Summary
Vi beskriver ett protokoll för isolering av mesenkymala stamceller från mänsklig navelsträngsvävnad och deras differentiering till skelettmuskelns härstamning.
Abstract
Att utforska den terapeutiska potentialen hos mesenkymala stamceller är beroende av enkel isolering, styrka mot differentiering och källans tillförlitlighet och robusthet. Vi beskriver här ett stegvis protokoll för isolering av mesenkymala stamceller från human navelsträngsvävnad (uMSC), deras immunofenotypning och förökning av sådana kulturer över flera passager. I denna procedur är livskraften hos uMSC: erna hög eftersom det inte finns någon enzymatisk matsmältning. Vidare säkerställer avlägsnandet av blodkärl, inklusive navelsträngsartärerna och venen, att det inte finns någon förorening av celler av endotelursprung. Med hjälp av flödescytometri är uMSC vid isolering CD45−CD34−, vilket indikerar en frånvaro av celler från den hematopoetiska härstamningen. Det är viktigt att de uttrycker viktiga ytmarkörer, CD105, CD90 och CD73. Vid etablering av kulturer beskriver detta dokument en effektiv metod för att inducera differentiering i dessa uMSC till skelettmuskelns härstamning. En detaljerad analys av myogen progression i differentierade uMSCs avslöjar att uMSCs uttrycker Pax7, en markör för myogena förfäder i de inledande stadierna av differentiering, följt av uttrycket av MyoD och Myf5, och slutligen en terminal differentieringsmarkör, myosin tung kedja (MyHC).
Introduction
Den mänskliga navelsträngen har krediterats för att ha en robust reservoar av mesenkymala stamceller, som för närvarande undersöks för regenerativa terapier på grund av deras robusta spridnings- och differentieringshastigheter, immunmodulerande egenskaper och förmåga att generera celler från alla de tre bakterielagren1. Navelsträngsvävnaden består av flera fack såsom navelsträngsblodet, navelvenens subendotel och Whartons gelé (WJ), som i sig omfattar tre otydliga regioner - den perivaskulära zonen, den intervaskulära zonen och sub-amnion eller sladdfodret (CL)2. Även om uMSC kan isoleras från alla dessa olika regioner och i stort sett uttrycka viktiga MSC-markörer, finns det ingen klarhet i om dessa fack innehåller samma population av uMSC eller visar skillnader i deras differentieringspotenser3. Därför kräver protokoll för isolering av uMSC en större precision i deras isoleringsläge och isoleringsregion, den robusta karakteriseringen av differentieringspotentialer och slutligen en jämförande analys från olika fack i sladden.
I detta sammanhang har få studier visat skillnader i uMSC proliferativa och differentierande potentialer mellan olika delar av sladden. Av dessa visade jämförande analyser mellan uMSCs isolerade från CL- och WJ-regionerna en större proliferativ potential i CL-härledda uMSCs 3,4. I en separat studie presterade WJ-härledda uMSCs bättre i proliferationsanalyser jämfört med perivaskulära celler (HUCPV)5. Vid undersökning av skillnader mellan navelsträngsblod-härledda uMSC och navelsträngsvävnadsderiverade uMSC: er utan vaskulär kontaminering rapporterades differentiellt uttryck av viktiga MSC-markörer mellan de två facken, liksom ökade proliferationshastigheter i navelsträngsvävnadsderiverade uMSCs6.
