Количественная оценка гистонов на глобальном уровне посттрансляционных модификаций в 3D-модели клеточной культуры печеночной ткани
Summary
Этот протокол описывает, как трехмерная система клеточных культур может быть использована для моделирования, обработки и анализа модификаций хроматина в почти физиологическом состоянии.
Abstract
Плоские культуры клеток млекопитающих являются широко используемым подходом in vitro для понимания физиологии клеток, но эта система ограничена в моделировании твердых тканей из-за неестественно быстрой репликации клеток. Это особенно сложно при моделировании зрелого хроматина, поскольку быстро реплицирующиеся клетки часто участвуют в репликации ДНК и имеют гетерогенную полиплоидную популяцию. Ниже представлен рабочий процесс для моделирования, обработки и анализа модификаций покоящегося хроматина с использованием трехмерной (3D) системы клеточных культур. Используя этот протокол, клеточные линии гепатоцеллюлярной карциномы выращиваются в виде воспроизводимых 3D-сфероидов в инкубаторе, обеспечивающих активную диффузию питательных веществ и низкие силы сдвига. Лечение бутиратом натрия и сукцинатом натрия индуцировало увеличение ацетилирования гистонов и сукцинилирования соответственно. Повышение уровней ацетилирования гистонов и сукцинилирования связано с более открытым состоянием хроматина. Сфероиды затем собираются для выделения клеточных ядер, из которых извлекаются гистоновые белки для анализа их посттрансляционных модификаций. Анализ гистонов выполняется с помощью жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией, за которой следует собственный вычислительный конвейер. Наконец, приведены примеры представления данных для исследования частоты и возникновения комбинаторных гистоновых меток.
Introduction
С конца 19века системы клеточных культур использовались в качестве модели для изучения роста и развития клеток вне человеческого организма 1,2. Их использование также было расширено для изучения того, как ткани и органы функционируют как в здоровом, так и в больном контексте 1,3. Суспензионные клетки (например, клетки крови) растут в чашках или колбах Петри плавно и взаимозаменяемо, поскольку они не собираются в трехмерные (3D) структуры in vivo. Клетки, полученные из твердых органов, могут расти как в двумерных (2D), так и в 3D-системах культур. В 2D культуре клетки выращиваются в монослое, который прилипает к плоской поверхности 2,4. Системы 2D-культур клеток характеризуются экспоненциальным ростом и быстрым временем удвоения, обычно от 24 ч до нескольких дней5. Клетки в 3D-системах растут, образуя сложные клеточные взаимодействия, моделирующие тканеподобные конгломераты более тесно, и они характеризуются своей способностью достигать динамического равновесия, где их время удвоения может достигать 1 месяца или дольше5.
В этой статье представлена инновационная методология выращивания 3D-сфероидов во вращающихся системах клеточных культур, которые имитируют пониженную гравитацию6. Это упрощенная производная системы клеточных культур, введенная НАСА в 1990-хгодах 7. Этот подход сводит к минимуму силы сдвига, которые возникают в существующих методах, таких как вращающиеся колбы, и увеличивает сфероидную воспроизводимость6. Кроме того, вращающийся биореактор увеличивает активную диффузию питательных веществ, сводя к минимуму некротическое образование, которое происходит в таких системах, как висячая культура капельных клеток, где обмен средой непрактичен6. Таким образом, клетки растут в основном без помех, что позволяет формировать структурные и физиологические характеристики, связанные с клетками, растущими в ткани. Гепатоциты C3A (HepG2/C3A), культивируемые таким образом, не только имели ультраструктурные органеллы, но и продуцировали количества АТФ, аденилаткиназы, мочевины и холестерина, сопоставимые с уровнями, наблюдаемыми in vivo 1,2. Кроме того, клетки, выращенные в системах 2D и .3D клеточных культур, демонстрируют различные паттерны экспрессии генов8. Анализ экспрессии генов гепатоцитов C3A, выращенных в виде 3D-сфероидов, показал, что эти клетки экспрессируют широкий спектр специфических для печени белков, а также генов, участвующих в ключевых путях, которые регулируют функцию печени8. Предыдущие публикации продемонстрировали различия между протеомами экспоненциально растущих клеток в 2D-культуре и клетками в динамическом равновесии в 3D-сфероидных культурах5. Эти различия включают клеточный метаболизм, который, в свою очередь, влияет на структуру, функцию и физиологию клетки5. Протеом клеток, выращенных в 2D-культуре, был более обогащен белками, участвующими в репликации клеток, в то время как протеом 3D-сфероидов был более обогащен функциональностью печени5.
