Summary
Descriviamo un protocollo per l'isolamento delle cellule staminali mesenchimali dal tessuto del cordone ombelicale umano e la loro differenziazione nel lignaggio muscolare scheletrico.
Abstract
L'esplorazione del potenziale terapeutico delle cellule staminali mesenchimali dipende dalla facilità di isolamento, dalla potenza verso la differenziazione e dall'affidabilità e dalla robustezza della fonte. Descriviamo qui un protocollo graduale per l'isolamento delle cellule staminali mesenchimali dal tessuto del cordone ombelicale umano (uMSCs), la loro immunofenotipizzazione e la propagazione di tali colture su diversi passaggi. In questa procedura, la vitalità degli uMSC è elevata perché non vi è alcuna digestione enzimatica. Inoltre, la rimozione dei vasi sanguigni, comprese le arterie del cordone ombelicale e la vena, assicura che non vi sia contaminazione delle cellule di origine endoteliale. Utilizzando la citometria a flusso, le uMSC all'isolamento sono CD45−CD34−, indicando un'assenza di cellule dalla linea ematopoietica. È importante sottolineare che esprimono marcatori di superficie chiave, CD105, CD90 e CD73. Al momento della creazione di colture, questo documento descrive un metodo efficace per indurre la differenziazione in queste uMSC nel lignaggio del muscolo scheletrico. Un'analisi dettagliata della progressione miogenica nelle uMSC differenziate rivela che le uMSC esprimono Pax7, un marker per i progenitori miogeni nelle fasi iniziali della differenziazione, seguito dall'espressione di MyoD e Myf5 e, infine, un marcatore di differenziazione terminale, la catena pesante della miosina (MyHC).
Introduction
Il cordone ombelicale umano è stato accreditato per possedere un robusto serbatoio di cellule staminali mesenchimali, che sono attualmente in fase di esplorazione per terapie rigenerative a causa dei loro robusti tassi di proliferazione e differenziazione, proprietà immunomodulatorie e capacità di generare cellule da tutti e tre gli strati germinali1. Il tessuto del cordone ombelicale è costituito da più compartimenti come il sangue del cordone ombelicale, il subendotelio della vena ombelicale e la gelatina di Wharton (WJ), che di per sé comprende tre regioni indistinte: la zona perivascolare, la zona intervascolare e il sub-amnione o il rivestimento del cordone (CL)2. Mentre gli uMSC possono essere isolati da tutte queste diverse regioni ed esprimere ampiamente i marcatori MSC chiave, non c'è chiarezza sul fatto che questi compartimenti contengano la stessa popolazione di uMSC o mostrino differenze nelle loro potenze di differenziazione3. Pertanto, i protocolli per l'isolamento delle uMSC richiedono una maggiore precisione nella loro modalità e regione di isolamento, la robusta caratterizzazione dei potenziali di differenziazione e, infine, un'analisi comparativa da diversi compartimenti del cavo.
In questo contesto, pochi studi hanno dimostrato differenze nei potenziali proliferativi e differenziativi uMSC tra le diverse parti del cavo. Di queste, le analisi comparative tra uMSC isolate dalle regioni CL e WJ hanno rivelato un maggiore potenziale proliferativo nelle UMSC derivate da CL 3,4. In uno studio separato, le uMSC derivate da WJ hanno ottenuto risultati migliori nei saggi di proliferazione rispetto alle cellule perivascolari (HUCPV)5. Nell'esaminare le differenze tra le uMSC derivate dal sangue cordonale e le uMSC derivate dal tessuto cordonale prive di contaminazione vascolare, è stata riportata un'espressione differenziale dei marcatori MSC chiave tra i due compartimenti, nonché un aumento dei tassi di proliferazione nelle uMSC derivate dal tessuto cordonale6.
