Summary
אנו מתארים פרוטוקול לבידוד תאי גזע מזנכימליים מרקמת חבל הטבור האנושית והתמיינותם לשושלת שרירי השלד.
Abstract
חקר הפוטנציאל הטיפולי של תאי גזע מזנכימליים מותנה בקלות הבידוד, בעוצמה לקראת התמיינות ובאמינות ובחוסן של המקור. אנו מתארים כאן פרוטוקול מדורג לבידוד תאי גזע מזנכימליים מרקמת חבל הטבור האנושית (uMSCs), האימונופנוטיפ שלהם והתפשטות תרביות כאלה על פני מספר מעברים. בהליך זה, הכדאיות של uMSCs היא גבוהה כי אין עיכול אנזימטי. יתר על כן, הסרת כלי הדם, כולל עורקי חבל הטבור והווריד, מבטיחה כי אין זיהום של תאים ממוצא אנדותל. באמצעות ציטומטריה של זרימה, uMSCs בעת הבידוד הם CD45−CD34−, מה שמעיד על היעדר תאים מהשושלת ההמטופוייטית. חשוב לציין שהם מבטאים סמני פני שטח מרכזיים, CD105, CD90 ו-CD73. עם הקמתן של תרביות, מאמר זה מתאר שיטה יעילה להשראת התמיינות ב-uMSCs אלה לשושלת שרירי השלד. ניתוח מפורט של התקדמות מיוגנית ב- uMSCs מובחנים מגלה כי uMSCs מבטאים את Pax7, סמן לאבות מיוגניים בשלבים הראשונים של התמיינות, ואחריו הביטוי של MyoD ו- Myf5, ולבסוף, סמן התמיינות מסוף, שרשרת כבדה של מיוזין (MyHC).
Introduction
חבל הטבור האנושי נזקף לזכותו כבעל מאגר חזק של תאי גזע מזנכימליים, הנחקרים כיום לטיפולים רגנרטיביים בשל שיעורי ההתרבות וההתמיינות החזקים שלהם, התכונות האימונומודולטוריות והיכולת לייצר תאים מכל שלוש שכבות הנבט1. רקמת חבל הטבור מורכבת ממספר תאים כגון דם טבורי, תת-האנדותל של וריד הטבור, והג'לי של וורטון (WJ), אשר כשלעצמו מקיף שלושה אזורים לא ברורים - האזור הפריווסקולרי, האזור הבין-וסקולרי, ותת-האניון או בטנת החבל (CL)2. בעוד שניתן לבודד uMSCs מכל האזורים השונים הללו ולבטא באופן רחב סמני MSC מרכזיים, אין בהירות אם תאים אלה מכילים את אותה אוכלוסייה של uMSCs או מציגים הבדלים בעוצמת ההבחנה שלהם3. לפיכך, פרוטוקולים לבידוד של uMSCs דורשים דיוק רב יותר במצבם ובאזור הבידוד שלהם, אפיון חזק של פוטנציאל ההבחנה, ולבסוף, ניתוח השוואתי מתאים שונים של הכבל.
בהקשר זה, מעטים המחקרים שהדגימו הבדלים בפוטנציאלים המתרבים וההבחנתיים של uMSC בין חלקים שונים של הכבל. מתוכם, ניתוחים השוואתיים בין uMSCs שבודדו מאזורי CL ו-WJ חשפו פוטנציאל התפשטות גדול יותר ב-uMSCs שמקורם ב-CL 3,4. במחקר נפרד, uMSCs שמקורם ב-WJ הציגו ביצועים טובים יותר במבחני התפשטות בהשוואה לתאים פריווסקולריים (HUCPV)5. בבחינת ההבדלים בין uMSCs שמקורם בדם טבורי לבין uMSCs שמקורם ברקמת כבל ללא זיהום כלי דם, דווח על ביטוי דיפרנציאלי של סמני MSC מרכזיים בין שני התאים, כמו גם על שיעורי שגשוג מוגברים ב-uMSCs6 שמקורם ברקמת כבל.
