Summary

יצירת תאי גזע מזנכימליים מרקמת חבל הטבור האנושית והתמיינותם לשושלת שרירי השלד

Published: August 31, 2022
doi:

Summary

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד תאי גזע מזנכימליים מרקמת חבל הטבור האנושית והתמיינותם לשושלת שרירי השלד.

Abstract

חקר הפוטנציאל הטיפולי של תאי גזע מזנכימליים מותנה בקלות הבידוד, בעוצמה לקראת התמיינות ובאמינות ובחוסן של המקור. אנו מתארים כאן פרוטוקול מדורג לבידוד תאי גזע מזנכימליים מרקמת חבל הטבור האנושית (uMSCs), האימונופנוטיפ שלהם והתפשטות תרביות כאלה על פני מספר מעברים. בהליך זה, הכדאיות של uMSCs היא גבוהה כי אין עיכול אנזימטי. יתר על כן, הסרת כלי הדם, כולל עורקי חבל הטבור והווריד, מבטיחה כי אין זיהום של תאים ממוצא אנדותל. באמצעות ציטומטריה של זרימה, uMSCs בעת הבידוד הם CD45CD34, מה שמעיד על היעדר תאים מהשושלת ההמטופוייטית. חשוב לציין שהם מבטאים סמני פני שטח מרכזיים, CD105, CD90 ו-CD73. עם הקמתן של תרביות, מאמר זה מתאר שיטה יעילה להשראת התמיינות ב-uMSCs אלה לשושלת שרירי השלד. ניתוח מפורט של התקדמות מיוגנית ב- uMSCs מובחנים מגלה כי uMSCs מבטאים את Pax7, סמן לאבות מיוגניים בשלבים הראשונים של התמיינות, ואחריו הביטוי של MyoD ו- Myf5, ולבסוף, סמן התמיינות מסוף, שרשרת כבדה של מיוזין (MyHC).

Introduction

חבל הטבור האנושי נזקף לזכותו כבעל מאגר חזק של תאי גזע מזנכימליים, הנחקרים כיום לטיפולים רגנרטיביים בשל שיעורי ההתרבות וההתמיינות החזקים שלהם, התכונות האימונומודולטוריות והיכולת לייצר תאים מכל שלוש שכבות הנבט1. רקמת חבל הטבור מורכבת ממספר תאים כגון דם טבורי, תת-האנדותל של וריד הטבור, והג’לי של וורטון (WJ), אשר כשלעצמו מקיף שלושה אזורים לא ברורים – האזור הפריווסקולרי, האזור הבין-וסקולרי, ותת-האניון או בטנת החבל (CL)2. בעוד שניתן לבודד uMSCs מכל האזורים השונים הללו ולבטא באופן רחב סמני MSC מרכזיים, אין בהירות אם תאים אלה מכילים את אותה אוכלוסייה של uMSCs או מציגים הבדלים בעוצמת ההבחנה שלהם3. לפיכך, פרוטוקולים לבידוד של uMSCs דורשים דיוק רב יותר במצבם ובאזור הבידוד שלהם, אפיון חזק של פוטנציאל ההבחנה, ולבסוף, ניתוח השוואתי מתאים שונים של הכבל.

בהקשר זה, מעטים המחקרים שהדגימו הבדלים בפוטנציאלים המתרבים וההבחנתיים של uMSC בין חלקים שונים של הכבל. מתוכם, ניתוחים השוואתיים בין uMSCs שבודדו מאזורי CL ו-WJ חשפו פוטנציאל התפשטות גדול יותר ב-uMSCs שמקורם ב-CL 3,4. במחקר נפרד, uMSCs שמקורם ב-WJ הציגו ביצועים טובים יותר במבחני התפשטות בהשוואה לתאים פריווסקולריים (HUCPV)5. בבחינת ההבדלים בין uMSCs שמקורם בדם טבורי לבין uMSCs שמקורם ברקמת כבל ללא זיהום כלי דם, דווח על ביטוי דיפרנציאלי של סמני MSC מרכזיים בין שני התאים, כמו גם על שיעורי שגשוג מוגברים ב-uMSCs6 שמקורם ברקמת כבל.

מבין מספר המחקרים שבחנו את פוטנציאל ההתמיינות של uMSCs בעיקר לרקמות של שושלת המזודרם כגון שושלות אוסטאוגניות, אדיפוגניות וכונדרוגניות, מעטים מאוד סיפקו פרוטוקולים מפורטים להבחנה מיוגנית ולאפיון שלאחר מכן, כמו גם ניתוחים השוואתיים בין תאי חוטים שונים. בהקשר זה, פיתחנו פרוטוקול התמיינות שרירים חזק וראינו כי uMSCs שמקורם ברקמת כבל מפגינים יכולות התמיינות מיוגניות מעולות בהשוואה לדם טבורי6. כאן מפורט פרוטוקול שלבים לבידוד של uMSCs מכל רקמת הכבל נטולת תאים הקשורים לכלי הדם, לאפיון שלהם ולהתמיינותם לשושלת המיוגנית.