Dei numerosi studi che esaminano i potenziali di differenziazione delle uMSC principalmente nei tessuti del lignaggio mesodermico come i lignaggi osteogenici, adipogenici e condrogeni, pochissimi hanno fornito protocolli dettagliati per la differenziazione miogenica e la successiva caratterizzazione, nonché analisi comparative tra vari compartimenti del cordone ombelicale. In questo contesto, abbiamo sviluppato un robusto protocollo di differenziazione muscolare e osservato che le uMSC derivate dal tessuto cordonale mostrano capacità di differenziazione miogenica superiori rispetto al sangue del cordone ombelicale6. Qui, un protocollo graduale è dettagliato per l'isolamento delle uMSC dall'intero tessuto cordonale privo di cellule associate alla vascolarizzazione, alla loro caratterizzazione e alla loro differenziazione nel lignaggio miogenico.
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Protocol
L'uso del tessuto del cordone ombelicale in questo studio è stato approvato dal Comitato istituzionale per la ricerca sulle cellule staminali (IC-SCR), dal Comitato etico istituzionale, dall'Istituto di scienza e tecnologia della salute traslazionale (IEC-THSTI), dal Comitato etico istituzionale dell'ospedale civile, Gurugram, Haryana e dal Comitato istituzionale per la biosicurezza, THSTI. Campioni di tessuto cordonale umano sono stati raccolti da parti a termine al momento della nascita. Il consenso scritto informato è stato ottenuto dai soggetti. Tutti i metodi sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti pertinenti.
1. Isolamento delle MSC dal tessuto del cordone ombelicale
- Al momento della consegna, tagliare almeno 5 cm di corda, preferibilmente più vicino alla placenta, e sterilizzare la corda tamponando la superficie esterna con il 70% di etanolo. Trasferire il pezzo di tessuto cordonale in sequenza da un tubo di raccolta da 50 ml contenente soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a un altro contenente lo stesso. Trasportare il tubo di raccolta recante il nome del soggetto su ghiaccio al laboratorio entro 1 ora.
NOTA: per uno studio più ampio, potrebbe essere utile codificare a barre i campioni per consentire il loro monitoraggio durante lo studio. È importante sottolineare che a tutto il personale che gestisce tessuti umani dovrebbe essere offerto il regime completo del vaccino contro l'epatite B. - In laboratorio, accendere l'UV per 25 minuti nella cappa BSL-2 per sterilizzare strumenti e pipette autoclavati prima dell'uso.
- Trasferire il pezzo di tessuto cordonale dal tubo di raccolta a un piatto da 10 cm2 trattati con coltura tissutale contenente PBS arricchito con 5 g/L di glucosio, 50 μg/mL di gentamicina, 2,5 μg/mL di amfotericina B, 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina (schematico nella Figura 1).
- Usando un bisturi, affettare il tessuto del cordone verticalmente lungo il suo asse longitudinale per ottenere due pezzi semicilindrici. A causa della torsione del cavo e della superficie mucoide, fissare il tessuto con un paio di pinze tenute nell'altra mano.
- A questo punto, osservare le arterie ombelicali e la vena e rimuovere i vasi sanguigni utilizzando un bisturi per raschiarli via in una direzione dalla superficie. Risciacquare nuovamente il tessuto cordonale in PBS per rimuovere tutto il sangue residuo associato al tessuto. Assicurarsi che la raschiatura sia delicata per preservare l'integrità delle cellule nel WJ che circonda i vasi.
- Tritare ogni metà del tessuto cordonale in frammenti di dimensioni 0,5 cm3 e posizionare i frammenti con la superficie luminale rivolta verso il basso sul piatto. Incubare brevemente il piatto per 10 minuti in una camera umidificata a 37 °C contenente il 5% di CO2.
- Dopo l'incubazione, inondare il piatto contenente i pezzi di tessuto cordonale con 20 ml di mezzo contenente MEM Alpha Modification senza L-glutammina, ribo- e desossiribonucleosidi, siero bovino fetale al 15% (non inattivato dal calore) e 50 μg/mL di gentamicina. Aggiungere delicatamente il mezzo di crescita lungo i lati per evitare che gli espianti tissutali vengano spostati dal loro orientamento. Aggiungere il mezzo in eccesso per tenere conto di una frazione che verrà assorbita dagli espianti di tessuto durante l'incubazione.
- Dopo 3 giorni di incubazione, aggiungere terreno fresco alle colture. Assicurarsi che le colture siano protette dagli urti e dal movimento degli espianti durante la manipolazione dei piatti.