מבין מספר המחקרים שבחנו את פוטנציאל ההתמיינות של uMSCs בעיקר לרקמות של שושלת המזודרם כגון שושלות אוסטאוגניות, אדיפוגניות וכונדרוגניות, מעטים מאוד סיפקו פרוטוקולים מפורטים להבחנה מיוגנית ולאפיון שלאחר מכן, כמו גם ניתוחים השוואתיים בין תאי חוטים שונים. בהקשר זה, פיתחנו פרוטוקול התמיינות שרירים חזק וראינו כי uMSCs שמקורם ברקמת כבל מפגינים יכולות התמיינות מיוגניות מעולות בהשוואה לדם טבורי6. כאן מפורט פרוטוקול שלבים לבידוד של uMSCs מכל רקמת הכבל נטולת תאים הקשורים לכלי הדם, לאפיון שלהם ולהתמיינותם לשושלת המיוגנית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
השימוש ברקמת חבל הטבור במחקר זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לחקר תאי גזע (IC-SCR), ועדת האתיקה המוסדית, המכון למדע וטכנולוגיה של בריאות תרגומית (IEC-THSTI), ועדת האתיקה המוסדית של בית החולים האזרחי, גורוגרם, הריאנה, והוועדה לביו-בטיחות מוסדית, THSTI. דגימות רקמת חבלים אנושיות נקטפו מלידה בזמן הלידה. הסכמה מדעת בכתב התקבלה מנושאים . כל השיטות בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות.
1. בידוד של MSCs מרקמת כבל
- בזמן הלידה, חותכים לפחות 5 ס"מ של חוט, רצוי קרוב יותר לשליה, ומעקרים את הכבל על ידי גלישת המשטח החיצוני עם 70% אתנול. העבר את פיסת רקמת החוט ברצף מצינור איסוף אחד של 50 מ"ל המכיל מלח בעל מאגר פוספט (PBS) לצינור אחר המכיל את אותו הדבר. העבירו את צינור האיסוף הנושא את שם הנבדק על הקרח למעבדה תוך שעה אחת.
הערה: עבור מחקר גדול יותר, ייתכן שיהיה זה שימושי לברקוד את הדגימות כדי לאפשר את המעקב אחריהן לאורך כל המחקר. חשוב לציין, יש להציע לכל אנשי הצוות המטפלים ברקמות אנושיות את המשטר המלא של החיסון נגד הפטיטיס B. - במעבדה, הפעילו את ה-UV למשך 25 דקות במכסה המנוע BSL-2 כדי לעקר מכשירים אוטוקלבים ופיפטות לפני השימוש.
- העבר את פיסת רקמת החוט מצינור האיסוף לתבשיל של 10 ס"משטופל בתרבית רקמה בגודל 10 ס"מ המכיל PBS מועשר ב-5 גרם/ל' גלוקוז, גנטמיצין של 50 מיקרוגרם/מ"ל, 2.5 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B, 100 פניצילין U/mL ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין (סכמטי באיור 1).
- באמצעות אזמל, פורסים את רקמת החוט אנכית לאורך ציר האורך שלה כדי לקבל שני חלקים גליליים למחצה. בשל פיתול הכבל ומשטח הריריות, הצמד את הרקמה עם זוג מלקחיים המוחזקים ביד השנייה.
- בשלב זה, התבונן בעורקי הטבור ובווריד והסר את כלי הדם על ידי שימוש באזמל כדי לגרד אותם בכיוון אחד מפני השטח. יש לשטוף שוב את רקמת החוט ב-PBS כדי להסיר את כל שאריות הדם הקשורות לרקמה. ודא שהגירוד עדין כדי לשמור על שלמות התאים ב- WJ המקיף את כלי השיט.
- טחנו כל מחצית של רקמת החוט לרסיסים בגודל 0.5 ס"מבגודל 3 והניחו את השברים כאשר המשטח הזוהר פונה כלפי מטה על המנה. דגירו את המנה לזמן קצר למשך 10 דקות בתא לח של 37 מעלות צלזיוס המכיל 5% CO2.