Protocol

השימוש ברקמת חבל הטבור במחקר זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לחקר תאי גזע (IC-SCR), ועדת האתיקה המוסדית, המכון למדע וטכנולוגיה של בריאות תרגומית (IEC-THSTI), ועדת האתיקה המוסדית של בית החולים האזרחי, גורוגרם, הריאנה, והוועדה לביו-בטיחות מוסדית, THSTI. דגימות רקמת חבלים אנושיות נקטפו מלידה בזמן הלידה. הסכ…

Representative Results

ההצלחה של בידוד של uMSCs מרקמת כבל היא >95%, בניגוד לשיעורי ההצלחה הגרועים של דם טבורי שלם. לאחר בידוד מוצלח של uMSCs, ניתוח FACS מגלה כי כל התאים הם CD34−CD45−CD105+CD90+. עם זאת, בניתוח השוואתי, uMSCs המבודדים מדם טבורי מציגים אוכלוסיות הטרוגניות, כאשר חלק מהתאים מראים CD34+CD45+</su…

Discussion

שלבים קריטיים
שלב קריטי בפרוטוקול זה הוא איסוף רקמות בתנאים אספטיים, מרגע המסירה ועד לתחזוקת תרביות סטריליות, לכל משך ההתפשטות. במהלך איסוף הכבלים, חיוני שהכבל לא ייגע בשום משטח שאינו מעוקר והוא מתפתל חיצונית עם 70% אתנול לפני האיסוף בצינורות המכילים PBS בתוספת אנטיביוטיקה. חשוב ל…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים למר אוג’ס טיקו על עזרתם בצילומים ובהפקת וידאו. אנו מכירים גם בעזרה שקיבלנו מצוות GARBH-Ini (קבוצה בין-תחומית על מחקר מתקדם ותוצאת לידה -DBT הודו), אחיות וקציני מחקר בכירים בבית החולים האזרחי גורוגראם וד”ר פאלאווי קשטרפאל לעזרה בלוגיסטיקה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים שהוענקו לסוצ’יטרה גופינאת מהמחלקה לביוטכנולוגיה, הודו (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).

Materials

4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher Scientific D1306
Amphotericin B Sigma Aldrich A2411
Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline) HiMedia A001A-50mL
Anti-GAPDH antibody Sigma Aldrich G8795
Anti-MyHC antibody (My32) Novus Biologicals NBP2-50401AF647
Anti-MyoD antibody (5.8A) Novus Biologicals NB100-56511
Anti-Myogenin antibody (Clone F5D) Novus Biologicals NBP2-34616AF594
Anti-Pax7 antibody DSHB DSHB-C1-576
APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 BD Biosciences 559869
Collagen Type 1 Merck C8919
D (+) Glucose Sigma Aldrich G7021
Dexamethasone SIGMA D4902
FACSCanto II or FACSAria III BD Biosciences
Fetal Bovine Serum, qualified Brazil GIBCO 10270106 not to be heat-inactivated
FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9 BD Biosciences 551146
FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2 BD Biosciences 557153
FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59 BD Biosciences 557508
FITC Mouse anti-human CD34 clone 581 BD Biosciences 555821
FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30 BD Biosciences 555482
FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10 BD Biosciences 560840
FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 BD Biosciences 555595
FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6 BD Biosciences 557348
FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145 BD Biosciences 555786
FlowJo software BD Biosciences
Gentamicin Sigma Aldrich G1264
Horse serum HiMedia RM1239
Hydrocortisone Merck H4001
Laminin Merck L2020
MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides Hyclone SH30568.FS Basal medium for uMSCs
PE Mouse anti-human CD105 clone 266 BD Biosciences 560839
PE Mouse anti-human CD44 clone 515 BD Biosciences 550989
PE Mouse anti-human CD49E clone llA1 BD Biosciences 555617
PE Mouse anti-human IgG clone G18-145 BD Biosciences 555787
PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2 BD Biosciences 561258
Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4 HiMedia M1866
Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) HiMedia TCL049-100mL

References

  1. Kuroda, Y., et al. Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8639-8643 (2010).
  2. Troyer, D. L., Weiss, M. L. Wharton’s jelly-derived cells are a primitive stromal cell population. Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).
  3. Karahuseyinoglu, S., et al. Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: In situ and in vitro surveys. Stem Cells. 25 (2), 319-331 (2007).
  4. Kita, K., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Jeschke, M. G. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane. Stem Cells and Development. 19 (4), 491-502 (2010).
  5. Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: A source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
  6. Mishra, S., et al. Umbilical cord tissue is a robust source for mesenchymal stem cells with enhanced myogenic differentiation potential compared to cord blood. Scientific Reports. 10 (1), 18978 (2020).
  7. Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
  8. Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton’s Jelly of umbilical cord. Methods in Cell Biology. 86, 101-119 (2008).
  9. Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 24 (2), 462-471 (2006).
  10. Yoon, J. H., et al. Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton’s jelly. BioMed Research International. 2013, 428726 (2013).
  11. Ishige, I., et al. Comparison of mesenchymal stem cells derived from arterial, venous, and Wharton’s jelly explants of human umbilical cord. International Journal of Hematology. 90 (2), 261-269 (2009).
  12. Chal, J., et al. Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy. Nature Biotechnology. 33 (9), 962-969 (2015).

Play Video

Cite This Article
Sevak, J. K., Gopinath, S. D. Generation of Mesenchymal Stem Cells from Human Umbilical Cord Tissue and their Differentiation into the Skeletal Muscle Lineage. J. Vis. Exp. (186), e63725, doi:10.3791/63725 (2022).

View Video