- Dopo 1 settimana, rimuovere i frammenti di tessuto singolarmente utilizzando una pinza sterile e scartare utilizzando appositi sacchetti a rischio biologico per lo smaltimento. Mantenere il mezzo esistente e aggiungere 10 ml di terreno di crescita fresco. Sostituire il mezzo di crescita ogni 4 giorni fino a quando le singole colonie raggiungono una confluenza del 70%.
NOTA: È probabile che le cellule non saranno distribuite uniformemente in tutto il piatto, poiché ci saranno singole colonie proliferative che devono essere monitorate per la confluenza con il tempo. Generalmente, entro un mese, un piatto di 10 cm2 genera abbastanza cellule da dividere in un piatto separato. - Raccogliere le cellule aderenti utilizzando la soluzione di tripsina / EDTA (1x 0,25% di tripsina e 0,02% di EDTA in Hanks Balanced Salt Solution [HBSS]). Centrifugare la sospensione cellulare a 470 × g per 5 minuti a 25 °C e risospesare il pellet cellulare nel mezzo di crescita.
2. Immunofenotipizzazione e propagazione di uMSCS
- Procedere all'immunofenotipizzazione una volta che le cellule aderenti hanno raggiunto il 50%-60% di confluenza e sono ben diffuse. Non eseguire l'analisi dei marcatori MSC su colture completamente confluenti, poiché ciò tende a causare una downregulation dei marcatori MSC chiave.
- Dopo la tripsinizzazione, distribuire una sospensione cellulare di 1 × 106 cellule/mL in tubi FACS (1 × 105 cellule/tubo) e colorare con opportuni anticorpi legati al fluoroforo (tutta la diluizione 1:50) in combinazione: non macchiato; CD105 + CD90; CD105 + CD73; CD105; CD90; CD73; CD34 + CD45 (fluoroforo comune); controlli isotipici per ogni fluoroforo. Registrare un numero totale di eventi di almeno 10.000 sul citometro a flusso per ulteriori analisi.
NOTA: poiché le celle vengono analizzate separatamente per ciascun marcatore di superficie, non è necessario gating su sottoinsiemi di celle. - Oltre ai marcatori di cui sopra, confermare la presenza di marcatori di superficie positivi e negativi nelle linee uMSC create da singoli campioni di tessuto cordonale (Tabella 1).
- Analizzare le cellule marcate mediante citometria a flusso e determinare la percentuale di cellule CD105+CD90+ e CD105+CD73+. Analizzare separatamente le celle CD105+ e CD34−CD45−.
3. Differenziazione delle uMSC in muscolo scheletrico
- Piastre di coltura del tessuto del rivestimento con 0,01% di collagene e 20 μg/mL di laminina in PBS. Rivestire queste piastre per un minimo di 4 ore a temperatura ambiente.
- Piastra uMSCs ad una densità di 10.000 cellule/cm2 in terreno di crescita.
- Quando le cellule sono confluenti al 70%, aspirare il mezzo di crescita e risciacquare le colture 2 volte con PBS. Aggiungere il mezzo di differenziazione miogenico (M1) composto da DMEM + 5% siero equino + 0,1 μM desametasone + 50 μM idrocortisone alle uMSC. Per determinare la cinetica della progressione miogenica, aggiungere M1 medium a giorni alterni alle colture.
- Per determinare la cinetica della progressione miogenica, analizzare le uMSC per l'espressione di Pax7, MyoD, Myogenin e MyHC rispettivamente a 2 giorni, 4-5 giorni, 6-7 giorni e 10-14 giorni.