- לאחר הדגירה, הציפו את המנה המכילה את חלקי רקמת החוטים ב-20 מ"ל של מדיום המכיל MEM Alpha Modification ללא L-גלוטמין, ריבו-דאוקסיריבונוקלאוזידים, 15% סרום בקר עוברי (לא מומת בחום) ו-50 מיקרוגרם/מ"ל ג'נטמיצין. מוסיפים את מדיום הגדילה בעדינות לאורך הצדדים כדי למנוע את ניתוק הרקמה מהכיוון שלהם. הוסיפו עודף מדיום כדי להסביר שבר שייקלט על ידי גולשי הרקמה במהלך הדגירה.
- לאחר 3 ימי דגירה, הוסיפו מדיום רענן לתרבויות. יש לוודא שהתרביות מוגנות מפני זעזועים ותנועתם של המוציאים תוך כדי טיפול בכלים.
- לאחר שבוע אחד, הסר את שברי הרקמה בנפרד באמצעות מלקחיים סטריליים והשלך באמצעות שקיות ביוהאזרד מתאימות לסילוק. לשמור על המדיום הקיים ולהוסיף 10 מ"ל של מדיום צמיחה טרי. החלף את מדיום הצמיחה כל 4 ימים עד שמושבות בודדות מגיעות למפגש של 70%.
הערה: סביר להניח שהתאים לא יתפזרו באופן אחיד לאורך כל המנה, מכיוון שיהיו מושבות שגשוג בודדות שיש לעקוב אחריהן לצורך מפגש עם הזמן. בדרך כלל, תוך חודש, מנה של 10 ס"מ2 מייצרת מספיק תאים כדי להתפצל למנה נפרדת. - קציר את התאים הדבקים באמצעות תמיסת טריפסין/EDTA (1x 0.25% טריפסין ו-0.02% EDTA בתמיסת מלח מאוזנת של הנקס [HBSS]). צנטריפוגה של תרחיף התא ב-470 × גרם למשך 5 דקות ב-25 מעלות צלזיוס והחזירו את גלולת התא במדיום הגדילה.
2. אימונופנוטיפינג והתפשטות של uMSCS
- המשך לאימונופנוטיפ לאחר שהתאים הדבקים הגיעו למפגש של 50%-60% והם מתפשטים היטב. אל תבצע ניתוח סמני MSC על תרבויות מפגש מלאות, מכיוון שהדבר נוטה לגרום להפחתת ויסות של סמני MSC מרכזיים.
- לאחר טריפסיניזציה, הפיצו תרחיף תא של 1 × 106 תאים/מ"ל בצינורות FACS (1 × 105 תאים/צינור) וכתם עם נוגדנים מתאימים המקושרים לפלואורופור (כולם דילול 1:50) בשילוב: לא מוכתם; CD105 + CD90; CD105 + CD73; CD105; CD90; CD73; CD34 + CD45 (פלואורופור נפוץ); בקרת איזוטיפ עבור כל פלואורופור. רשום מספר כולל של אירועים של לפחות 10,000 על ציטומטר הזרימה לניתוח נוסף.
הערה: מאחר שהתאים מנותחים עבור כל סמן פני שטח בנפרד, אין צורך בגימור על תת-קבוצות של תאים. - בנוסף לסמנים לעיל, אשר את נוכחותם של סמני פני שטח חיוביים ושליליים בקווי uMSC שנוצרו מדגימות רקמת חוט בודדת (טבלה 1).
- נתח את התאים המסומנים לפי ציטומטריית זרימה וקבע את אחוז תאי CD105+CD90+ ו-CD105+CD73+ . נתחו את תאי CD105+ ו-CD34−CD45− בנפרד.
3. הבחנה של uMSCs לשרירי השלד
- ציפו צלחות תרבית רקמה ב-0.01% קולגן ו-20 מיקרוגרם/מ"ל למינין ב-PBS. מצפים צלחות אלה במשך 4 שעות לפחות בטמפרטורת החדר.
- UMSCs של צלחת בצפיפות של 10,000 תאים/ס"מ2 במדיום גדילה.
