肝組織の3D細胞培養モデルにおけるヒストン翻訳後修飾のグローバルレベルの定量化
Summary
このプロトコルは、3次元細胞培養システムを使用して、ほぼ生理学的状態のクロマチン修飾をモデル化、処理、および分析する方法を概説しています。
Abstract
哺乳動物細胞の扁平培養は、細胞生理機能を理解するために広く使用されている インビトロ アプローチであるが、このシステムは、不自然に速い細胞複製のために固体組織のモデリングにおいて制限されている。これは、高速複製細胞がDNA複製に頻繁に関与し、不均一な倍数体集団を有するため、成熟クロマチンをモデル化する場合に特に困難である。以下に、3次元(3D)細胞培養システムを使用して静止クロマチン修飾をモデル化、処理、および分析するためのワークフローを示します。このプロトコールを使用して、肝細胞癌細胞株は、活発な栄養拡散および低い剪断力を提供するインキュベーター内で再現性のある3Dスフェロイドとして増殖される。酪酸ナトリウムおよびコハク酸ナトリウムによる処理は、それぞれヒストンアセチル化およびスクシニル化の増加を誘導した。ヒストンアセチル化およびスクシニル化のレベルの増加は、より開放的なクロマチン状態と関連している。次いで、スフェロイドを回収して細胞核を単離し、そこからヒストンタンパク質を抽出し、翻訳後修飾を分析する。ヒストン分析は、タンデム質量分析とオンラインで結合された液体クロマトグラフィー を介して 実行され、その後に社内の計算パイプラインが続きます。最後に、組み合わせヒストンマークの頻度および出現を調査するためのデータ表現の例が示されている。
Introduction
19世紀後半以来、細胞培養システムは、人体外の細胞の成長と発達を研究するためのモデルとして使用されてきました1,2。それらの使用はまた、組織および器官が健康な状況および罹患した文脈の両方でどのように機能するかを研究するために拡張されている1,3。浮遊細胞(例えば、血液細胞)は、インビボで三次元(3D)構造で集合しないので、ペトリ皿またはフラスコ中でシームレスかつ交換的に増殖する。固体器官に由来する細胞は、二次元(2D)または3D培養系のいずれかで増殖することができる。2D培養では、細胞は平坦な表面2,4に接着する単層で増殖する。2D細胞培養システムは、指数関数的な増殖および速い倍加時間(典型的には24時間〜数日5)によって特徴付けられる。3Dシステム内の細胞は、組織のようなコングロマリットをより密接にモデル化する複雑な細胞間相互作用を形成するように成長し、倍加時間が1ヶ月以上に達することができる動的平衡に達する能力によって特徴付けられる5。
この論文では、低重力をシミュレートする回転細胞培養システムで3Dスフェロイドを増殖させる革新的な方法論を紹介します6。これは、1990年代にNASAによって導入された細胞培養システムの単純化された派生物です7。このアプローチは、スピニングフラスコのような既存の方法で発生するせん断力を最小限に抑え、回転楕円体の再現性を高めます6。さらに、回転バイオリアクターは活性栄養素拡散を増加させ、培地交換が実用的でない吊り下げドロップ細胞培養のようなシステムで起こる壊死形成を最小限に抑える6。このようにして、細胞はほとんど乱れずに成長し、組織内で増殖する細胞に関連する構造的および生理学的特性の形成を可能にする。このようにして培養されたC3A肝細胞(HepG2/C3A)は、超構造細胞小器官を有するだけでなく、インビボで観察されたレベルに匹敵する量のATP、アデニル酸キナーゼ、尿素、およびコレステロールも産生した1,2。加えて、2D対.3D細胞培養系で増殖した細胞は、異なる遺伝子発現パターンを示す8。3Dスフェロイドとして増殖したC3A肝細胞の遺伝子発現解析は、これらの細胞が広範囲の肝臓特異的タンパク質、ならびに肝機能を調節する重要な経路に関与する遺伝子を発現することを示した8。以前の出版物は、2D培養における指数関数的に増殖する細胞のプロテオームと、3Dスフェロイド培養における動的平衡状態の細胞との間の違いを実証した5。これらの違いには、細胞代謝が含まれ、これは今度は細胞5の構造、機能、および生理機能に影響を及ぼす。2D培養で増殖した細胞のプロテオームは、細胞複製に関与するタンパク質がより豊富であったが、3Dスフェロイドのプロテオームは肝機能においてより豊富であった5。
3Dスフェロイドとして増殖した細胞の複製速度が遅いほど、クロマチン状態および修飾に関連する特定の現象(例えば、ヒストンクリッピング9)がより正確にモデル化される。ヒストンクリッピングは、ヒストンN末端尾部の一部のタンパク質分解的切断を引き起こす不可逆的なヒストン翻訳後修飾(PTM)である。その生物学的機能はまだ議論中である10,11,12,13が、初代細胞および肝臓組織におけるその存在は、スフェロイドとして増殖させたHepG2/C3A細胞によってモデル化されるが、平坦な細胞としてはモデル化されていないことは明らかである9。クロマチンの状態と修飾は、主に遺伝子へのアクセス可能性、ひいては遺伝子の発現を調節することによってDNAの読み出しを調節するため、これは非常に重要です14。ヒストンPTMは、ヒストンが組み立てられるヌクレオソームの正味電荷に影響を与えることによってクロマチン状態に直接影響を及ぼすか、またはクロマチンを作家、読者、および消しゴム14に募集することによって間接的に影響する。現在までに数百のヒストンPTMが同定されており15、クロマチンがDNA16を解釈するために細胞によって使用される「ヒストンコード」を宿主とする仮説を補強している。しかしながら、無数のPTMの組み合わせ15の同定、およびヒストンPTMの組み合わせが、孤立して存在するPTMとは異なる生物学的機能をしばしば有するという発見(例えば、Fischle、et al.17)は、「ヒストンコード」を解読するためにより多くの作業が必要であることを強調する。
現在、ヒストンPTM分析は、抗体を利用する技術(例えば、ウェスタンブロット、免疫蛍光、またはクロマチン免疫沈降に続いてシーケンシング[ChIP-seq])または質量分析(MS)のいずれかに基づいている。抗体ベースの技術は高感度であり、ヒストンマークのゲノムワイド局在化に関する詳細な情報を提供することができるが、まれなPTMまたは組み合わせに存在するPTMを研究する際にはしばしば制限される18、19、20。MSは、単一および共存するタンパク質修飾、特にヒストンタンパク質18、19、20のハイスループットかつ偏りのない同定および定量により適している。これらの理由から、この研究所と他のいくつかの研究所は、ヒストンペプチド(ボトムアップMS)、無傷のヒストンテール(ミドルダウンMS)、および全長ヒストンタンパク質(トップダウンMS)の分析のためにMSパイプラインを最適化しました21,22,23。