Av de flera studier som undersöker differentieringspotentialerna hos uMSC, främst i vävnader i mesodermlinjen, såsom osteogena, adipogena och kondrogena släktlinjer, har mycket få tillhandahållit detaljerade protokoll för myogen differentiering och efterföljande karakterisering, liksom jämförande analyser mellan olika sladdfack. I detta sammanhang har vi utvecklat ett robust muskeldifferentieringsprotokoll och observerat att navelsträngsvävnadsderiverade uMSCs uppvisar överlägsen myogen differentieringsförmåga jämfört med navelsträngsblod6. Här beskrivs ett stegvis protokoll för isolering av uMSC från hela navelsträngsvävnaden utan celler associerade med vaskulaturen, deras karakterisering och deras differentiering till den myogena härstamningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Användningen av navelsträngsvävnad i denna studie godkändes av Institutional Committee for Stem Cell Research (IC-SCR), Institutional Ethics Committee, Translational Health Science and Technology Institute (IEC-THSTI), Institutional Ethics Committee of Civil Hospital, Gurugram, Haryana och Institutional Biosafety Committee, THSTI. Mänskliga navelsträngsvävnadsprover skördades från terminsförlossningar vid födelsetiden. Informerat skriftligt samtycke erhölls från försökspersoner . Alla metoder utfördes i enlighet med relevanta riktlinjer och föreskrifter.
1. Isolering av MSC från navelsträngsvävnad
- Vid leverans, skär minst 5 cm sladd, helst närmare moderkakan, och sterilisera sladden genom att svabba den yttre ytan med 70% etanol. Överför biten av navelsträngsvävnaden sekventiellt från ett 50 ml uppsamlingsrör som innehåller fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till ett annat som innehåller detsamma. Transportera uppsamlingsröret med ämnets namn på is till laboratoriet inom 1 timme.
OBS: För en större studie kan det vara användbart att streckkoda proverna för att möjliggöra spårning under hela studien. Viktigt är att all personal som hanterar mänskliga vävnader bör erbjudas hela behandlingen av hepatit B-vaccinet. - I labbet slår du på UV i 25 minuter i BSL-2-huven för att sterilisera autoklaverade instrument och pipetter före användning.
- Överför sladdvävnadsbiten från uppsamlingsröret till en 10 cm2 vävnadsodlingsbehandlad skål innehållande PBS berikad med 5 g / L glukos, 50 μg / ml gentamicin, 2,5 μg / ml amfotericin B, 100 U / ml penicillin och 100 μg / ml streptomycin (schematisk i figur 1).
- Använd en skalpell och skiva sladdvävnaden vertikalt längs dess längdaxel för att erhålla två halvcylindriska bitar. På grund av sladdvridning och mucoidytan, stift ner vävnaden med ett par pincett som hålls i den andra handen.
- Observera nu navelartärerna och venen och ta bort blodkärlen genom att använda en skalpell för att skrapa bort dem i en riktning från ytan. Skölj strängvävnaden igen i PBS för att ta bort allt kvarvarande blod som är associerat med vävnaden. Se till att skrapningen är skonsam för att bevara integriteten hos celler i WJ som omger kärlen.
- Hacka varje hälft av sladdvävnaden i 0,5 cm3 stora fragment och placera fragmenten med den lysande ytan nedåt på skålen. Inkubera skålen kort i 10 minuter i en 37 °C fuktad kammare innehållande 5 % CO2.
- Efter inkubation, översvämma skålen som innehåller strängvävnadsbitarna med 20 ml medium innehållande MEM Alpha Modification utan L-glutamin, ribo- och deoxiribonukleosider, 15% fetalt bovint serum (inte värmeinaktiverat) och 50 μg / ml gentamycin. Tillsätt tillväxtmediet försiktigt längs sidorna för att förhindra att vävnadsutplanteringarna lossnar från sin orientering. Tillsätt överflödigt medium för att ta hänsyn till en bråkdel som kommer att sugas upp av vävnadsutplanteringarna under inkubation.
- Efter 3 dagars inkubation, tillsätt färskt medium till kulturerna. Se till att kulturerna är skyddade från stötar och rörelse av explantaterna medan du hanterar diskarna.
- Efter 1 vecka, ta bort vävnadsfragmenten individuellt med sterila pincett och kassera med lämpliga biofarliga påsar för bortskaffande. Behåll det befintliga mediet och tillsätt 10 ml färskt tillväxtmedium. Byt ut tillväxtmediet var 4: e dag tills enskilda kolonier når en sammanflöde på 70%.