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Representative Results
Il successo dell'isolamento delle uMSC dal tessuto del cordone ombelicale è >95%, a differenza degli scarsi tassi di successo del sangue del cordone ombelicale intero. Dopo aver isolato con successo le uMSC, l'analisi FACS rivela che tutte le cellule sono CD34−CD45−CD105+CD90+. Tuttavia, in analisi comparativa, le uMSC isolate dal sangue del cordone ombelicale mostrano popolazioni eterogenee, in cui una percentuale di cellule mostra CD34 + CD45 + CD105 + (~ 15%). Inoltre, i CD105+CD90+ double-positivi sono meno numerosi (~5%) (Figura supplementare S1). Ciò si traduce in livelli ridotti di differenziazione miogenica tra le uMSC dal sangue del cordone ombelicale, poiché sia l'espressione di CD105 che di CD90 sono necessarie per l'induzione della miogenesi. Gli uMSC visualizzano anche l'espressione dei marcatori elencati nella Tabella 1. Se c'è contaminazione delle uMSC derivate dal sangue del cordone ombelicale, ci sarà anche una presenza di cellule CD34 + CD45 +. Ciò si traduce in falsi conteggi cellulari per la placcatura per la differenziazione miogenica. Un'indicazione che >90% delle cellule sono doppiamente positive per l'espressione cd105 e CD90 è che le uMSC non si sono impegnate in alcun lignaggio mesodermico e continuano a rimanere multipotenti, poiché sia l'espressione CD105 che CD90 sono sottoregolate al momento della differenziazione. È imperativo utilizzare più marcatori per la conferma dei fenotipi uMSC, poiché non esiste un singolo marcatore uMSC definitivo. In questa analisi, abbiamo valutato la presenza di tutti i marcatori elencati nella Tabella 1 per ciascuna delle linee uMSC stabilite in laboratorio. Inoltre, abbiamo determinato lo stato di doppio positivo di CD105 e CD90 (Figura 2A), nonché di CD105 e CD73 (Figura 2B), assicurando che gli uMC esprimano più marcatori chiave. Ciò è necessario per evitare di contaminare le cellule single-positive che sono presenti in numero inferiore allo 0,05%.
Figura 1: Schema che mostra l'isolamento graduale e la caratterizzazione delle uMSC dal tessuto cordonale. Abbreviazione: uMSCs = cellule staminali mesenchimali dal tessuto del cordone ombelicale umano. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Analisi dei marcatori MSC nelle uMSC derivate dal tessuto cordonale. (A) Le uMSC mostrano l'espressione di CD105 e CD90 e non esprimono marcatori ematopoietici, CD34 e CD45. Vengono mostrati grafici FACS rappresentativi di tre linee uMSC (UCT15, UCT18 e UCT26) (N = 16). La fila superiore dei pannelli mostra le celle in tutte e tre le linee uMSC nel quadrante Q2 positive per l'espressione CD105 e CD90. La riga inferiore dei pannelli mostra le celle nel quadrante Q1 positive per l'espressione CD105 e negative per l'espressione CD34 e CD45. (B) gli uMSC visualizzano l'espressione del marcatore MSC, CD73 (N = 16). Abbreviazione: uMSCs = cellule staminali mesenchimali dal tessuto del cordone ombelicale umano. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Marcatori positivi uMSC | Marcatori negativi uMSC |
| CD105 · | CD34 · |
| CD90 · | CD45 · |
| CD73 · | CD106 · |
| CD29 · | HLA DR |
| CD44 · | CD31 · |
| HLA ABC | CD14 · |
| CD49e · | CD49e · |
| CD54 · | |
| CD13 · |
Tabella 1: Elenco dei marcatori positivi e negativi per gli uMSC. Abbreviazione: uMSCs = cellule staminali mesenchimali dal tessuto del cordone ombelicale umano.
Per la differenziazione delle uMSC nel lignaggio miogenico, le uMSC esprimono tipicamente Pax7, un marcatore per le cellule precursori entro i primi 2 giorni dall'aggiunta di M1, seguito da MyoD entro i primi 4 giorni dall'aggiunta di M1 (Figura 3). A 6 giorni di differenziazione, le cellule esprimono la proteina Myogenin, seguita dall'espressione della catena pesante della miosina (MyHC) tra 10 giorni e 14 giorni dall'induzione del differenziamento. Abbiamo caratterizzato in modo più dettagliato la cinetica dell'espressione miogenica utilizzando il sequenziamento dell'RNA, la citometria a flusso, l'immunocitochimica, la RT-PCR e l'analisi western blot per documentare l'espressione graduale dei marcatori miogenici, confermando la robustezza di questo protocollo. Il sequenziamento trascrittomico dell'intero genoma tra uMSC indifferenziate e uMSC che sono state differenziate in muscolo scheletrico ha rivelato la sovraregolazione di 907 geni in risposta all'induzione del differenziamento miogenico (Figura 4).