- כאשר התאים נפגשים ב-70%, שאפו את מדיום הגדילה ושטפו את התרביות פי 2 עם PBS. הוסף את מדיום ההבחנה המיוגני (M1) המורכב מ- DMEM + 5% סרום סוסים + 0.1 μM דקסמתזון + 50 μM הידרוקורטיזון ל- uMSCs. לקביעת הקינטיקה של ההתקדמות המיוגנית, הוסיפו מדיום M1 אחת ליומיים לתרבויות.
- כדי לקבוע את הקינטיקה של התקדמות מיוגנית, נתח uMSCs עבור Pax7, MyoD, Myogenin ו- MyHC ביטוי לאחר יומיים, 4-5 ימים, 6-7 ימים ו- 10-14 ימים, בהתאמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ההצלחה של בידוד של uMSCs מרקמת כבל היא >95%, בניגוד לשיעורי ההצלחה הגרועים של דם טבורי שלם. לאחר בידוד מוצלח של uMSCs, ניתוח FACS מגלה כי כל התאים הם CD34−CD45−CD105+CD90+. עם זאת, בניתוח השוואתי, uMSCs המבודדים מדם טבורי מציגים אוכלוסיות הטרוגניות, כאשר חלק מהתאים מראים CD34+CD45+CD105+ (~15%). בנוסף, CD105+CD90+ חיובי כפול הם פחות במספרם (~5%) (איור משלים S1). התוצאה היא רמות מופחתות של התמיינות מיוגנית בין uMSCs מדם טבורי, מכיוון שגם ביטוי CD105 וגם ביטוי CD90 נדרשים להשראת מיוגנטיקה. uMSCs מציגים גם את הביטוי של הסמנים המפורטים בטבלה 1. אם יש זיהום של uMSCs שמקורם בדם טבורי, תהיה גם נוכחות של תאי CD34+CD45+ . התוצאה היא ספירת תאים שגויה לציפוי עבור התמיינות מיוגנית. אינדיקציה לכך ש->90% מהתאים הם חיוביים כפולים לביטוי CD105 ו-CD90 היא שה-uMSCs לא התחייבו לשום שושלת מזודרמלית וממשיכים להישאר רב-תכליתיים, מכיוון שגם ביטוי CD105 וגם ביטוי CD90 מווסתים עם התמיינות. זה הכרחי להשתמש בסמנים מרובים לאישור של פנוטיפים uMSC, מכיוון שאין סמן uMSC סופי יחיד. בניתוח זה הערכנו את נוכחותם של כל הסמנים המפורטים בטבלה 1 עבור כל אחד מקווי uMSC שנקבעו במעבדה. בנוסף, קבענו את המצב החיובי הכפול של CD105 ו-CD90 (איור 2A), כמו גם של CD105 ו-CD73 (איור 2B), כדי להבטיח שה-uMSCs מבטאים סמני מפתח מרובים. זה הכרחי כדי למנוע זיהום תאים חיוביים יחיד הקיימים במספרים של פחות מ 0.05%.
איור 1: סכמטי המציג את הבידוד והאפיון של uMSCs מדרגה מרקמת כבל. קיצור: uMSCs = תאי גזע מזנכימליים מרקמת חבל הטבור האנושית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: ניתוח סמני MSC ב-uMSCs שמקורם ברקמת כבל. (A) uMSCs מציגים את הביטוי של CD105 ו-CD90 ואינם מבטאים סמנים המטופוייטיים, CD34 ו-CD45. מוצגות תוכניות FACS מייצגות של שלושה קווי uMSC (UCT15, UCT18 ו- UCT26) (N = 16). השורה העליונה של הפאנלים מציגה תאים בכל שלושת קווי uMSC ברביע Q2 חיובי עבור ביטוי CD105 ו- CD90. שורה תחתונה של חלוניות מציגה תאים ברביע Q1 חיוביים עבור ביטוי CD105 ושליליים עבור ביטוי CD34 ו- CD45. (B) uMSCs מציגים את הביטוי של סמן MSC, CD73 (N = 16). קיצור: uMSCs = תאי גזע מזנכימליים מרקמת חבל הטבור האנושית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| סמנים חיוביים של uMSC | סמנים שליליים של uMSC |
| CD105 | CD34 |
| CD90 | CD45 |
| תקליטור73 | CD106 |
| תקליטור29 | HLA DR |
| CD44 | CD31 |
| HLA ABC | תקליטור14 |
| CD49e | CD49e |
| CD54 | |
| תקליטור13 |
טבלה 1: רשימת סמנים חיוביים ושליליים עבור uMSCs. קיצור: uMSCs = תאי גזע מזנכימליים מרקמת חבל הטבור האנושית.