Более медленная скорость репликации клеток, выращенных в виде 3D-сфероидов, более точно моделирует конкретные явления, связанные с состоянием хроматина и модификациями (например, отсечение гистонов9). Гистоновое обрезание является необратимой посттрансляционной модификацией гистона (PTM), которая вызывает протеолитическое расщепление части N-концевого хвоста гистона. Хотя его биологическая функция все еще обсуждается 10,11,12,13, ясно, что его присутствие в первичных клетках и ткани печени моделируется клетками HepG2 / C3A, выращенными как сфероиды, но не как плоские клетки 9. Это имеет решающее значение, поскольку состояние хроматина и его модификации регулируют считывание ДНК в основном путем модуляции доступности генов и, следовательно, их экспрессии14. Гистоновые ПТМ либо влияют на состояние хроматина напрямую, воздействуя на чистый заряд нуклеосом, где собраны гистоны, либо косвенно, привлекая хроматиновых писателей, читателей и ластиков14. Сотни гистоновых ПТМ были идентифицированы на сегодняшний день15, что подтверждает гипотезу о том, что хроматин содержит «гистоновый код», используемый клеткой для интерпретации ДНК16. Однако идентификация множества комбинацийPTM 15 и открытие того, что комбинации гистоновых PTM часто имеют различные биологические функции от PTM, присутствующих изолированно (например, Fischle, et al.17), подчеркивает, что для расшифровки «гистонового кода» требуется больше работы.
В настоящее время анализ Гистонового ПТМ основан либо на методах, использующих антитела (например, западные блоты, иммунофлуоресценцию или иммунопреципитацию хроматина с последующим секвенированием [ChIP-seq]), либо масс-спектрометрию (МС). Методы, основанные на антителах, обладают высокой чувствительностью и могут предоставить подробную информацию о общегеномной локализации гистоновых меток, но часто ограничены в изучении редких ПТМ или ПТМ, присутствующих в комбинациях 18,19,20. MS больше подходит для высокопроизводительной и непредвзятой идентификации и количественной оценки одиночных и сосуществующих модификаций белков, в частности гистоновых белков 18,19,20. По этим причинам эта и несколько других лабораторий оптимизировали конвейер MS для анализа гистоновых пептидов (снизу вверх MS), интактных гистоновых хвостов (middle-down MS) и полноразмерных гистоновых белков (сверху вниз MS)21,22,23.
Ниже подробно описан рабочий процесс выращивания сфероидов HepG2 / C3A и подготовки их к анализу гистоновых пептидов (снизу вверх MS) с помощью наножидкой хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (nLC-MS / MS). Выращивали 2D-культуру клеток, и клетки собирали и передавали в биореактор, где они начинали образовывать сфероиды (рисунок 1). После 18 дней в культуре сфероиды обрабатывали бутиратом натрия или сукцинатом натрия для увеличения относительного обилия ацетилирования и сукцинилирования гистонов. Примечательно, что 3D-культуры могут быть обработаны генотоксическими соединениями так же, как и их эквиваленты плоских культур; фактически, последние публикации подчеркивают, что токсикологический ответ клеток в 3D-культуре больше похож на первичные ткани, чем на те, которые находятся в 2D плоской культуре24,25. Затем клетки собирали в определенные моменты времени и проводили ядерную изоляцию. Затем гистоны экстрагировали и дериватизировали пропионовым ангидридом до и после переваривания трипсина в соответствии с протоколом, впервые разработанным Garcia et al.26. Эта процедура генерирует пептиды соответствующего размера для онлайн-разделения с помощью обратнофазной хроматографии (C18) и обнаружения при РС. Наконец, гистоновые пептиды были идентифицированы и количественно определены, а полученные данные были представлены несколькими способами для более полной биологической интерпретации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Анализ гистоновых ПТМ принципиально отличается от типичного конвейера анализа протеомики. Большинство гистоновых ПТМ по-прежнему имеют загадочные биологические функции; в результате аннотации, такие как Генная онтология или базы данных путей, недоступны. Существует несколько ресурс…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Лаборатория Сидоли с благодарностью отмечает Фонд исследований лейкемии (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (sagol Network GerOmics award), Deerfield (премия Xseed), Relay Therapeutics, Merck и Офис директора NIH (1S10OD030286-01).
