Генерация мезенхимальных стволовых клеток из ткани пуповины человека и их дифференцировка в линию скелетных мышц
Summary
Описан протокол выделения мезенхимальных стволовых клеток из ткани пуповины человека и их дифференцировки в линию скелетных мышц.
Abstract
Изучение терапевтического потенциала мезенхимальных стволовых клеток зависит от легкости изоляции, способности к дифференцировке, а также надежности и надежности источника. Мы описываем здесь поэтапный протокол выделения мезенхимальных стволовых клеток из ткани пуповины человека (uMSCs), их иммунофенотипирования и распространения таких культур в течение нескольких проходов. В этой процедуре жизнеспособность uMSC высока, потому что нет ферментативного пищеварения. Далее удаление кровеносных сосудов, включая пуповинные артерии и вену, обеспечивает отсутствие загрязнения клеток эндотелиального происхождения. Используя проточную цитометрию, uMSC при выделении получают CD45−CD34−, что указывает на отсутствие клеток в кроветворной линии. Важно отметить, что они выражают ключевые маркеры поверхности, CD105, CD90 и CD73. После создания культур в данной работе описывается эффективный метод индуцирования дифференцировки в этих умСК в линию скелетных мышц. Детальный анализ миогенной прогрессии в дифференцированных умСК показывает, что умСК экспрессируют Pax7, маркер миогенных предшественников на начальных стадиях дифференцировки, за которым следует экспрессия MyoD и Myf5, и, наконец, терминальный маркер дифференцировки, тяжелая миозиновая цепь (MyHC).
Introduction
Считается, что пуповина человека обладает надежным резервуаром мезенхимальных стволовых клеток, которые в настоящее время исследуются для регенеративной терапии из-за их надежной скорости пролиферации и дифференцировки, иммуномодулирующих свойств и способности генерировать клетки из всех трех зародышевых слоев1. Пуповинная ткань состоит из нескольких компартментов, таких как пуповинная кровь, субэндотелий пуповинной вены и желе Уортона (WJ), которое само по себе охватывает три нечеткие области – периваскулярную зону, межсосудистую зону и субамнион или подкладку пуповины (CL)2. Хотя uMSC могут быть изолированы от всех этих различных регионов и широко выражать ключевые маркеры MSC, нет ясности в отношении того, содержат ли эти отсеки одну и ту же популяцию uMSC или демонстрируют различия в их дифференциационных потенциалах3. Следовательно, протоколы изоляции умСК требуют большей точности в их режиме и области изоляции, надежной характеристики потенциалов дифференциации и, наконец, сравнительного анализа из разных отсеков шнура.
В этом контексте немногие исследования продемонстрировали различия в пролиферативных и дифференцирующих потенциалах uMSC между различными частями пуповины. Из них сравнительный анализ между uMSCs, выделенными из областей CL и WJ, выявил больший пролиферативный потенциал в uMSCs, полученных из CL 3,4. В отдельном исследовании uMSC, полученные из WJ, показали лучшие результаты в анализах пролиферации по сравнению с периваскулярными клетками (HUCPV)5. При изучении различий между uMSC, полученными из пуповинной крови, и uMSC, полученными из пуповинной ткани, лишенными сосудистого загрязнения, сообщалось о дифференциальной экспрессии ключевых маркеров MSC между двумя компартментами, а также об увеличении скорости пролиферации в uMSCs6, полученных из пуповинной ткани.
Из нескольких исследований, изучающих потенциалы дифференциации uMSCs в основном в тканях линии мезодермы, таких как остеогенные, адипогенные и хондрогенные линии, очень немногие предоставили подробные протоколы для миогенной дифференциации и последующей характеристики, а также сравнительный анализ между различными отсеками пуповины. В этом контексте мы разработали надежный протокол дифференцировки мышц и отметили, что uMSCs, полученные из пуповинной ткани, демонстрируют превосходные возможности миогенной дифференцировки по сравнению с пуповинной кровью6. Здесь подробно описан поэтапный протокол для выделения uMSC из всей ткани пуповины, лишенной клеток, связанных с сосудистой системой, их характеристики и их дифференцировки в миогенную линию.