OBS: Det är troligt att cellerna inte kommer att fördelas jämnt över hela skålen, eftersom det kommer att finnas enskilda proliferativa kolonier som måste övervakas för sammanflöde med tiden. I allmänhet, inom en månad, genererar en 10 cm2 skål tillräckligt med celler för att delas upp i en separat skål. - Skörda de vidhäftande cellerna med trypsin/ EDTA-lösning (1x 0,25% trypsin och 0,02% EDTA i Hanks Balanced Salt Solution [HBSS]). Centrifugera cellsuspensionen vid 470 × g i 5 minuter vid 25 °C och återsuspendera cellpelleten i tillväxtmedium.
2. Immunofenotypning och förökning av uMSCS
- Fortsätt till immunfenotypning när de vidhäftande cellerna har nått 50% -60% sammanflöde och är väl spridda. Utför inte MSC-marköranalys på helt konfluenta kulturer, eftersom detta tenderar att orsaka nedreglering av viktiga MSC-markörer.
- Efter trypsinisering fördela en cellsuspension på 1 × 106 celler/ml i FACS-rör (1 × 105 celler/rör) och färga med lämpliga fluoroforbundna antikroppar (alla 1:50 utspädning) i kombination: ostoppad; CD105 + CD90; CD105 + CD73; CD105; CD90; CD73; CD34 + CD45 (vanlig fluorofor); isotypkontroller för varje fluorofor. Registrera ett totalt antal händelser på minst 10 000 på flödescytometern för vidare analys.
OBS: Eftersom cellerna analyseras för varje ytmarkör separat krävs inte gating på cellundergrupper. - Förutom ovanstående markörer, bekräfta förekomsten av positiva och negativa ytmarkörer i uMSC-linjer skapade från enskilda navelsträngsvävnadsprover (tabell 1).
- Analysera de märkta cellerna med flödescytometri och bestäm procentandelen CD105 + CD90 + och CD105 + CD73 + celler . Analysera CD105+ och CD34−CD45− celler separat.
3. Differentiering av uMSC i skelettmuskulatur
- Täck vävnadsodlingsplattor med 0,01% kollagen och 20 μg / ml laminin i PBS. Täck dessa plattor i minst 4 timmar vid rumstemperatur.
- Platta uMSCs med en densitet av 10 000 celler/cm2 i tillväxtmedium.
- När cellerna är 70% konfluenta, aspirera tillväxtmediet och skölj kulturerna 2x med PBS. Tillsätt myogent differentieringsmedium (M1) bestående av DMEM + 5% hästserum + 0,1 μM dexametason + 50 μM hydrokortison till uMSC. För bestämning av kinetiken för myogen progression, tillsätt M1-medium varannan dag till kulturerna.
- För att bestämma kinetiken för myogen progression, analysera uMSCs för Pax7, MyoD, Myogenin och MyHC-uttryck vid 2 dagar, 4-5 dagar, 6-7 dagar respektive 10-14 dagar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Framgången för isolering av uMSC från navelsträngsvävnad är >95%, till skillnad från de dåliga framgångsgraderna från helsträngsblod. Vid framgångsrik isolering av uMSC visar FACS-analys att alla celler är CD34 −CD45−CD105+CD90+. Men i jämförande analys visar uMSC isolerade från navelsträngsblod heterogena populationer, där en andel celler visar CD34 + CD45 + CD105 + (~ 15%). Dessutom är dubbelpositiva CD105 + CD90 + färre i antal (~ 5%) (kompletterande figur S1). Detta resulterar i minskade nivåer av myogen differentiering bland uMSCs från navelsträngsblod, eftersom både CD105- och CD90-uttryck krävs för induktion av myogenes. uMSCs visar också uttrycket för de markörer som anges i tabell 1. Om det finns kontaminering av navelsträngsblod-härledda uMSC, kommer det också att finnas en närvaro av CD34 + CD45 + - celler. Detta resulterar i falska cellantal för plätering för myogen differentiering. En indikation på att >90% av cellerna är dubbelt positiva för CD105- och CD90-uttryck är att uMSC: erna inte har förbundit sig till någon mesodermal härstamning och fortsätter att förbli multipotenta, eftersom både CD105- och CD90-uttryck är nedreglerade vid differentiering. Det är absolut nödvändigt att använda flera markörer för bekräftelse av uMSC-fenotyper, eftersom det inte finns någon enda definitiv uMSC-markör. I denna analys utvärderade vi närvaron av alla markörer som anges i tabell 1 för var och en av de uMSC-linjer som fastställts i laboratoriet. Dessutom fastställde vi den dubbla positiva statusen för CD105 och CD90 (figur 2A), liksom för CD105 och CD73 (figur 2B), vilket säkerställde att uMSC: erna uttrycker flera nyckelmarkörer. Detta är nödvändigt för att undvika att förorena enstaka positiva celler som finns i antal mindre än 0,05%.