לצורך התמיינות של uMSCs לשושלת המיוגנית, uMSCs מבטאים בדרך כלל את Pax7, סמן לתאים מבשרים ביומיים הראשונים להוספת M1, ואחריו MyoD במהלך 4 הימים הראשונים של הוספת M1 (איור 3). לאחר 6 ימים של התמיינות, תאים מבטאים חלבון מיוגנין, ואחריו ביטוי של שרשרת כבדה של מיוזין (MyHC) בין 10 ימים ל -14 ימים של אינדוקציה של התמיינות. אפיינו ביתר פירוט את הקינטיקה של ביטוי מיוגני באמצעות ריצוף RNA, ציטומטריית זרימה, אימונוציטוכימיה, RT-PCR וניתוח כתמים מערביים כדי לתעד את הביטוי הבימתי של סמנים מיוגניים, המאשרים את עמידותו של פרוטוקול זה. ריצוף תעתיק של גנום שלם בין uMSCs לא מובחנים לבין uMSCs שהובחנו לשרירי שלד חשף את הוויסות של 907 גנים בתגובה להשראת התמיינות מיוגנית (איור 4).
איור 3: הבחנה של uMSCs לשריר השלד. uMSCs עברו תרבית במדיום M1 במשך יומיים, 4 ימים, 7 ימים ו-10 ימים והוערכו עבור (A) Pax7 לאחר יומיים, (B) MyoD לאחר 4 ימים, (C) ביטוי מיוגנין מקווי uMSC שונים, המסומן על ידי T8, T12, T14 ו-T25 לאחר 7 ימים, ו-(D) MyHC לאחר 10 ימים. סרגלי קנה מידה = (B, D) 50 מיקרומטר. קיצורים: uMSCs = תאי גזע מזנכימליים מרקמת חבל הטבור האנושית; GAPDH = גליצרלדהיד 3-פוספט דהידרוגנאז; MyoD = חלבון קביעת מיובלסט 1; MyHC = שרשרת כבדה של מיוזין; DAPI = 4',6-diamidino-2-פנילינדול; Mb = מיובלסט; MT = מיוטוב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: פרופיל תעתיק השוואתי של uMSCs שמקורם בדם טבורי וברקמת טבורי המובחנים לשרירי השלד. מפת חום של ספירות מנורמלות של 907 גנים בין uMSCs לבקרה לבין uMSCs מובחנים לשרירי השלד במשך 7 ימים מדם טבורי ורקמות טבוריות. דיאגרמת Venn (משמאל) מראה מספר גדול יותר של גנים מיוגניים המווסתים ב-uMSCs שמקורם ברקמת כבל בהשוואה ל-uMSCs שמקורם בדם טבורי. הטבלה שלהלן מציגה את הגנים המיוגניים הנפוצים המווסתים הן ברקמת כבל והן בדם טבורי. נתון זה לקוח מתוך מישרה ואח' 6. קיצורים: 1, 2 = שכפולים ביולוגיים; CB1,2 = תאים מיוגניים המופקים מ- uMSCs של דם טבורי; CT1, 2 = תאים מיוגניים המופקים מ- uMSCs של רקמת כבל; coB1,2 = שליטה uMSCs לא מובחנים מדם טבורי; coT1, 2 = שליטה uMSCs לא מובחנים מרקמת כבל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
לצורך ביצוע ניתוח השוואתי, השווינו בין uMSCs שבודדו מדם טבורי ומרקמות טבוריות. נתוני ריצוף RNA גילו כי היו יותר גנים מיוגניים מווסתים ב-uMSCs מתאים מיוגניים שמקורם ברקמת כבל מאשר אלה שמקורם בדם טבורי (איור 4). נתוני ריצוף הרנ"א המשמשים לתמיכה במחקר זה מועלים ל-NCBI (הצטרפות SRA היא GSE147114). בקצרה, ניתוח תעתיק ספציפי לרקמות באמצעות מסד הנתונים הדק של PANTHER GO זיהה חלבוני שלד ציטוסקטליים הקשורים לקשירת אקטין ולהרכבת סרקומורים (TPM2, LDB3, PDLIM3, FHL1, NEXN, MYOM1) טרנספורטרים הקשורים לתפקוד התכווצות (RTN2, SLC19A2, ACHE, SCN1B, SLC19A2, JPH2, KCNJ12, ANKRD1), תחזוקת מסת שריר ( FBXO32, TRIM16L, GHR), איתות סידן (FKBP5) ותפקוד אנזימטי (COX7A1, PDK4) (איור 4). בסך הכל, נתונים אלה מראים כי uMSCs שמקורם ברקמת כבל מייצגים תא המציג פוטנציאל מיוגני חזק.