Protocol
Representative Results
Discussion
Критические шаги
Критическим этапом в этом протоколе является сбор ткани в асептических условиях, от момента доставки до поддержания стерильных культур, в течение всего периода размножения. Во время сбора пуповины важно, чтобы шнур не касался какой-либо нестерилизованной п?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим г-на Оджаса Тику за их помощь в съемках и видеопроизводстве. Мы также признаем помощь, полученную от сотрудников GARBH-Ini (Междисциплинарная группа по перспективным исследованиям и результатам родов – DBT India), медсестер и старших научных сотрудников в гражданской больнице Gurugram и доктора Паллави Кшетрапала для помощи в логистике. Эта работа была поддержана грантами, предоставленными Сучитре Гопинатх от Департамента биотехнологии, Индия (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).
Materials
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2411 | |
| Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline) | HiMedia | A001A-50mL | |
| Anti-GAPDH antibody | Sigma Aldrich | G8795 | |
| Anti-MyHC antibody (My32) | Novus Biologicals | NBP2-50401AF647 | |
| Anti-MyoD antibody (5.8A) | Novus Biologicals | NB100-56511 | |
| Anti-Myogenin antibody (Clone F5D) | Novus Biologicals | NBP2-34616AF594 | |
| Anti-Pax7 antibody | DSHB | DSHB-C1-576 | |
| APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 559869 | |
| Collagen Type 1 | Merck | C8919 | |
| D (+) Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Dexamethasone | SIGMA | D4902 | |
| FACSCanto II or FACSAria III | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum, qualified Brazil | GIBCO | 10270106 | not to be heat-inactivated |
| FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9 | BD Biosciences | 551146 | |
| FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2 | BD Biosciences | 557153 | |
| FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59 | BD Biosciences | 557508 | |
| FITC Mouse anti-human CD34 clone 581 | BD Biosciences | 555821 | |
| FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30 | BD Biosciences | 555482 | |
| FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10 | BD Biosciences | 560840 | |
| FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 555595 | |
| FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6 | BD Biosciences | 557348 | |
| FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555786 | |
| FlowJo software | BD Biosciences | ||
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1264 | |
| Horse serum | HiMedia | RM1239 | |
| Hydrocortisone | Merck | H4001 | |
| Laminin | Merck | L2020 | |
| MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides | Hyclone | SH30568.FS | Basal medium for uMSCs |
| PE Mouse anti-human CD105 clone 266 | BD Biosciences | 560839 | |
| PE Mouse anti-human CD44 clone 515 | BD Biosciences | 550989 | |
| PE Mouse anti-human CD49E clone llA1 | BD Biosciences | 555617 | |
| PE Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555787 | |
| PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2 | BD Biosciences | 561258 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4 | HiMedia | M1866 | |
| Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | HiMedia | TCL049-100mL |
References
- Kuroda, Y., et al. Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8639-8643 (2010).
- Troyer, D. L., Weiss, M. L. Wharton’s jelly-derived cells are a primitive stromal cell population. Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).
- Karahuseyinoglu, S., et al. Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: In situ and in vitro surveys. Stem Cells. 25 (2), 319-331 (2007).
- Kita, K., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Jeschke, M. G. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane. Stem Cells and Development. 19 (4), 491-502 (2010).
- Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: A source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
- Mishra, S., et al. Umbilical cord tissue is a robust source for mesenchymal stem cells with enhanced myogenic differentiation potential compared to cord blood. Scientific Reports. 10 (1), 18978 (2020).
- Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
- Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton’s Jelly of umbilical cord. Methods in Cell Biology. 86, 101-119 (2008).
- Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 24 (2), 462-471 (2006).
- Yoon, J. H., et al. Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton’s jelly. BioMed Research International. 2013, 428726 (2013).
- Ishige, I., et al. Comparison of mesenchymal stem cells derived from arterial, venous, and Wharton’s jelly explants of human umbilical cord. International Journal of Hematology. 90 (2), 261-269 (2009).
- Chal, J., et al. Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy. Nature Biotechnology. 33 (9), 962-969 (2015).