Figur 1: Schematisk som visar stegvis isolering och karakterisering av uMSC från navelsträngsvävnad. Förkortning: uMSCs = mesenkymala stamceller från mänsklig navelsträngsvävnad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: MSC-marköranalys i sladdvävnad-härledda uMSCs. (A) uMSCs visar uttrycket av CD105 och CD90 och uttrycker inte hematopoetiska markörer, CD34 och CD45. Representativa FACS-diagram med tre uMSC-linjer (UCT15, UCT18 och UCT26) visas (N = 16). Den översta raden med paneler visar celler i alla tre uMSC-linjerna i Q2-kvadranten positiv för CD105- och CD90-uttryck. Nedre raden med paneler visar celler i Q1-kvadranten positiv för CD105-uttryck och negativ för CD34- och CD45-uttryck. (B) uMSC visar uttrycket av MSC-markör, CD73 (N = 16). Förkortning: uMSCs = mesenkymala stamceller från mänsklig navelsträngsvävnad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| uMSC positiva markörer | uMSC negativa markörer |
| CD105 | CD34 |
| CD90 | CD45 |
| CD73 | CD106 |
| CD29 | HLA DR |
| CD44 | CD31 |
| HLA ABC | CD14 |
| CD49e | CD49e |
| CD54 | |
| CD13 |
Tabell 1: Förteckning över positiva och negativa markörer för uMSC. Förkortning: uMSCs = mesenkymala stamceller från mänsklig navelsträngsvävnad.
För differentiering av uMSC i den myogena härstamningen uttrycker uMSCs vanligtvis Pax7, en markör för prekursorceller inom de första 2 dagarna efter tillsatsen av M1, följt av MyoD inom de första 4 dagarna av M1-addition (Figur 3). Vid 6 dagars differentiering uttrycker celler Myogeninprotein, följt av uttrycket av Myosin tung kedja (MyHC) mellan 10 dagar och 14 dagar efter induktion av differentiering. Vi karakteriserade mer detaljerat kinetiken för myogent uttryck med hjälp av RNA-sekvensering, flödescytometri, immunocytokemi, RT-PCR och western blot-analys för att dokumentera det stegvisa uttrycket av myogena markörer, vilket bekräftar robustheten hos detta protokoll. Helgenom transkriptomisk sekvensering mellan odifferentierade uMSCs och uMSCs som differentierades till skelettmuskulatur avslöjade uppregleringen av 907 gener som svar på induktionen av myogen differentiering (Figur 4).
