मानव गर्भनाल ऊतक से मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं की पीढ़ी और कंकाल की मांसपेशी वंश में उनका भेदभाव
Summary
हम मानव गर्भनाल ऊतक से मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं के अलगाव और कंकाल की मांसपेशी वंश में उनके भेदभाव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
Abstract
मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं की चिकित्सीय क्षमता की खोज अलगाव की आसानी, भेदभाव की ओर शक्ति और स्रोत की विश्वसनीयता और मजबूती पर आकस्मिक है। हम यहां मानव गर्भनाल ऊतक (यूएमएससी), उनके इम्यूनोफेनोटाइपिंग और कई मार्गों पर ऐसी संस्कृतियों के प्रसार से मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक चरणबद्ध प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इस प्रक्रिया में, यूएमएससी की व्यवहार्यता अधिक है क्योंकि कोई एंजाइमी पाचन नहीं है। इसके अलावा, गर्भनाल धमनियों और नस सहित रक्त वाहिकाओं को हटाने से यह सुनिश्चित होता है कि एंडोथेलियल मूल की कोशिकाओं का कोई संदूषण न हो। प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करते हुए, अलगाव पर यूएमएससी सीडी 45−सीडी 34−, हेमटोपोइएटिक वंश से कोशिकाओं की अनुपस्थिति का संकेत देता है। महत्वपूर्ण रूप से, वे कुंजी सतह मार्कर, सीडी 105, सीडी 90 और सीडी 73 व्यक्त करते हैं। संस्कृतियों की स्थापना पर, यह पत्र कंकाल की मांसपेशी वंश में इन यूएमएससी में भेदभाव को प्रेरित करने के लिए एक कुशल विधि का वर्णन करता है। विभेदित यूएमएससी में मायोजेनिक प्रगति के एक विस्तृत विश्लेषण से पता चलता है कि यूएमएससी पैक्स 7 को व्यक्त करते हैं, भेदभाव के प्रारंभिक चरणों में मायोजेनिक पूर्वजों के लिए एक मार्कर, इसके बाद मायोडी और मायफ 5 की अभिव्यक्ति, और अंत में, एक टर्मिनल भेदभाव मार्कर, मायोसिन भारी श्रृंखला (एमवाईएचसी)।
Introduction
मानव गर्भनाल को मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं का एक मजबूत भंडार रखने का श्रेय दिया गया है, जो वर्तमान में उनके मजबूत प्रसार और भेदभाव दर, इम्यूनोमॉड्यूलेटरी गुणों और सभी तीन रोगाणु परतों से कोशिकाओं को उत्पन्न करने की क्षमता के कारण पुनर्योजीउपचारों के लिए खोजे जा रहे हैं। गर्भनाल ऊतक में गर्भनाल रक्त, गर्भनाल शिरा सबेंडोथेलियम और व्हार्टन की जेली (डब्ल्यूजे) जैसे कई डिब्बे होते हैं, जो अपने आप में तीन अस्पष्ट क्षेत्रों को शामिल करते हैं- पेरिवास्कुलर ज़ोन, इंटरवैस्कुलर ज़ोन, और सब-एमनियन या कॉर्ड लाइनिंग (सीएल)2। जबकि यूएमएससी को इन सभी अलग-अलग क्षेत्रों से अलग किया जा सकता है और मोटे तौर पर प्रमुख एमएससी मार्करों को व्यक्त किया जा सकता है, इस बात पर कोई स्पष्टता नहीं है कि क्या इन डिब्बों में यूएमएससी की समान आबादी है या उनकी भेदभाव शक्ति में अंतर प्रदर्शित करता है3. इसलिए, यूएमएससी के अलगाव के लिए प्रोटोकॉल को उनके मोड और अलगाव के क्षेत्र में अधिक परिशुद्धता की आवश्यकता होती है, भेदभाव क्षमता का मजबूत लक्षण वर्णन, और अंत में, कॉर्ड के विभिन्न डिब्बों से तुलनात्मक विश्लेषण।
इस संदर्भ में, कुछ अध्ययनों ने कॉर्ड के विभिन्न हिस्सों के बीच यूएमएससी प्रोलिफेरेटिव और विभेदक क्षमता में अंतर का प्रदर्शन किया है। इनमें से, सीएल और डब्ल्यूजे क्षेत्रों से पृथक यूएमएससी के बीच तुलनात्मक विश्लेषण से सीएल-व्युत्पन्न यूएमएससी 3,4 में अधिक प्रसार क्षमता का पता चला। एक अलग अध्ययन में, डब्ल्यूजे-व्युत्पन्न यूएमएससी ने पेरिवास्कुलर कोशिकाओं (एचयूसीपीवी) 5 की तुलना में प्रसार परख में बेहतर प्रदर्शन किया। संवहनी संदूषण से रहित गर्भनाल रक्त-व्युत्पन्न यूएमएससी और कॉर्ड ऊतक-व्युत्पन्न यूएमएससी के बीच अंतर की जांच करने में, दो डिब्बों के बीच प्रमुख एमएससी मार्करों की अंतर अभिव्यक्ति की सूचना दी गई थी, साथ ही कॉर्ड ऊतक-व्युत्पन्न यूएमएससी6 में प्रसार दर में वृद्धि हुई थी।
