게 성장하며, 생체 내에서 3차원 (3D) 구조로 조립되지 않는다. 고체 기관으로부터 유래된 세포는 2차원(2D) 또는 3D 배양 시스템에서 성장할 수 있다. 2D 배양에서, 세포는 평평한 표면 2,4에 부착되는 단층에서 성장한다. 2D 세포 배양 시스템은 지수 성장 및 빠른 배가 시간, 전형적으로 24 h 내지 수일5를 특징으로 한다. 3D 시스템의 세포는 성장하여 조직과 유사한 대기업을 모델링하는 복잡한 세포 – 세포 상호 작용을 형성하며, 배가시키는 시간이 1 개월 또는 그 이상에 도달 할 수있는 동적 평형에 도달 할 수있는 능력을 특징으로합니다5.
이 논문에서 제시된 것은 감소된 중력을 시뮬레이션하는 회전 세포 배양 시스템에서 3D 구상체를 성장시키기 위한 혁신적인 방법론이다6. 이것은 NASA가 1990 년대7에 도입 한 세포 배양 시스템의 단순화 된 유도체입니다. 이 접근법은 회전 플라스크와 같은 기존 방법에서 발생하는 전단력을 최소화하고 스페로이드 재현성을 증가시킵니다6. 또한, 회전 생물반응기는 활성 영양소 확산을 증가시켜 배지 교환이 비실용적 인 매달린 방울 세포 배양과 같은 시스템에서 발생하는 괴사 형성을 최소화합니다6. 이런 식으로, 세포는 대부분 방해받지 않고 성장하여 조직에서 성장하는 세포와 관련된 구조적 및 생리적 특성의 형성을 허용합니다. 이러한 방식으로 배양된 C3A 간세포(HepG2/C3A)는 초구조적 소기관을 가졌을 뿐만 아니라 생체내1,2에서 관찰된 수준에 필적하는 양의 ATP, 아데닐레이트 키나제, 요소 및 콜레스테롤을 생성하였다. 또한, 2D 대 세포 배양 시스템에서 성장한 세포는 .3D이한 유전자 발현 패턴(8)을 나타낸다. 3D 구상체로 성장한 C3A 간세포의 유전자 발현 분석은 이들 세포가 간 기능을 조절하는 주요 경로에 관여하는 유전자뿐만 아니라 광범위한 간 특이적 단백질을 발현한다는 것을 보여주었다8. 이전의 간행물은 2D 배양물에서 기하급수적으로 성장하는 세포의 프로테옴과 3D 스페로이드 배양물에서 동적 평형을 이루는 세포 사이의 차이를 입증했다5. 이러한 차이에는 세포 신진 대사가 포함되며, 이는 차례로 세포의 구조, 기능 및 생리학에 영향을 미칩니다5. 2D 배양물에서 성장한 세포의 프로테옴은 세포 복제에 관여하는 단백질에서 더 풍부해진 반면, 3D 구상체의 프로테옴은 간 기능성에서 더욱 풍부해졌다5.
3D 구상체로 성장한 세포의 느린 복제 속도는 크로마틴 상태 및 변형과 관련된 특정 현상을보다 정확하게 모델링합니다 (예 : 히스톤 클리핑9). 히스톤 클리핑은 히스톤 N 말단 꼬리의 일부의 단백질 분해 절단을 일으키는 비가역적 히스톤 번역 후 변형 (PTM)이다. 그것의 생물학적 기능은 여전히 논의 중이다10,11,12,13, 일차 세포 및 간 조직에서의 그것의 존재는 구상체로 성장한 HepG2 / C3A 세포에 의해 모델링되지만 평평한 세포9는 아닙니다. 이것은 크로마틴 상태 및 변형이 주로 유전자에 대한 접근성을 조절함으로써 DNA 판독을 조절하고 따라서 발현14를 조절하기 때문에 중요합니다. 히스톤 PTM은 히스톤이 조립되는 뉴클레오솜의 순 전하에 영향을 미침으로써 크로마틴 상태에 직접적으로 영향을 미치거나, 크로마틴 작가, 독자 및 지우개(14)를 모집함으로써 간접적으로 영향을 미친다. 현재까지 수백 개의 히스톤 PTM이확인되어 염색질이 DNA16을 해석하기 위해 세포에 의해 사용되는 “히스톤 코드”를 호스팅한다는 가설을 강화했습니다. 그러나, 무수한 PTM 조합(15)의 확인, 및 히스톤 PTM의 조합이 종종 단리된 상태로 존재하는 PTM으로부터 상이한 생물학적 기능을 갖는다는 발견(예를 들어, Fischle, et al.17)은 “히스톤 코드”를 해독하기 위해 더 많은 작업이 필요하다는 것을 강조한다.