uMSCs odlades i M1-medium i 2 dagar, 4 dagar, 7 dagar och 10 dagar och bedömdes för (A) Pax7 efter 2 dagar, (B) MyoD efter 4 dagar, (C) Myogeninuttryck från olika uMSC-linjer, betecknat med T8, T12, T14 och T25 efter 7 dagar och (D) MyHC efter 10 dagar. Skalstaplar = (B, D) 50 μm. Förkortningar: uMSCs = mesenkymala stamceller från human navelsträngsvävnad; GAPDH = glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas; MyoD = myoblastbestämningsprotein 1; MyHC = myosin tung kedja; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; Mb = myoblast; MT = myotube. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Jämförande transkriptomisk profilering av uMSC härrörande från navelsträngsblod och navelsträngsvävnad differentierad till skelettmuskulatur. Värmekarta över normaliserade antal av 907 gener mellan kontroll uMSCs och uMSCs differentierade till skelettmuskulatur i 7 dagar från navelsträngsblod och navelsträngsvävnad. Venndiagram (vänster) visar ett större antal myogena gener uppreglerade i navelsträngsvävnadsderiverade uMSC jämfört med navelsträngsblod-härledda uMSC. Tabellen nedan visar de vanliga myogena generna uppreglerade i både navelsträngsvävnad och navelsträngsblod. Denna siffra är från Mishra et al.6. Förkortningar: 1, 2 = biologiska replikat; CB1,2 = myogena celler härledda från uMSCs av navelsträngsblod; CT1, 2 = myogena celler härledda från uMSC i navelsträngsvävnad; coB1,2 = kontrollera odifferentierade uMSCs från navelsträngsblod, coT1, 2 = kontrollera odifferentierade uMSC från navelsträngsvävnad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
För att genomföra en jämförande analys jämförde vi uMSCs isolerade från navelsträngsblod och navelsträngsvävnad. RNA-sekvenseringsdata avslöjade att det fanns fler myogena gener uppreglerade i uMSC från navelsträngsvävnadsderiverade myogena celler än från de som härrör från navelsträngsblod (figur 4). RNA-sekvenseringsdata som används för att stödja denna studie laddas upp till NCBI (SRA-anslutning är GSE147114). Kortfattat identifierade vävnadsspecifik transkriptomisk analys med hjälp av PANTHER GO-slim-databasen cytoskelettproteiner associerade med aktinbindning och sarkomermontering (TPM2, LDB3, PDLIM3, FHL1, NEXN, MYOM1) transportörer associerade med kontraktil funktion (RTN2, SLC19A2, ACHE, SCN1B, SLC19A2, JPH2, KCNJ12, ANKRD1), underhåll av muskelmassa ( FBXO32, TRIM16L, GHR), kalciumsignalering (FKBP5) och enzymatisk funktion (COX7A1, PDK4) (figur 4). Sammantaget visar dessa data att uMSC från navelsträngsvävnad representerar ett fack som visar robust myogen potential.
På grund av individuell variation mellan uMSC-linjer som kan uppstå från effektivitet isolerat, heterogenitet inom uMSC-facket, moderns ålder och moderns hälsotillstånd, inklusive hennes näringsnivåer, kan det finnas skillnader i spridningshastigheter och myogena potentialer mellan etablerade uMSC-linjer. Trots skillnader i uttryckets kinetik upprätthålls emellertid den övergripande trenden att öka myogeniciteten med det stegvisa uttrycket av myogena markörer.
Kompletterande figur S1: MSC-marköranalys i navelsträngsblod-härledda uMSC. uMSCs visar uttrycket av CD105 och hematopoetiska markörer, CD34 och CD45. Analys av CD105+ populationen visar att endast en liten del av dessa celler samuttrycker CD90 (N = 5). Förkortning: uMSCs = mesenkymala stamceller från mänsklig navelsträngsvävnad. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg
Ett kritiskt steg i detta protokoll är insamling av vävnad under aseptiska förhållanden, från leveranstidpunkten till upprätthållandet av sterila kulturer, under hela förökningstiden. Under sladduppsamling är det viktigt att sladden inte vidrör någon icke-steriliserad yta och svabbas externt med 70% etanol innan den samlas i rör som innehåller PBS kompletterat med antibiotika. Det är viktigt att begränsa tiden mellan sladduppsamling och bearbetning av vävnaden för uMSC-isolering. Om det finns behov av att transportera vävnad från insamlingsplatsen till laboratoriet, måste man se till att hålla vävnaden i antibiotikainnehållande buffertar och förvara den på is.