Figura 3: Differenziazione delle uMSC in muscolo scheletrico. Le uMSC sono state coltivate in mezzo M1 per 2 giorni, 4 giorni, 7 giorni e 10 giorni e valutate per (A) Pax7 dopo 2 giorni, (B) MyoD dopo 4 giorni, (C) Espressione di miogenina da diverse linee uMSC, indicata da T8, T12, T14 e T25 dopo 7 giorni e (D) MyHC dopo 10 giorni. Barre di scala = (B, D) 50 μm. Abbreviazioni: uMSCs = cellule staminali mesenchimali da tessuto del cordone ombelicale umano; GAPDH = gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi; MyoD = proteina di determinazione dei mioblasti 1; MyHC = catena pesante di miosina; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo; Mb = mioblasto; MT = miotubo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Profilo trascrittomico comparativo delle uMSC derivate dal sangue del cordone ombelicale e dal tessuto cordonale differenziato in muscolo scheletrico. Mappa termica dei conteggi normalizzati di 907 geni tra uMSC di controllo e uMSCs differenziati in muscolo scheletrico per 7 giorni dal sangue del cordone ombelicale e dal tessuto cordonale. Il diagramma di Venn (a sinistra) mostra un numero maggiore di geni miogenici sovraregolati nelle uMSC derivate dal tessuto cordonale rispetto alle uMSC derivate dal sangue cordonale. La tabella seguente mostra i geni miogenici comuni sovraregolati sia nel tessuto del cordone ombelicale che nel sangue del cordone ombelicale. Questa cifra è tratta da Mishra et al.6. Abbreviazioni: 1, 2 = repliche biologiche; CB1,2 = cellule miogeniche derivate da uMSC del sangue cordonale; CT1, 2 = cellule miogeniche derivate da uMSC del tessuto cordonale; coB1,2 = controllare le uMSC indifferenziate dal sangue del cordone ombelicale; coT1, 2 = controllare le uMSC indifferenziate dal tessuto cordonale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Ai fini della conduzione di un'analisi comparativa, abbiamo confrontato le uMSCs isolate dal sangue del cordone ombelicale e dal tessuto cordonale. I dati di sequenziamento dell'RNA hanno rivelato che c'erano più geni miogenici sovraregolati nelle uMSC da cellule miogeniche derivate dal tessuto del cordone ombelicale che da quelle derivate dal sangue del cordone ombelicale (Figura 4). I dati di sequenziamento dell'RNA utilizzati a supporto di questo studio vengono caricati su NCBI (l'adesione SRA è GSE147114). In breve, l'analisi trascrittomica tessuto-specifica utilizzando il database PANTHER GO-slim ha identificato proteine citoscheletriche associate al legame con l'actina e all'assemblaggio del sarcomero (TPM2, LDB3, PDLIM3, FHL1, NEXN, MYOM1) trasportatori associati alla funzione contrattile (RTN2, SLC19A2, ACHE, SCN1B, SLC19A2, JPH2, KCNJ12, ANKRD1), mantenimento della massa muscolare ( FBXO32, TRIM16L, GHR), segnalazione del calcio (FKBP5) e funzione enzimatica (COX7A1, PDK4) (Figura 4). Complessivamente, questi dati dimostrano che le uMSC derivate dal tessuto cordonale rappresentano un compartimento che mostra un robusto potenziale miogenico.
A causa della variazione individuale tra le linee uMSC che potrebbe derivare da efficienze nell'isolamento, eterogeneità all'interno del compartimento uMSC, età della madre e stato di salute della madre, compresi i suoi livelli di nutrienti, potrebbero esserci differenze nei tassi di proliferazione e nei potenziali miogeni tra le linee uMSC stabilite. Tuttavia, nonostante le differenze nella cinetica di espressione, viene mantenuta la tendenza generale ad aumentare la miogenicità con l'espressione graduale dei marcatori miogenici.