בשל שונות אינדיבידואלית בין קווי uMSC שעשויה לנבוע מיעילות בבידוד, הטרוגניות בתוך תא uMSC, גיל האם ומצבה הבריאותי של האם, כולל רמות החומרים המזינים שלה, עשויים להיות הבדלים בשיעורי ההתפשטות ובפוטנציאל המיוגני בין קווי uMSC מבוססים. עם זאת, למרות ההבדלים בקינטיקה של הביטוי, המגמה הכוללת של הגברת המיוגניות עם הביטוי הבימתי של סמנים מיוגניים נשמרת.
איור משלים S1: ניתוח סמני MSC ב-uMSCs שמקורם בדם טבורי. uMSCs מציגים את הביטוי של סמנים CD105 והמטופויאטיים, CD34 ו- CD45. ניתוח של אוכלוסיית CD105+ מראה כי רק חלק קטן מהתאים האלה מבטאים יחד CD90 (N = 5). קיצור: uMSCs = תאי גזע מזנכימליים מרקמת חבל הטבור האנושית. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שלבים קריטיים
שלב קריטי בפרוטוקול זה הוא איסוף רקמות בתנאים אספטיים, מרגע המסירה ועד לתחזוקת תרביות סטריליות, לכל משך ההתפשטות. במהלך איסוף הכבלים, חיוני שהכבל לא ייגע בשום משטח שאינו מעוקר והוא מתפתל חיצונית עם 70% אתנול לפני האיסוף בצינורות המכילים PBS בתוספת אנטיביוטיקה. חשוב להגביל את הזמן בין איסוף הכבל לעיבוד הרקמה לבידוד uMSC. במקרה שיש צורך להעביר רקמות מאתר האיסוף למעבדה, יש להקפיד על תחזוקת הרקמה במאגרים המכילים אנטיביוטיקה ולאחסן אותה על קרח.
שינויים ופתרון בעיות של השיטה
השינוי העיקרי בפרוטוקול זה כדי לגרום להתמיינות מיוגנית של uMSCs הוא ציפוי של כלים עם 0.01% קולגן מסוג 1 ו 20 מיקרוגרם / מ"ל למינין. ראינו שהתקדמות מיוגנית ב- uMSCs בנוכחות מדיום M1 משופרת כאשר גם תנאי ההדבקה מווסתים. יש לבדוק אם השימוש במטריצות מעולות אחרות, אם כי יקרות, כגון מטריגל עשוי לשפר עוד יותר את הפרוטוקול הזה. שינויים בתפוקה בין דגימות בודדות עשויים לגרום לכך שרקמות מסוימות ייצרו ספירת תאים נמוכה יותר. במקרים כאלה, ייתכן שעדיף לאסוף אורך גדול יותר של רקמת כבל >5 ס"מ. בהקשר זה, מעטים הדיווחים שהשתמשו ב-10 ס"מ של רקמת כבל כדי להגדיל את התשואה של uMSCs. רוב הדיווחים המתארים את הבידוד של uMSCs מרקמת החוט עשו שימוש באנזימים מתפרקי מטריצה חוץ-תאית לשחרור מוגבר של תאים מהסטרומה החוטית 3,5,7,8. השימוש בתרביות אקספלנט על ידי כמה מחקרים, כולל דו"ח זה, הדגים ללא הרף עלייה בכדאיות התאית והניב 6,9,10. בנוסף, היעדר הצורך לבצע מיון תאים כדי לטהר את אוכלוסיות התאים, שלעתים קרובות נכלל בטיהור uMSCs מדם טבורי, מגדיל את מספר התאים ואת שלמותם.