Ändringar och felsökning av metoden
Den viktigaste modifieringen i detta protokoll för att inducera myogen differentiering av uMSCs är beläggningen av rätter med 0,01% kollagen av typ 1 och 20 μg / ml laminin. Vi observerade att myogen progression i uMSC i närvaro av M1-medium förbättras när vidhäftningsförhållandena också moduleras. Huruvida användningen av andra överlägsna, om än dyra, matriser som Matrigel kan förbättra detta protokoll ytterligare måste testas. Variationer i utbyte mellan enskilda prover kan leda till att vissa vävnader genererar ett lägre cellantal. I sådana fall kan det vara att föredra att samla en större längd av sladdvävnad som är >5 cm. I detta sammanhang har få rapporter använt 10 cm navelsträngsvävnad för att öka utbytet av uMSC. Majoriteten av rapporterna som beskriver isoleringen av uMSC från navelsträngsvävnad har använt sig av extracellulära matrisnedbrytande enzymer för ökad frisättning av celler från sladdstroma 3,5,7,8. Användningen av explantkulturer av några studier, inklusive denna rapport, har kontinuerligt visat ökad cellulär livskraft och ger 6,9,10. Dessutom ökar frånvaron av behovet av att utföra cellsortering för att rena cellpopulationer, som ofta ingår i att rena uMSC från navelsträngsblod, cellulärt antal och integritet.
Metodens begränsningar
En viktig begränsning av metoden är den tid som krävs för fullständig etablering av uMSC-linjer från enskilda navelsträngsvävnadsprover. Vanligtvis krävs 3 veckor för att generera varje uMSC-linje med detta protokoll. Efter detta krävs 2 veckor för fullständig myogen differentiering. Denna förlängda undersökningstid kan vara besvärlig i stora kohorter som undersöker differentieringspotentialen hos uMSC från olika deltagare, med avsikt att få information om den intrauterina miljön eller förutsäga avkommans organmetaboliska parametrar såsom kroppssammansättning. En andra begränsning är heterogeniteten i navelsträngsvävnadsmatrisen, som kan ha inneboende fenotypiska skillnader mellan de olika uMSC-facken och som kan vara ansvarig för differentieringspotentialer mellan de olika källorna. Till exempel visar uMSC från WJ lägre osteogen potential jämfört med CL-härledda uMSCs11. Därför beskriver denna metod inte skillnaderna mellan olika fack i själva navelsträngsvävnaden.
Metodens betydelse med avseende på befintliga metoder
Med hjälp av detta protokoll kan vi få ett cellantal på 1 × 104 till 1 × 106 uMSC från enskilda navelsträngsvävnadsprover. Dessa uMSC-linjer kan användas på ett tillförlitligt sätt för analyser för minst 6-8 passager. Trots omfattningen av variationen i cellulära fenotyper som är typiska för mänskliga populationer var den genomsnittliga fördubblingstiden för uMSC som observerades i vår kohort av 15 kvinnor från norra Indien mindre än 2 dagar6. En analys av deras proliferativa hastigheter med användning av införlivandet av 5-etynyl-2′-deoxyuridin (EdU) visade att minst 80% av cellerna hade gått igenom S-fasen i ett spann av 6 h6. Dessutom visar uMSC från navelsträngsvävnad också låga åldrandehastigheter, vilket indikerar robustheten hos denna isoleringsmetod6. Vi jämförde tidigare graden av myogen induktion i uMSC med hjälp av detta protokoll med den som används för att inducera myogenes i humana och murina pluripotentiala stamceller 6,12. Vi fann att detta protokoll är en mer potent inducerare av myogen differentiering än befintliga protokoll.