Materials
| 0.05% trypsin-EDTA solution | Gibco | 25300054 | |
| 0.5-20 µL pipet tips | BRAND | 13-889-172 (Fisher Scientific) | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Bio-Rad | 2239480 | |
| 10 µL multi-channel pipette | BRAND | BR7059000 (Millipore Sigma) | |
| 10 mL syringe | Henke Sass Wolf | 14-817-31 (Fisher Scientific) | Luer lock tip, graduated to 12 mL |
| 10, 20, 200, and 1000 µL single-channel pipettes | Eppendorf | 14-285-904 (Fisher Scientific) | |
| 1000 µL pipet tips | Rainin | 30389164 | |
| 18 G syringe needle | Air-Tite | 14-817-100 (Fisher Scientific) | 3" length, 0.05" diameter |
| 200 µL multi-channel pipette | Corning | 4082 | |
| 2-200 µL pipet tips | BRAND | Z740118 (Millipore Sigma) | |
| 24-well ultra-low attachment microplate | Corning | 07-200-602 | |
| 75 cm2 U-shaped cell culture flask | Corning | 461464U | Untreated, with vent cap |
| 96-well skirted plate | Axygen | PCR-96-FS-C (Corning) | |
| Acetone | Fisher Scientific | A949-1 | Acetone should be used cold |
| Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | A6141-25G | |
| Ammonium hydroxide solution | Fisher Scientific | AC423300250 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| ClinoReactor | CelVivo | 10004-12 | Bioreactor for 3D cell culture |
| ClinoStar | CelVivo | N/A | Clinostat CO2 incubator for 3D cell culture |
| Control unit | CelVivo | N/A | Tablet for ClinoStar settings |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 17-205-CV | 1X solution with 4.5 g/L glucose and sodium pyruvate, without L-glutamine and phenol red |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Formic acid | Thermo Scientific | 28905 | |
| Fume hood | Mott | N/A | Model 7121000 |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-8B | 9", cotton-plugged, borosilicate glass, non-sterile |
| Glutagro supplement | Corning | 25-015-CI | 200 mM L-ananyl-L-glutamine |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | 1X solution without calcium, magnesium, and phenol red |
| HPLC grade acetonitrile | Fisher Scientific | A955-4 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W6-1 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A481-212 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| MEM non-essential amino acids | Corning | 25-025-CI | 100X solution |
| Oasis HLB resin | Waters | 186007549 | Hydrophilic-Lipophilic-Balanced (HLB) Resin with 30µm particle size |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | High resolution mass spectrometer |
| Oro-Flex I polypropylene filter plate | Orochem | OF1100 | 96-well polypropylene filter plate w/ 10 µM PE frit |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | 100X solution |
| pH paper | Hydrion | Z111848 (Sigma-Aldrich) | 0-13 pH test paper |
| Pipette gun | Eppendorf | Z666467 (Millipore Sigma) | |
| Polymicro capillary | Molex | 50-110-7740 (Fisher Scientific) | Flexible fused silica capillary tubing with polymide coating, 75 µM ID x 363 µM OD |
| Polystyrene 10 mL serological pipets, sterile | Fisher Scientific | 1367549 | |
| Propionic anhydride | Sigma-Aldrich | 240311-50G | |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific | 75-217-420 | |
| Reprosil-Pur resin | MSWIL | R13.AQ.0003 | 120 Å pore size, C18-AQ phase, 3 µM bead size |
| Rotator | Clay Adams | 25477 (American Laboratory Trading) | Nutator Mixer 1105 |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium butyrate | Thermo Scientific | A11079 | |
| Sodium succinate dibasic | Sigma-Aldrich | 14160-100G | |
| SpeedVac vacuum concentrator (1.5 mL microcentrifuge tubes) | Savant | 20249 (American Laboratory Trading) | |
