Geração de Células-Tronco Mesenquimal do Tecido do Cordão Umbilical Humano e sua Diferenciação na Linhagem Muscular Esquelética
Summary
Descrevemos um protocolo para o isolamento das células-tronco mesenquimais do tecido do cordão umbilical humano e sua diferenciação na linhagem muscular esquelética.
Abstract
Explorar o potencial terapêutico das células-tronco mesenquimais depende da facilidade de isolamento, potência em direção à diferenciação e confiabilidade e robustez da fonte. Descrevemos aqui um protocolo stepwise para o isolamento de células-tronco mesenquimais do tecido do cordão umbilical humano (uMSCs), sua imunofenofoteca, e a propagação de tais culturas ao longo de várias passagens. Neste procedimento, a viabilidade dos MOSCs é alta porque não há digestão enzimática. Além disso, a remoção dos vasos sanguíneos, incluindo as artérias do cordão umbilical e a veia, garante que não haja contaminação de células de origem endotelial. Usando citometria de fluxo, os uMSCs no isolamento são CD45-CD34−, indicando ausência de células da linhagem hematopoiética. É importante ressaltar que eles expressam marcadores de superfície chave, CD105, CD90 e CD73. Após o estabelecimento de culturas, este artigo descreve um método eficiente para induzir a diferenciação nesses FUSÕES na linhagem muscular esquelética. Uma análise detalhada da progressão miogênica em uMSCs diferenciados revela que os uMSCs expressam Pax7, um marcador para progenitores miogênicos nos estágios iniciais de diferenciação, seguido pela expressão de MyoD e Myf5, e, finalmente, um marcador de diferenciação terminal, cadeia pesada de miosina (MyHC).
Introduction
O cordão umbilical humano foi creditado por possuir um robusto reservatório de células-tronco mesenquimais, que atualmente estão sendo exploradas para terapias regenerativas devido às suas robustas taxas de proliferação e diferenciação, propriedades imunomodulatórias e capacidade de gerar células de todas as três camadas germinativas1. O tecido do cordão umbilical consiste em múltiplos compartimentos, como o sangue do cordão umbilical, o subendotélio da veia umbilical e a geleia de Wharton (WJ), que por si só abrange três regiões indistintas – a zona perivascular, a zona intervascular e o subameamento ou o revestimento do cordão (CL)2. Embora os MSCs possam ser isolados de todas essas diferentes regiões e expressem amplamente os principais marcadores MSC, não há clareza sobre se esses compartimentos contêm a mesma população de uMSCs ou apresentam diferenças em suas potências de diferenciação3. Assim, os protocolos para o isolamento dos UMSCs requerem maior precisão em seu modo e região de isolamento, a caracterização robusta de potenciais de diferenciação e, finalmente, uma análise comparativa de diferentes compartimentos do cabo.
Nesse contexto, poucos estudos demonstraram diferenças nos potenciais proliferativos e diferenciais do UMSC entre diferentes partes do cabo. Destes, análises comparativas entre os RCSS isolados das regiões cl e WJ revelaram maior potencial de proliferação em UMSCsderivados da CL 3,4. Em um estudo separado, os UMSCs derivados do WJ tiveram melhor desempenho em ensaios de proliferação em comparação com células perivasculares (HUCPV)5. Ao examinar diferenças entre os UMSCs derivados do sangue do cordão e os UMSCs derivados do tecido do cordão desprovidos de contaminação vascular, foi relatada expressão diferencial dos principais marcadores MSC entre os dois compartimentos, bem como o aumento das taxas de proliferação nos UMSCs derivados do tecido do cordão6.
Dos diversos estudos que examinam os potenciais de diferenciação dos MICOSCs principalmente em tecidos da linhagem de mesoderm, como linhagenia, adipogênica e linhagenia, muito poucos forneceram protocolos detalhados para diferenciação miogênica e caracterização subsequente, bem como análises comparativas entre vários compartimentos de cordão. Neste contexto, desenvolvemos um robusto protocolo de diferenciação muscular e observamos que os uMSCs derivados do tecido do cordão apresentam capacidades de diferenciação miogênica superiores em comparação com o sangue do cordãoumbilical 6. Aqui, um protocolo stepwise é detalhado para o isolamento de uMSCs de todo o tecido do cordão umbilical desprovido de células associadas à vasculatura, sua caracterização e sua diferenciação na linhagem miogênica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Passos críticos
Um passo crítico neste protocolo é a coleta de tecido em condições assépticas, desde o momento da entrega até a manutenção de culturas estéreis, durante toda a duração da propagação. Durante a coleta do cabo, é essencial que o cabo não toque em nenhuma superfície não esterilizada e seja examinado externamente com 70% de etanol antes da coleta em tubos contendo PBS complementados com antibióticos. É importante limitar o tempo entre a coleta do cabo e o processamento …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Sr. Ojas Tikoo pela ajuda nas filmagens e produção de vídeo. Também reconhecemos a ajuda recebida da equipe do GARBH-Ini (Grupo Interdisciplinar de Pesquisa Avançada e Resultado de Nascimento-DBT-Índia), enfermeiros e altos oficiais de pesquisa do Gurugram Civil Hospital e do Dr. Pallavi Kshetrapal para ajudar na logística. Este trabalho foi apoiado por subvenções concedidas a Suchitra Gopinath do Departamento de Biotecnologia da Índia (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).
Materials
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2411 | |
| Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline) | HiMedia | A001A-50mL | |
| Anti-GAPDH antibody | Sigma Aldrich | G8795 | |
| Anti-MyHC antibody (My32) | Novus Biologicals | NBP2-50401AF647 | |
| Anti-MyoD antibody (5.8A) | Novus Biologicals | NB100-56511 | |
| Anti-Myogenin antibody (Clone F5D) | Novus Biologicals | NBP2-34616AF594 | |
| Anti-Pax7 antibody | DSHB | DSHB-C1-576 | |
| APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 559869 | |
| Collagen Type 1 | Merck | C8919 | |
| D (+) Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Dexamethasone | SIGMA | D4902 | |
| FACSCanto II or FACSAria III | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum, qualified Brazil | GIBCO | 10270106 | not to be heat-inactivated |
| FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9 | BD Biosciences | 551146 | |
| FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2 | BD Biosciences | 557153 | |
| FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59 | BD Biosciences | 557508 | |
| FITC Mouse anti-human CD34 clone 581 | BD Biosciences | 555821 | |
| FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30 | BD Biosciences | 555482 | |
| FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10 | BD Biosciences | 560840 | |
| FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 555595 | |
| FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6 | BD Biosciences | 557348 | |
| FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555786 | |
| FlowJo software | BD Biosciences | ||
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1264 | |
| Horse serum | HiMedia | RM1239 | |
| Hydrocortisone | Merck | H4001 | |
| Laminin | Merck | L2020 | |
| MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides | Hyclone | SH30568.FS | Basal medium for uMSCs |
| PE Mouse anti-human CD105 clone 266 | BD Biosciences | 560839 | |
| PE Mouse anti-human CD44 clone 515 | BD Biosciences | 550989 | |
| PE Mouse anti-human CD49E clone llA1 | BD Biosciences | 555617 | |
| PE Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555787 | |
| PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2 | BD Biosciences | 561258 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4 | HiMedia | M1866 | |
| Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | HiMedia | TCL049-100mL |
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