Betydelsen av metoden och applikationerna
Framgångsrika cellulära och regenerativa terapier är beroende av cellulär livskraft och avkastning, vilket kräver ett stort antal celler från tidiga passager. Således erbjuder denna metod ett bekvämt alternativ för kliniska tillämpningar. Det robusta myogena differentieringsprotokollet som tillhandahålls i denna rapport och den djupgående molekylära karakteriseringen av myogen progression med hjälp av detta protokoll i vårt arbete kompletterar ansträngningarna att rekapitulera fostrets myogenes och kan användas som en modell för att efterlikna den intrauterina miljön och återspegla postnatal metabolism.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Ojas Tikoo för deras hjälp med filmning och videoproduktion. Vi erkänner också den hjälp som erhållits från GARBH-Ini (Interdisciplinary Group on Advanced Research and Birth Outcome-DBT India) personal, sjuksköterskor och högre forskningsansvariga vid Gurugram Civil Hospital och Dr. Pallavi Kshetrapal för hjälp med logistik. Detta arbete stöddes av bidrag till Suchitra Gopinath från Department of Biotechnology, Indien (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2411 | |
| Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline) | HiMedia | A001A-50mL | |
| Anti-GAPDH antibody | Sigma Aldrich | G8795 | |
| Anti-MyHC antibody (My32) | Novus Biologicals | NBP2-50401AF647 | |
| Anti-MyoD antibody (5.8A) | Novus Biologicals | NB100-56511 | |
| Anti-Myogenin antibody (Clone F5D) | Novus Biologicals | NBP2-34616AF594 | |
| Anti-Pax7 antibody | DSHB | DSHB-C1-576 | |
| APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 559869 | |
| Collagen Type 1 | Merck | C8919 | |
| D (+) Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Dexamethasone | SIGMA | D4902 | |
| FACSCanto II or FACSAria III | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum, qualified Brazil | GIBCO | 10270106 | not to be heat-inactivated |
| FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9 | BD Biosciences | 551146 | |
| FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2 | BD Biosciences | 557153 | |
| FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59 | BD Biosciences | 557508 | |
| FITC Mouse anti-human CD34 clone 581 | BD Biosciences | 555821 | |
| FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30 | BD Biosciences | 555482 | |
| FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10 | BD Biosciences | 560840 | |
| FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 555595 | |
| FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6 | BD Biosciences | 557348 | |
| FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555786 | |
| FlowJo software | BD Biosciences | ||
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1264 | |
| Horse serum | HiMedia | RM1239 | |
| Hydrocortisone | Merck | H4001 | |
| Laminin | Merck | L2020 | |
| MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides | Hyclone | SH30568.FS | Basal medium for uMSCs |
| PE Mouse anti-human CD105 clone 266 | BD Biosciences | 560839 | |
| PE Mouse anti-human CD44 clone 515 | BD Biosciences | 550989 | |
| PE Mouse anti-human CD49E clone llA1 | BD Biosciences | 555617 | |
| PE Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555787 | |
| PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2 | BD Biosciences | 561258 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4 | HiMedia | M1866 | |
| Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | HiMedia | TCL049-100mL |
References
- Kuroda, Y., et al. Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8639-8643 (2010).
- Troyer, D. L., Weiss, M. L. Wharton's jelly-derived cells are a primitive stromal cell population. Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).
- Karahuseyinoglu, S., et al. Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: In situ and in vitro surveys. Stem Cells. 25 (2), 319-331 (2007).
- Kita, K., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Jeschke, M. G. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane. Stem Cells and Development. 19 (4), 491-502 (2010).
- Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: A source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
- Mishra, S., et al. Umbilical cord tissue is a robust source for mesenchymal stem cells with enhanced myogenic differentiation potential compared to cord blood. Scientific Reports. 10 (1), 18978 (2020).
- Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
- Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's Jelly of umbilical cord. Methods in Cell Biology. 86, 101-119 (2008).
- Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 24 (2), 462-471 (2006).
- Yoon, J. H., et al. Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly. BioMed Research International. 2013, 428726 (2013).
- Ishige, I., et al. Comparison of mesenchymal stem cells derived from arterial, venous, and Wharton's jelly explants of human umbilical cord. International Journal of Hematology. 90 (2), 261-269 (2009).
- Chal, J., et al. Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy. Nature Biotechnology. 33 (9), 962-969 (2015).