מגבלות השיטה
מגבלה מרכזית של השיטה היא הזמן הנדרש לביסוס מלא של קווי uMSC מדגימות רקמת כבל בודדות. בדרך כלל, נדרשים 3 שבועות כדי ליצור כל קו uMSC באמצעות פרוטוקול זה. בעקבות זאת, נדרשים שבועיים להבחנה מיוגנית מלאה. משך חקירה ממושך זה יכול להיות מסורבל בקבוצות גדולות הבוחנות את פוטנציאל ההבחנה של uMSCs ממשתתפים שונים, מתוך כוונה לקבל מידע על הסביבה התוך רחמית או לחזות פרמטרים מטבוליים של איברי צאצאים כגון הרכב הגוף. מגבלה שנייה היא ההטרוגניות בתוך מטריצת רקמת החוט, שעשויה להיות בעלת הבדלים פנוטיפיים מהותיים בין תאי uMSC השונים ואשר יכולה להיות אחראית לפוטנציאלי ההבחנה בין המקורות השונים. לדוגמה, uMSCs מה-WJ מציגים פוטנציאל אוסטאוגני נמוך יותר בהשוואה ל-uMSCs11 שמקורם ב-CL. לכן, שיטה זו אינה מתארת את ההבדלים הטמונים בין תאים שונים בתוך רקמת החוט עצמה.
משמעות השיטה ביחס לשיטות הקיימות
באמצעות פרוטוקול זה, אנו מסוגלים לקבל ספירת תאים של 1 × 104 עד 1 × 106 uMSCs מדגימות רקמת כבל בודדות. ניתן להשתמש בקווי uMSC אלה באופן אמין לבדיקות עבור לפחות 6-8 קטעים. למרות היקף השונות בפנוטיפים התאיים האופייניים לאוכלוסיות אנושיות, זמן ההכפלה הממוצע של uMSCs שנצפה בקבוצה שלנו של 15 נשים מצפון הודו היה פחות מיומיים6. ניתוח של שיעורי ההתפשטות שלהם באמצעות שילוב של 5-אתניל-2′-דאוקסיורידין (EdU) הראה כי לפחות 80% מהתאים עברו את שלב ה-S בטווח של 6 שעותו-6. בנוסף, uMSCs מרקמת כבל מציגים גם שיעורי סנסנציה נמוכים, מה שמעיד על החוסן של שיטה זו של בידוד6. בעבר השווינו את מידת האינדוקציה המיוגנית ב-uMSCs באמצעות פרוטוקול זה לזו המשמשת להשראת מיוגנטיקה בתאי גזע אנושיים ופלוריניים 6,12. מצאנו שפרוטוקול זה הוא גורם חזק יותר להבחנה מיוגנית מאשר פרוטוקולים קיימים.