현재, 히스톤 PTM 분석은 항체 (예를 들어, 웨스턴 블롯, 면역형광, 또는 크로마틴 면역침전 후 시퀀싱 [ChIP-seq]) 또는 질량 분광법 (MS)을 이용하는 기술에 기초한다. 항체 기반 기술은 높은 감도를 가지며 히스톤 마크의 게놈 전체 국소화에 대한 자세한 정보를 제공 할 수 있지만 조합 18,19,20에 존재하는 희귀 한 PTM 또는 PTM을 연구하는 데 종종 제한적입니다. MS는 단일 및 공존하는 단백질 변형, 특히 히스톤 단백질 18,19,20의 고처리량 및 편향되지 않은 동정 및 정량화에 더 적합하다. 이러한 이유로, 이것 및 몇몇 다른 실험실은 히스톤 펩티드 (상향식 MS), 무손상 히스톤 꼬리 (중간 다운 MS) 및 전장 히스톤 단백질 (하향식 MS)21,22,23의 분석을 위해 MS 파이프 라인을 최적화했습니다.
아래에 자세히 설명 된 것은 HepG2 / C3A 구상체를 재배하고 탠덤 질량 분광법 (nLC-MS / MS)과 온라인으로 결합 된 나노 액체 크로마토그래피를 통해 히스톤 펩티드 분석 (상향식 MS)을 준비하기위한 워크 플로입니다. 2D 세포 배양물을 성장시키고 세포를 수확하여 생물반응기로 옮겨 구상체를 형성하기 시작했습니다 (그림 1). 배양에서 18일 후, 구상체를 소듐 부티레이트 또는 소듐 숙시네이트로 처리하여 히스톤 아세틸화 및 숙시닐화의 상대적 풍부도를 증가시켰다. 특히, 3D 배양물은 유전성 화합물뿐만 아니라 평평한 배양 등가물로 처리 될 수 있습니다. 사실, 최근의 간행물은 3D 배양물에서 세포의 독성학 반응이 2D 편평한 배양24,25에서의 것보다 일차 조직과 더 유사하다는 것을 강조한다. 그런 다음 세포를 지정된 시점에서 수집하고 핵 분리를 수행했습니다. 그 후, 히스톤을 추출하고 트립신 소화 전후에 Garcia et al.26에 의해 처음 개발된 프로토콜에 따라 프로피온성 무수물로 유도체화하였다. 이 절차는 역상 크로마토그래피 (C18)로 온라인 분리 및 MS로 검출하기에 적합한 크기의 펩티드를 생성한다. 마지막으로, 히스톤 펩티드가 확인되고 정량화되었고, 생성된 데이터는 보다 완전한 생물학적 해석을 위해 여러 가지 방법으로 표현되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
히스톤 PTM의 분석은 일반적인 프로테오믹스 분석 파이프라인과 근본적으로 다릅니다. 대부분의 히스톤 PTM은 여전히 수수께끼 같은 생물학적 기능을 가지고 있습니다. 결과적으로 Gene Ontology 또는 pathway 데이터베이스와 같은 주석을 사용할 수 없습니다. 히스톤 변형을 그들의 촉매작용을 담당하는 효소 또는 이들 PTM에 결합하는 도메인을 함유하는 단백질과 연관시키는 몇몇 자원이 존재한다(예를 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Sidoli 연구소는 백혈병 연구 재단 (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (Sagol Network GerOmics Award), Deerfield (Xseed Award), Relay Therapeutics, Merck 및 NIH Office of Director (1S10OD030286-01)를 감사하게 생각합니다.