| SpeedVac vacuum concentrator (96-well) | Thermo Scientific | 15308325 | Savant SPD1010 |
| Sterile hood | Thermo Scientific | 1375 | Class II, Type A2 |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Fisher Scientific | 02-004-375 | Baker Analyzed ACS reagent |
| Tissue-culture treated 100 mm x 20 mm dish | Fisher Scientific | 08-772-23 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Thermo Scientific | AC421451000 | Resuspend 100% w/v in HPLC grade water |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Fisher Scientific | PI28904 | Sequencing grade |
| Vacuum manifold 96-well | Millipore | MAVM0960R | |
| Vortex | Sigma-Aldrich | Z258415 | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD10 | |
| Wide bore pipet tips 1000 µL | Axygen | 14-222-703 (Fisher Scientific) | |
| Wide bore pipet tips 200 µL | Axygen | 14-222-730 (Fisher Scientific) |
References
- Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures – a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
- Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 365-377 (2005).
- Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology (Bethesda). 32 (4), 266-277 (2017).
- Wrzesinski, K., et al. The cultural divide: exponential growth in classical 2D and metabolic equilibrium in 3D environments. PLoS One. 9 (9), 106973 (2014).
- Wrzesinski, K., Fey, S. J. Metabolic reprogramming and the recovery of physiological functionality in 3D cultures in micro-bioreactors. Bioengineering (Basel). 5 (1), 22 (2018).
- Gonda, S. R., et al. Three-dimensional transgenic cell model to quantify genotoxic effects of space environment. Advances in Space Research. 27 (2), 421-430 (2001).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
- Tvardovskiy, A., et al. Top-down and middle-down protein analysis reveals that intact and clipped human histones differ in post-translational modification patterns. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (12), 3142-3153 (2015).
- Azad, G. K., et al. Modifying chromatin by histone tail clipping. Journal of Molecular Biology. 430 (18), 3051-3067 (2018).
- Kragesteen, B. K., Amit, I. Heads or tails: histone tail clipping regulates macrophage activity. Nature Immunology. 22 (6), 678-680 (2021).
- Dhaenens, M. Histone clipping: the punctuation in the histone code. EMBO Reports. 22 (8), 53440 (2021).
- Anderson, L. C., et al. Analyses of histone proteoforms using front-end electron transfer dissociation-enabled orbitrap instruments. Molecular and Cellular Proteomics. 15 (3), 975-988 (2016).
- Morgan, M. A. J., Shilatifard, A. Reevaluating the roles of histone-modifying enzymes and their associated chromatin modifications in transcriptional regulation. Nature Genetics. 52 (12), 1271-1281 (2020).
- Chan, J. C., Maze, I. Nothing is yet set in (hi)stone: novel post-translational modifications regulating chromatin function. Trends in Biochemical Sciences. 45 (10), 829-844 (2020).
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).
- Fischle, W., et al. Molecular basis for the discrimination of repressive methyl-lysine marks in histone H3 by Polycomb and HP1 chromodomains. Genes and Development. 17 (15), 1870-1881 (2003).
- Onder, O., et al. Progress in epigenetic histone modification analysis by mass spectrometry for clinical investigations. Expert Review of Proteomics. 12 (5), 499-517 (2015).
- Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry. Journal of Proteomics. 75 (12), 3419-3433 (2012).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nature Structural and Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).