חשיבות השיטה והיישומים
טיפולים תאיים ורגנרטיביים מוצלחים תלויים בכדאיות ובתפוקה התאית, ודורשים מספר רב של תאים ממעברים מוקדמים. לפיכך, שיטה זו מציעה חלופה נוחה ליישומים קליניים. פרוטוקול ההבחנה המיוגני החזק שסופק בדו"ח זה והאפיון המולקולרי המעמיק של התקדמות מיוגנית באמצעות פרוטוקול זה בעבודתנו משלימים את המאמצים לשחזר את המיוגנזה העוברית ויכולים לשמש כמודל לחיקוי הסביבה התוך רחמית ולשיקוף חילוף החומרים שלאחר הלידה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים למר אוג'ס טיקו על עזרתם בצילומים ובהפקת וידאו. אנו מכירים גם בעזרה שקיבלנו מצוות GARBH-Ini (קבוצה בין-תחומית על מחקר מתקדם ותוצאת לידה -DBT הודו), אחיות וקציני מחקר בכירים בבית החולים האזרחי גורוגראם וד"ר פאלאווי קשטרפאל לעזרה בלוגיסטיקה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים שהוענקו לסוצ'יטרה גופינאת מהמחלקה לביוטכנולוגיה, הודו (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2411 | |
| Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline) | HiMedia | A001A-50mL | |
| Anti-GAPDH antibody | Sigma Aldrich | G8795 | |
| Anti-MyHC antibody (My32) | Novus Biologicals | NBP2-50401AF647 | |
| Anti-MyoD antibody (5.8A) | Novus Biologicals | NB100-56511 | |
| Anti-Myogenin antibody (Clone F5D) | Novus Biologicals | NBP2-34616AF594 | |
| Anti-Pax7 antibody | DSHB | DSHB-C1-576 | |
| APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 559869 | |
| Collagen Type 1 | Merck | C8919 | |
| D (+) Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Dexamethasone | SIGMA | D4902 | |
| FACSCanto II or FACSAria III | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum, qualified Brazil | GIBCO | 10270106 | not to be heat-inactivated |
| FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9 | BD Biosciences | 551146 | |
| FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2 | BD Biosciences | 557153 | |
| FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59 | BD Biosciences | 557508 | |
| FITC Mouse anti-human CD34 clone 581 | BD Biosciences | 555821 | |
| FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30 | BD Biosciences | 555482 | |
| FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10 | BD Biosciences | 560840 | |
| FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 555595 | |
| FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6 | BD Biosciences | 557348 | |
| FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555786 | |
| FlowJo software | BD Biosciences | ||
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1264 | |
| Horse serum | HiMedia | RM1239 | |
| Hydrocortisone | Merck | H4001 | |
| Laminin | Merck | L2020 | |
| MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides | Hyclone | SH30568.FS | Basal medium for uMSCs |
| PE Mouse anti-human CD105 clone 266 | BD Biosciences | 560839 | |
| PE Mouse anti-human CD44 clone 515 | BD Biosciences | 550989 | |
| PE Mouse anti-human CD49E clone llA1 | BD Biosciences | 555617 | |
| PE Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555787 | |
| PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2 | BD Biosciences | 561258 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4 | HiMedia | M1866 | |
| Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | HiMedia | TCL049-100mL |
References
- Kuroda, Y., et al. Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8639-8643 (2010).
- Troyer, D. L., Weiss, M. L. Wharton's jelly-derived cells are a primitive stromal cell population. Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).
- Karahuseyinoglu, S., et al. Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: In situ and in vitro surveys. Stem Cells. 25 (2), 319-331 (2007).
- Kita, K., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Jeschke, M. G. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane. Stem Cells and Development. 19 (4), 491-502 (2010).
- Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: A source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
- Mishra, S., et al. Umbilical cord tissue is a robust source for mesenchymal stem cells with enhanced myogenic differentiation potential compared to cord blood. Scientific Reports. 10 (1), 18978 (2020).
- Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
- Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's Jelly of umbilical cord. Methods in Cell Biology. 86, 101-119 (2008).
- Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 24 (2), 462-471 (2006).
- Yoon, J. H., et al. Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly. BioMed Research International. 2013, 428726 (2013).
- Ishige, I., et al. Comparison of mesenchymal stem cells derived from arterial, venous, and Wharton's jelly explants of human umbilical cord. International Journal of Hematology. 90 (2), 261-269 (2009).
- Chal, J., et al. Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy. Nature Biotechnology. 33 (9), 962-969 (2015).