Materials
| 0.05% trypsin-EDTA solution | Gibco | 25300054 | |
| 0.5-20 µL pipet tips | BRAND | 13-889-172 (Fisher Scientific) | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Bio-Rad | 2239480 | |
| 10 µL multi-channel pipette | BRAND | BR7059000 (Millipore Sigma) | |
| 10 mL syringe | Henke Sass Wolf | 14-817-31 (Fisher Scientific) | Luer lock tip, graduated to 12 mL |
| 10, 20, 200, and 1000 µL single-channel pipettes | Eppendorf | 14-285-904 (Fisher Scientific) | |
| 1000 µL pipet tips | Rainin | 30389164 | |
| 18 G syringe needle | Air-Tite | 14-817-100 (Fisher Scientific) | 3" length, 0.05" diameter |
| 200 µL multi-channel pipette | Corning | 4082 | |
| 2-200 µL pipet tips | BRAND | Z740118 (Millipore Sigma) | |
| 24-well ultra-low attachment microplate | Corning | 07-200-602 | |
| 75 cm2 U-shaped cell culture flask | Corning | 461464U | Untreated, with vent cap |
| 96-well skirted plate | Axygen | PCR-96-FS-C (Corning) | |
| Acetone | Fisher Scientific | A949-1 | Acetone should be used cold |
| Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | A6141-25G | |
| Ammonium hydroxide solution | Fisher Scientific | AC423300250 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| ClinoReactor | CelVivo | 10004-12 | Bioreactor for 3D cell culture |
| ClinoStar | CelVivo | N/A | Clinostat CO2 incubator for 3D cell culture |
| Control unit | CelVivo | N/A | Tablet for ClinoStar settings |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 17-205-CV | 1X solution with 4.5 g/L glucose and sodium pyruvate, without L-glutamine and phenol red |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Formic acid | Thermo Scientific | 28905 | |
| Fume hood | Mott | N/A | Model 7121000 |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-8B | 9", cotton-plugged, borosilicate glass, non-sterile |
| Glutagro supplement | Corning | 25-015-CI | 200 mM L-ananyl-L-glutamine |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | 1X solution without calcium, magnesium, and phenol red |
| HPLC grade acetonitrile | Fisher Scientific | A955-4 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W6-1 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A481-212 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| MEM non-essential amino acids | Corning | 25-025-CI | 100X solution |
| Oasis HLB resin | Waters | 186007549 | Hydrophilic-Lipophilic-Balanced (HLB) Resin with 30µm particle size |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | High resolution mass spectrometer |
| Oro-Flex I polypropylene filter plate | Orochem | OF1100 | 96-well polypropylene filter plate w/ 10 µM PE frit |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | 100X solution |
| pH paper | Hydrion | Z111848 (Sigma-Aldrich) | 0-13 pH test paper |
| Pipette gun | Eppendorf | Z666467 (Millipore Sigma) | |
| Polymicro capillary | Molex | 50-110-7740 (Fisher Scientific) | Flexible fused silica capillary tubing with polymide coating, 75 µM ID x 363 µM OD |
| Polystyrene 10 mL serological pipets, sterile | Fisher Scientific | 1367549 | |
| Propionic anhydride | Sigma-Aldrich | 240311-50G | |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific | 75-217-420 | |
| Reprosil-Pur resin | MSWIL | R13.AQ.0003 | 120 Å pore size, C18-AQ phase, 3 µM bead size |
| Rotator | Clay Adams | 25477 (American Laboratory Trading) | Nutator Mixer 1105 |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium butyrate | Thermo Scientific | A11079 | |
| Sodium succinate dibasic | Sigma-Aldrich | 14160-100G | |
| SpeedVac vacuum concentrator (1.5 mL microcentrifuge tubes) | Savant | 20249 (American Laboratory Trading) | |
| SpeedVac vacuum concentrator (96-well) | Thermo Scientific | 15308325 | Savant SPD1010 |