मुख्य रूप से ओस्टियोजेनिक, एडिपोजेनिक और चोंड्रोजेनिक वंशावली जैसे मेसोडर्म वंश के ऊतकों में यूएमएससी की भेदभाव क्षमता की जांच करने वाले कई अध्ययनों में से, बहुत कम ने मायोजेनिक भेदभाव और बाद के लक्षण वर्णन के साथ-साथ विभिन्न कॉर्ड डिब्बों के बीच तुलनात्मक विश्लेषण के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किए हैं। इस संदर्भ में, हमने एक मजबूत मांसपेशी भेदभाव प्रोटोकॉल विकसित किया है और देखा है कि कॉर्ड ऊतक-व्युत्पन्न यूएमएससी कॉर्ड रक्त6 की तुलना में बेहतर मायोजेनिक भेदभाव क्षमताओं को प्रदर्शित करते हैं। यहां, वास्कुलचर, उनके लक्षण वर्णन और मायोजेनिक वंश में उनके भेदभाव से जुड़ी कोशिकाओं से रहित पूरे कॉर्ड ऊतक से यूएमएससी के अलगाव के लिए एक चरणबद्ध प्रोटोकॉल विस्तृत है।
Protocol
Representative Results
Discussion
महत्वपूर्ण कदम
इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम सड़न रोकनेवाला शर्तों के तहत ऊतक का संग्रह है, प्रसव के समय से बाँझ संस्कृतियों के रखरखाव के लिए, प्रसार की पूरी अवधि के लिए। कॉर्ड संग्रह के दौ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम फिल्मांकन और वीडियो निर्माण में उनकी मदद के लिए श्री ओजस टिक्कू को धन्यवाद देते हैं। हम गुरुग्राम सिविल अस्पताल के कर्मचारियों, नर्सों और वरिष्ठ अनुसंधान अधिकारियों और लॉजिस्टिक्स के साथ मदद के लिए डॉ पल्लवी क्षेत्रपाल से प्राप्त मदद को भी स्वीकार करते हैं। इस कार्य को जैव प्रौद्योगिकी विभाग, भारत (बीटी/09/आईवाईबीए/2015) से सुचित्रा गोपीनाथ को दिए गए अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था; बीटी/पीआर29599/पीएफएन/20/1393/2018)।
Materials
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2411 | |
| Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline) | HiMedia | A001A-50mL | |
| Anti-GAPDH antibody | Sigma Aldrich | G8795 | |
| Anti-MyHC antibody (My32) | Novus Biologicals | NBP2-50401AF647 | |
| Anti-MyoD antibody (5.8A) | Novus Biologicals | NB100-56511 | |
| Anti-Myogenin antibody (Clone F5D) | Novus Biologicals | NBP2-34616AF594 | |
| Anti-Pax7 antibody | DSHB | DSHB-C1-576 | |
| APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 559869 | |
| Collagen Type 1 | Merck | C8919 | |
| D (+) Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Dexamethasone | SIGMA | D4902 | |
| FACSCanto II or FACSAria III | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum, qualified Brazil | GIBCO | 10270106 | not to be heat-inactivated |
| FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9 | BD Biosciences | 551146 | |
| FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2 | BD Biosciences | 557153 | |
| FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59 | BD Biosciences | 557508 | |
| FITC Mouse anti-human CD34 clone 581 | BD Biosciences | 555821 | |
| FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30 | BD Biosciences | 555482 | |
| FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10 | BD Biosciences | 560840 | |
| FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 555595 | |
| FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6 | BD Biosciences | 557348 | |
| FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555786 | |
| FlowJo software | BD Biosciences | ||
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1264 | |
| Horse serum | HiMedia | RM1239 | |
| Hydrocortisone | Merck | H4001 | |
| Laminin | Merck | L2020 | |
| MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides | Hyclone | SH30568.FS | Basal medium for uMSCs |
| PE Mouse anti-human CD105 clone 266 | BD Biosciences | 560839 | |
| PE Mouse anti-human CD44 clone 515 | BD Biosciences | 550989 | |
| PE Mouse anti-human CD49E clone llA1 | BD Biosciences | 555617 | |
| PE Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555787 | |
| PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2 | BD Biosciences | 561258 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4 | HiMedia | M1866 | |
| Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | HiMedia | TCL049-100mL |
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