- Moradian, A., et al. The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications. Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).
- Zheng, Y., Huang, X., Kelleher, N. L. Epiproteomics: quantitative analysis of histone marks and codes by mass spectrometry. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 142-150 (2016).
- Sidoli, S., Garcia, B. A. Middle-down proteomics: a still unexploited resource for chromatin biology. Expert Review of Proteomics. 14 (7), 617-626 (2017).
- Stampar, M., et al. Hepatocellular carcinoma (HepG2/C3A) cell-based 3D model for genotoxicity testing of chemicals. Science of the Total Environment. 755, 143255 (2021).
- Calitz, C., et al. Toxicity and anti-prolific properties of Xysmalobium undulatum water extract during short-term exposure to two-dimensional and three-dimensional spheroid cell cultures. Toxicology Mechanisms and Methods. 28 (9), 641-652 (2018).
- Garcia, B. A., et al. Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).
- Sidoli, S., et al. Sequential window acquisition of all theoretical mass spectra (SWATH) analysis for characterization and quantification of histone post-translational modifications. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (9), 2420-2428 (2015).
- Sidoli, S., et al. Low resolution data-independent acquisition in an LTQ-orbitrap allows for simplified and fully untargeted analysis of histone modifications. Analytical Chemistry. 87 (22), 11448-11454 (2015).
- Karch, K. R., Sidoli, S., Garcia, B. A. Identification and quantification of histone PTMs using high-resolution mass spectrometry. Methods in Enzymology. 574, 3-29 (2016).
- Yuan, Z. F., et al. EpiProfile quantifies histone peptides with modifications by extracting retention time and intensity in high-resolution mass spectra. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (6), 1696-1707 (2015).
- Yuan, Z. F., et al. EpiProfile 2.0: a computational platform for processing epi-proteomics mass spectrometry data. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2533-2541 (2018).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Pino, L. K., et al. The Skyline ecosystem: Informatics for quantitative mass spectrometry proteomics. Mass Spectrometry Reviews. 39 (3), 229-244 (2020).
- Aguilan, J. T., Kulej, K., Sidoli, S. Guide for protein fold change and p-value calculation for non-experts in proteomics. Molecular Omics. 16 (6), 573-582 (2020).
- Lex, A., et al. UpSet: Visualization of intersecting sets. IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 20 (12), 1983-1992 (2014).
- Shah, S. G., et al. HISTome2: a database of histone proteins, modifiers for multiple organisms and epidrugs. Epigenetics and Chromatin. 13 (1), 31 (2020).
- Xie, Z., et al. Lysine succinylation and lysine malonylation in histones. Molecular and Cellular Proteomics. 11 (5), 100-107 (2012).
- Liu, J., et al. Histone succinylation and its function on the nucleosome. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (15), 7101-7109 (2021).
- Howe, F. S., et al. Is H3K4me3 instructive for transcription activation. Bioessays. 39 (1), 1-12 (2017).
- Nicetto, D., Zaret, K. S. Role of H3K9me3 heterochromatin in cell identity establishment and maintenance. Current Opinion in Genetics and Development. 55, 1-10 (2019).
- Wojcik, J. B., et al. Histone H3K27 dimethyl loss is highly specific for malignant peripheral nerve sheath tumor and distinguishes true PRC2 loss from isolated H3K27 trimethyl loss. Modern Pathology. 32 (10), 1434-1446 (2019).
- Sellers, W. R., et al. Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia. Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).
- Zhang, D., et al. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation. Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).
- Farrelly, L. A., et al. Histone serotonylation is a permissive modification that enhances TFIID binding to H3K4me3. Nature. 567 (7749), 535-539 (2019).
- Chen, Q., et al. ADP-ribosylation of histone variant H2AX promotes base excision repair. The EMBO Journal. 40 (2), 104542 (2021).
- Zheng, Q., et al. Reversible histone glycation is associated with disease-related changes in chromatin architecture. Nature Communications. 10 (1), 1289 (2019).