以下に詳述するのは、HepG2/C3Aスフェロイドを増殖させ、タンデム質量分析(nLC-MS/MS)とオンラインで組み合わせたナノ液体クロマトグラフィーによるヒストンペプチド分析(ボトムアップMS)の準備ワークフローです。2D細胞培養物を増殖させ、細胞を回収し、バイオリアクターに移し、そこでスフェロイドを形成し始める(図1)。培養の18日後、スフェロイドを酪酸ナトリウムまたはコハク酸ナトリウムで処理して、ヒストンアセチル化およびスクシニル化の相対的存在量を増加させた。特に、3D培養物は、遺伝子毒性化合物およびそれらの平坦な培養物と同等の化合物で処理することができる。実際、最近の出版物は、3D培養における細胞の毒物学的応答が、2D平坦培養におけるものよりも初代組織に類似していることを強調している24,25。次いで、指定された時点で細胞を回収し、核単離を行った。次いで、ヒストンを抽出し、ガルシアらによって最初に開発されたプロトコールに従ってトリプシン消化の前後に無水プロピオン酸で誘導体化した。この手順により、逆相クロマトグラフィー(C18)によるオンライン分離およびMSによる検出に適したサイズのペプチドが生成されます。最後に、ヒストンペプチドを同定および定量し、生成されたデータを、より完全な生物学的解釈のために複数の方法で表した。
Protocol
Representative Results
Discussion
ヒストンPTMの分析は、典型的なプロテオミクス分析パイプラインとは根本的に異なります。ほとんどのヒストンPTMは依然として謎めいた生物学的機能を持っています。その結果、遺伝子オントロジーや経路データベースなどの注釈は利用できません。ヒストン修飾をそれらの触媒作用を担う酵素またはこれらのPTMに結合するドメインを含むタンパク質(例えば、HISTome36)に関?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Sidoli研究室は、白血病研究財団(Hollis Brownstein New Investigator Research Grant)、AFAR(Sagol Network GerOmics Award)、Deerfield(Xseed Award)、Relay Therapeutics、Merck、NIH所長室(1S10OD030286-01)を感謝の意をもって認めています。
Materials
| 0.05% trypsin-EDTA solution | Gibco | 25300054 | |
| 0.5-20 µL pipet tips | BRAND | 13-889-172 (Fisher Scientific) | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Bio-Rad | 2239480 | |
| 10 µL multi-channel pipette | BRAND | BR7059000 (Millipore Sigma) | |
| 10 mL syringe | Henke Sass Wolf | 14-817-31 (Fisher Scientific) | Luer lock tip, graduated to 12 mL |
| 10, 20, 200, and 1000 µL single-channel pipettes | Eppendorf | 14-285-904 (Fisher Scientific) | |
| 1000 µL pipet tips | Rainin | 30389164 | |
| 18 G syringe needle | Air-Tite | 14-817-100 (Fisher Scientific) | 3" length, 0.05" diameter |
| 200 µL multi-channel pipette | Corning | 4082 | |
| 2-200 µL pipet tips | BRAND | Z740118 (Millipore Sigma) | |
| 24-well ultra-low attachment microplate | Corning | 07-200-602 | |
| 75 cm2 U-shaped cell culture flask | Corning | 461464U | Untreated, with vent cap |
| 96-well skirted plate | Axygen | PCR-96-FS-C (Corning) | |
| Acetone | Fisher Scientific | A949-1 | Acetone should be used cold |
| Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | A6141-25G | |
| Ammonium hydroxide solution | Fisher Scientific | AC423300250 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| ClinoReactor | CelVivo | 10004-12 | Bioreactor for 3D cell culture |
| ClinoStar | CelVivo | N/A | Clinostat CO2 incubator for 3D cell culture |
| Control unit | CelVivo | N/A | Tablet for ClinoStar settings |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 17-205-CV | 1X solution with 4.5 g/L glucose and sodium pyruvate, without L-glutamine and phenol red |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Formic acid | Thermo Scientific | 28905 | |