| Sterile hood | Thermo Scientific | 1375 | Class II, Type A2 |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Fisher Scientific | 02-004-375 | Baker Analyzed ACS reagent |
| Tissue-culture treated 100 mm x 20 mm dish | Fisher Scientific | 08-772-23 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Thermo Scientific | AC421451000 | Resuspend 100% w/v in HPLC grade water |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Fisher Scientific | PI28904 | Sequencing grade |
| Vacuum manifold 96-well | Millipore | MAVM0960R | |
| Vortex | Sigma-Aldrich | Z258415 | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD10 | |
| Wide bore pipet tips 1000 µL | Axygen | 14-222-703 (Fisher Scientific) | |
| Wide bore pipet tips 200 µL | Axygen | 14-222-730 (Fisher Scientific) |
References
- Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures – a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
- Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 365-377 (2005).
- Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology (Bethesda). 32 (4), 266-277 (2017).
- Wrzesinski, K., et al. The cultural divide: exponential growth in classical 2D and metabolic equilibrium in 3D environments. PLoS One. 9 (9), 106973 (2014).
- Wrzesinski, K., Fey, S. J. Metabolic reprogramming and the recovery of physiological functionality in 3D cultures in micro-bioreactors. Bioengineering (Basel). 5 (1), 22 (2018).
- Gonda, S. R., et al. Three-dimensional transgenic cell model to quantify genotoxic effects of space environment. Advances in Space Research. 27 (2), 421-430 (2001).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
- Tvardovskiy, A., et al. Top-down and middle-down protein analysis reveals that intact and clipped human histones differ in post-translational modification patterns. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (12), 3142-3153 (2015).
- Azad, G. K., et al. Modifying chromatin by histone tail clipping. Journal of Molecular Biology. 430 (18), 3051-3067 (2018).
- Kragesteen, B. K., Amit, I. Heads or tails: histone tail clipping regulates macrophage activity. Nature Immunology. 22 (6), 678-680 (2021).
- Dhaenens, M. Histone clipping: the punctuation in the histone code. EMBO Reports. 22 (8), 53440 (2021).
- Anderson, L. C., et al. Analyses of histone proteoforms using front-end electron transfer dissociation-enabled orbitrap instruments. Molecular and Cellular Proteomics. 15 (3), 975-988 (2016).
- Morgan, M. A. J., Shilatifard, A. Reevaluating the roles of histone-modifying enzymes and their associated chromatin modifications in transcriptional regulation. Nature Genetics. 52 (12), 1271-1281 (2020).
- Chan, J. C., Maze, I. Nothing is yet set in (hi)stone: novel post-translational modifications regulating chromatin function. Trends in Biochemical Sciences. 45 (10), 829-844 (2020).
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).
- Fischle, W., et al. Molecular basis for the discrimination of repressive methyl-lysine marks in histone H3 by Polycomb and HP1 chromodomains. Genes and Development. 17 (15), 1870-1881 (2003).
- Onder, O., et al. Progress in epigenetic histone modification analysis by mass spectrometry for clinical investigations. Expert Review of Proteomics. 12 (5), 499-517 (2015).
- Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry. Journal of Proteomics. 75 (12), 3419-3433 (2012).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nature Structural and Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).
- Moradian, A., et al. The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications. Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).