Figura supplementare S1: Analisi dei marcatori MSC nelle uMSC derivate dal sangue del cordone ombelicale. Le uMSC mostrano l'espressione di CD105 e marcatori ematopoietici, CD34 e CD45. L'analisi della popolazione CD105+ mostra che solo una piccola percentuale di queste cellule co-esprime CD90 (N = 5). Abbreviazione: uMSCs = cellule staminali mesenchimali dal tessuto del cordone ombelicale umano. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Passaggi critici
Un passaggio critico in questo protocollo è la raccolta del tessuto in condizioni asettiche, dal momento della consegna al mantenimento di colture sterili, per l'intera durata della propagazione. Durante la raccolta del cavo, è essenziale che il cavo non tocchi alcuna superficie non sterilizzata e venga tamponato esternamente con etanolo al 70% prima della raccolta in tubi contenenti PBS integrati con antibiotici. È importante limitare il tempo tra la raccolta del cordone e l'elaborazione del tessuto per l'isolamento uMSC. Nel caso in cui sia necessario trasportare il tessuto dal sito di raccolta al laboratorio, è necessario prestare attenzione a mantenere il tessuto in tamponi contenenti antibiotici e conservarlo sul ghiaccio.
Modifiche e risoluzione dei problemi del metodo
La modifica chiave in questo protocollo per indurre la differenziazione miogenica delle uMSC è il rivestimento di piatti con collagene di tipo 1 allo 0,01% e laminina di tipo 20 μg / mL. Abbiamo osservato che la progressione miogenica nelle uMSC in presenza di mezzo M1 è migliorata quando anche le condizioni di adesione sono modulate. È necessario testare se l'uso di altre matrici superiori, anche se costose, come Matrigel possa migliorare ulteriormente questo protocollo. Le variazioni nella resa tra i singoli campioni potrebbero comportare che alcuni tessuti generino un numero di cellule inferiore. In questi casi, potrebbe essere preferibile raccogliere una lunghezza maggiore di tessuto cordonale che è >5 cm. In questo contesto, pochi rapporti hanno utilizzato 10 cm di tessuto cordonale per aumentare la resa delle uMSC. La maggior parte dei rapporti che descrivono l'isolamento delle uMSC dal tessuto cordonale hanno fatto uso di enzimi extracellulari che degradano la matrice per l'aumento del rilascio di cellule dallo stroma del cordone 3,5,7,8. L'uso di colture di espianto da parte di alcuni studi, tra cui questo rapporto, ha continuamente dimostrato un aumento della vitalità cellulare e della resa 6,9,10. Inoltre, l'assenza della necessità di eseguire lo smistamento cellulare per purificare le popolazioni cellulari, che è spesso incluso nella purificazione delle uMSC dal sangue del cordone ombelicale, aumenta il numero cellulare e l'integrità.
Limitazioni del metodo
Una limitazione chiave del metodo è il tempo necessario per la completa creazione di linee uMSC da singoli campioni di tessuto cordonale. In genere, sono necessarie 3 settimane per generare ogni linea uMSC utilizzando questo protocollo. Successivamente, sono necessarie 2 settimane per la completa differenziazione miogenica. Questa lunga durata dell'indagine può essere complicata in grandi coorti che esaminano i potenziali di differenziazione delle uMSC da diversi partecipanti, con l'intenzione di ottenere informazioni sull'ambiente intrauterino o prevedere i parametri metabolici degli organi della prole come la composizione corporea. Una seconda limitazione è l'eterogeneità all'interno della matrice tissutale cordonale, che potrebbe possedere differenze fenotipiche intrinseche tra i vari compartimenti uMSC e che potrebbe essere responsabile dei potenziali di differenziazione tra le diverse fonti. Ad esempio, gli uMSC del WJ mostrano un potenziale osteogenico inferiore rispetto agli uMSC derivati da CL11. Pertanto, questo metodo non descrive le differenze inerenti tra i diversi compartimenti all'interno del tessuto del cordone ombelicale stesso.