| Fume hood | Mott | N/A | Model 7121000 |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-8B | 9", cotton-plugged, borosilicate glass, non-sterile |
| Glutagro supplement | Corning | 25-015-CI | 200 mM L-ananyl-L-glutamine |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | 1X solution without calcium, magnesium, and phenol red |
| HPLC grade acetonitrile | Fisher Scientific | A955-4 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W6-1 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A481-212 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| MEM non-essential amino acids | Corning | 25-025-CI | 100X solution |
| Oasis HLB resin | Waters | 186007549 | Hydrophilic-Lipophilic-Balanced (HLB) Resin with 30µm particle size |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | High resolution mass spectrometer |
| Oro-Flex I polypropylene filter plate | Orochem | OF1100 | 96-well polypropylene filter plate w/ 10 µM PE frit |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | 100X solution |
| pH paper | Hydrion | Z111848 (Sigma-Aldrich) | 0-13 pH test paper |
| Pipette gun | Eppendorf | Z666467 (Millipore Sigma) | |
| Polymicro capillary | Molex | 50-110-7740 (Fisher Scientific) | Flexible fused silica capillary tubing with polymide coating, 75 µM ID x 363 µM OD |
| Polystyrene 10 mL serological pipets, sterile | Fisher Scientific | 1367549 | |
| Propionic anhydride | Sigma-Aldrich | 240311-50G | |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific | 75-217-420 | |
| Reprosil-Pur resin | MSWIL | R13.AQ.0003 | 120 Å pore size, C18-AQ phase, 3 µM bead size |
| Rotator | Clay Adams | 25477 (American Laboratory Trading) | Nutator Mixer 1105 |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium butyrate | Thermo Scientific | A11079 | |
| Sodium succinate dibasic | Sigma-Aldrich | 14160-100G | |
| SpeedVac vacuum concentrator (1.5 mL microcentrifuge tubes) | Savant | 20249 (American Laboratory Trading) | |
| SpeedVac vacuum concentrator (96-well) | Thermo Scientific | 15308325 | Savant SPD1010 |
| Sterile hood | Thermo Scientific | 1375 | Class II, Type A2 |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Fisher Scientific | 02-004-375 | Baker Analyzed ACS reagent |
| Tissue-culture treated 100 mm x 20 mm dish | Fisher Scientific | 08-772-23 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Thermo Scientific | AC421451000 | Resuspend 100% w/v in HPLC grade water |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Fisher Scientific | PI28904 | Sequencing grade |
| Vacuum manifold 96-well | Millipore | MAVM0960R | |
| Vortex | Sigma-Aldrich | Z258415 | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD10 | |
| Wide bore pipet tips 1000 µL | Axygen | 14-222-703 (Fisher Scientific) | |
| Wide bore pipet tips 200 µL | Axygen | 14-222-730 (Fisher Scientific) |
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