- Zheng, Y., Huang, X., Kelleher, N. L. Epiproteomics: quantitative analysis of histone marks and codes by mass spectrometry. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 142-150 (2016).
- Sidoli, S., Garcia, B. A. Middle-down proteomics: a still unexploited resource for chromatin biology. Expert Review of Proteomics. 14 (7), 617-626 (2017).
- Stampar, M., et al. Hepatocellular carcinoma (HepG2/C3A) cell-based 3D model for genotoxicity testing of chemicals. Science of the Total Environment. 755, 143255 (2021).
- Calitz, C., et al. Toxicity and anti-prolific properties of Xysmalobium undulatum water extract during short-term exposure to two-dimensional and three-dimensional spheroid cell cultures. Toxicology Mechanisms and Methods. 28 (9), 641-652 (2018).
- Garcia, B. A., et al. Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).
- Sidoli, S., et al. Sequential window acquisition of all theoretical mass spectra (SWATH) analysis for characterization and quantification of histone post-translational modifications. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (9), 2420-2428 (2015).
- Sidoli, S., et al. Low resolution data-independent acquisition in an LTQ-orbitrap allows for simplified and fully untargeted analysis of histone modifications. Analytical Chemistry. 87 (22), 11448-11454 (2015).
- Karch, K. R., Sidoli, S., Garcia, B. A. Identification and quantification of histone PTMs using high-resolution mass spectrometry. Methods in Enzymology. 574, 3-29 (2016).
- Yuan, Z. F., et al. EpiProfile quantifies histone peptides with modifications by extracting retention time and intensity in high-resolution mass spectra. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (6), 1696-1707 (2015).
- Yuan, Z. F., et al. EpiProfile 2.0: a computational platform for processing epi-proteomics mass spectrometry data. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2533-2541 (2018).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Pino, L. K., et al. The Skyline ecosystem: Informatics for quantitative mass spectrometry proteomics. Mass Spectrometry Reviews. 39 (3), 229-244 (2020).
- Aguilan, J. T., Kulej, K., Sidoli, S. Guide for protein fold change and p-value calculation for non-experts in proteomics. Molecular Omics. 16 (6), 573-582 (2020).
- Lex, A., et al. UpSet: Visualization of intersecting sets. IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 20 (12), 1983-1992 (2014).
- Shah, S. G., et al. HISTome2: a database of histone proteins, modifiers for multiple organisms and epidrugs. Epigenetics and Chromatin. 13 (1), 31 (2020).
- Xie, Z., et al. Lysine succinylation and lysine malonylation in histones. Molecular and Cellular Proteomics. 11 (5), 100-107 (2012).
- Liu, J., et al. Histone succinylation and its function on the nucleosome. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (15), 7101-7109 (2021).
- Howe, F. S., et al. Is H3K4me3 instructive for transcription activation. Bioessays. 39 (1), 1-12 (2017).
- Nicetto, D., Zaret, K. S. Role of H3K9me3 heterochromatin in cell identity establishment and maintenance. Current Opinion in Genetics and Development. 55, 1-10 (2019).
- Wojcik, J. B., et al. Histone H3K27 dimethyl loss is highly specific for malignant peripheral nerve sheath tumor and distinguishes true PRC2 loss from isolated H3K27 trimethyl loss. Modern Pathology. 32 (10), 1434-1446 (2019).
- Sellers, W. R., et al. Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia. Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).
- Zhang, D., et al. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation. Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).
- Farrelly, L. A., et al. Histone serotonylation is a permissive modification that enhances TFIID binding to H3K4me3. Nature. 567 (7749), 535-539 (2019).
- Chen, Q., et al. ADP-ribosylation of histone variant H2AX promotes base excision repair. The EMBO Journal. 40 (2), 104542 (2021).
- Zheng, Q., et al. Reversible histone glycation is associated with disease-related changes in chromatin architecture. Nature Communications. 10 (1), 1289 (2019).