Importanza del metodo rispetto ai metodi esistenti
Utilizzando questo protocollo, siamo in grado di ottenere un conteggio cellulare di 1 × 104 a 1 × 106 uMSC da singoli campioni di tessuto cordonale. Queste linee uMSC possono essere utilizzate in modo affidabile per saggi per almeno 6-8 passaggi. Nonostante l'entità della variazione dei fenotipi cellulari tipici delle popolazioni umane, il tempo medio di raddoppio delle uMSC osservato nella nostra coorte di 15 donne dell'India settentrionale è stato inferiore a 2 giorni6. Un'analisi dei loro tassi proliferativi utilizzando l'incorporazione di 5-etinil-2′-deossiuridina (EdU) ha mostrato che almeno l'80% delle cellule aveva attraversato la fase S in un arco di 6 ore6. Inoltre, le uMSC dal tessuto del cordone ombelicale mostrano anche bassi tassi di senescenza, indicando la robustezza di questo metodo di isolamento6. In precedenza abbiamo confrontato il grado di induzione miogenica nelle uMSC utilizzando questo protocollo con quello utilizzato per indurre la miogenesi nelle cellule staminali pluripotenziali umane e murine 6,12. Abbiamo scoperto che questo protocollo è un induttore più potente della differenziazione miogenica rispetto ai protocolli esistenti.
Importanza del metodo e delle applicazioni
Le terapie cellulari e rigenerative di successo dipendono dalla vitalità e dalla resa cellulare, richiedendo un gran numero di cellule dai primi passaggi. Pertanto, questo metodo offre una comoda alternativa per le applicazioni cliniche. Il robusto protocollo di differenziazione miogenica fornito in questo rapporto e la caratterizzazione molecolare approfondita della progressione miogenica utilizzando questo protocollo nel nostro lavoro completano gli sforzi per ricapitolare la miogenesi fetale e possono essere utilizzati come modello per imitare l'ambiente intrauterino e riflettere il metabolismo postnatale.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Acknowledgments
Ringraziamo il signor Ojas Tikoo per il loro aiuto con le riprese e la produzione video. Riconosciamo anche l'aiuto ricevuto dal personale GARBH-Ini (Interdisciplinary Group on Advanced Research and Birth Outcome-DBT India), infermieri e funzionari di ricerca senior presso il Gurugram Civil Hospital e il Dr. Pallavi Kshetrapal per l'aiuto con la logistica. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni concesse a Suchitra Gopinath dal Dipartimento di Biotecnologie, India (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2411 | |
| Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline) | HiMedia | A001A-50mL | |
| Anti-GAPDH antibody | Sigma Aldrich | G8795 | |
| Anti-MyHC antibody (My32) | Novus Biologicals | NBP2-50401AF647 | |
| Anti-MyoD antibody (5.8A) | Novus Biologicals | NB100-56511 | |
| Anti-Myogenin antibody (Clone F5D) | Novus Biologicals | NBP2-34616AF594 | |
| Anti-Pax7 antibody | DSHB | DSHB-C1-576 | |
| APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 559869 | |
| Collagen Type 1 | Merck | C8919 | |
| D (+) Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Dexamethasone | SIGMA | D4902 | |
| FACSCanto II or FACSAria III | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum, qualified Brazil | GIBCO | 10270106 | not to be heat-inactivated |
| FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9 | BD Biosciences | 551146 | |
| FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2 | BD Biosciences | 557153 | |
| FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59 | BD Biosciences | 557508 | |
| FITC Mouse anti-human CD34 clone 581 | BD Biosciences | 555821 | |
| FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30 | BD Biosciences | 555482 | |
| FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10 | BD Biosciences | 560840 | |
| FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 555595 | |
| FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6 | BD Biosciences | 557348 | |
| FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555786 | |
| FlowJo software | BD Biosciences | ||
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1264 | |
| Horse serum | HiMedia | RM1239 | |
| Hydrocortisone | Merck | H4001 | |
| Laminin | Merck | L2020 | |
| MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides | Hyclone | SH30568.FS | Basal medium for uMSCs |
| PE Mouse anti-human CD105 clone 266 | BD Biosciences | 560839 | |
| PE Mouse anti-human CD44 clone 515 | BD Biosciences | 550989 | |
| PE Mouse anti-human CD49E clone llA1 | BD Biosciences | 555617 | |
| PE Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555787 | |
| PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2 | BD Biosciences | 561258 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4 | HiMedia | M1866 | |
| Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | HiMedia | TCL049-100mL |
References
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